Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em Xenopus laevis Cones de Crescimento
7 de setembro de 2014
A, pacote de código aberto baseado em software MATLAB, plusTipTracker, pode ser usado para análise de séries de imagem + TIPs marcados com fluorescência para quantificar dinâmica dos microtúbulos.
O objetivo deste procedimento é obter informações quantitativas sobre microtúbulos mais proteína de rastreamento final ou mais dinâmica de ponta e cones de crescimento vivo usando o pacote de software mais rastreador de ponta. Aqui, descrevemos as etapas para analisar imagens da dinâmica EB one GFP e cones de crescimento XUS lavis cultivados, mas um protocolo semelhante pode ser usado para outros tipos de células após a aquisição de imagens vivas de alta resolução de cones de crescimento embrionário EB one e cultivados. O primeiro passo no procedimento é usar o comando plus tip, obter rastros para detectar os cometas EB one GFP, vincular os cometas em rastros e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos.
O segundo passo é usar o comando mais os rastros da ponta C para visualizar os rastros de microtúbulos sobrepostos às imagens do cone de crescimento. A etapa final é usar a análise de grupo de dicas positivas para analisar e comparar os parâmetros de rastreamento de microtúbulos de grupos de filmes. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de rastreamento manual para analisar faixas individuais e de pontas, é que esse método permite detecção, rastreamento, visualização e análise rápidos e automatizados.
O primeiro passo na análise de imagens é detectar os cometas EB one GFP, ligar os cometas em trilhas e determinar os parâmetros da dinâmica dos microtúbulos. Isso é obtido com o comando mais dica. Obtenha faixas antes da análise da imagem.
Converta cada filme de lapso de tempo em uma sequência de arquivos de imagem TIFF e salve cada série em sua própria pasta chamada imagens. Observe que as imagens diferenciam maiúsculas de minúsculas. Para iniciar a análise, abra o aplicativo MATLAB e digite mais dicas para obter faixas na janela de comando.
Isso fará com que uma nova caixa de diálogo apareça. Clique em, configure novos projetos e selecione uma ou mais das séries de imagens TIFF anteriores selecionando a pasta de imagens apropriada. Após a conclusão desta etapa, um diretório de arquivos será criado.
Clique em, ok. Depois que a primeira imagem for exibida, use o mouse para clicar e criar um polígono. Em seguida, engloba a totalidade do cone de crescimento.
Clique duas vezes com o mouse para fechar o polígono. Uma caixa de diálogo aparecerá se a imagem tiver outro cone de crescimento. Para analisar, selecione sim.
Caso contrário, selecione não. O próximo passo é selecionar os projetos que serão analisados imediatamente. Clique em selecionar projetos e selecione a pasta.
Para analisar uma lista, selecione tela pegajosa aparecerá. Selecione os projetos no lado esquerdo da tela e mova-os para o lado direito. Clique em, ok.
Escolha um local para salvar a lista de projetos e clique em salvar, selecione detecção, rastreamento e pós-processamento. Uma vez feitas essas seleções, o lado direito da caixa de diálogo se tornará configurável. Preencha as configurações de pós-processamento.
Dependendo das configurações específicas de aquisição de imagem desejadas, clique em iniciar. O software executará as etapas inseridas. A janela de comando exibe o tempo restante estimado para cada função e indicará quando a etapa terminar de ser executada.
Agora que os microrastros tubiais foram definidos, a função mais os trilhos da ponta C é usada para visualização dos rastros e para exibir os microrastros tubiais sobrepostos às imagens do cone de crescimento. Isso é obtido com o comando mais o tipo de faixas de dica C mais o tipo de faixa de ponta C na janela de comando. Depois que a caixa de diálogo carregar, clique em selecionar projeto.
Selecione o diretório pai que contém o projeto a ser visualizado e clique em selecionar pasta. Assim que a janela aparecer, escolha o arquivo a ser visualizado e clique em. Ok, em seguida, clique em selecionar ROI salvo, navegue até a mesma pasta da região de interesse selecionada na etapa anterior e selecione o arquivo chamado R-O-I-Y-X.
Clique em selecionar diretório de saída para designar onde o MATLAB salvará os arquivos de visualização de trilha e selecione fazer filme de faixa. Uma tela aparecerá exibindo todas as faixas. Dica adicional, obtenha faixas calculadas a partir dos comentários da dica positiva.
A etapa salva a série temporal de faixa em um formato de filme. A função final é usada para criar grupos de filmes para análise e comparação dos parâmetros da micro tubial. Isso é obtido com o comando mais a análise do grupo de dicas.
Uma vez que as faixas de obtenção de dicas foram executadas para vários filmes e diferentes subconjuntos de dados estão prontos para comparação. Digite mais análise de grupo de dicas na janela de comando Para selecionar manualmente os grupos a serem comparados, primeiro desmarque o grupo automático da hierarquia. Em seguida, clique em selecionar projetos.
Navegue até os diretórios pai que contêm todas as pastas ROI. Para analisar uma lista, selecione A janela GUI aparecerá. Selecione todos os projetos a serem incluídos nos grupos do lado esquerdo da tela e mova-os para o lado direito.
Clique em, ok. Em seguida, escolha um local para salvar a lista de projetos e clique em salvar uma janela aparecerá. Clique em.
Ok, e a janela pegajosa de seleção de lista será exibida. Novamente, selecione apenas os arquivos que correspondem ao primeiro grupo que deve ser reunido e clique em. Okey. Digite o nome do grupo e clique em, ok.
Uma janela aparecerá, responda de acordo e continue selecionando grupos. Em seguida, escolha um local para salvar a lista de grupos e clique em salvar. Clique em selecionar diretório de saída para escolher onde as pastas de saída serão armazenadas.
Por fim, selecione o tipo de análise de grupo a ser conduzida. Aqui, selecionamos dados de pool de todas as células e grupos. Clique em comparar grupos.
Esta imagem exibe os parâmetros da dinâmica microtubial obtidos a partir da função mais as trilhas git da ponta. Este filme demonstra as trilhas de microtúbulos obtidas a partir da função mais as trilhas da ponta C. Finalmente, esta imagem mostra os parâmetros dos microtúbulos obtidos a partir da análise da função mais o grupo de pontas.
Usando um aplicativo de planilha. Esses parâmetros adquiridos de diferentes grupos de filmes também podem ser examinados como gráficos de caixa usando um programa de processamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como usar o rastreador de ponta plus para obter informações quantitativas sobre a dinâmica do microtúbulo, a ponta e os cones de crescimento vivos, utilizando as funções mais as faixas de git da ponta, as faixas da ponta C e a análise de grupo da ponta plus.
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Visão Geral
Este artigo descreve o uso do pacote de software baseado no MATLAB, plusTipTracker, para analisar a dinâmica de microtúbulos por meio de +TIPs marcados com fluorescência. O procedimento fornece uma abordagem sistemática para quantificar o comportamento de proteínas de rastreamento da extremidade positiva de microtúbulos em cones de crescimento vivos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Dinâmica dos Microtúbulos
Contexto
- Os microtúbulos desempenham um papel crucial na estrutura e função celulares.
- As +TIPs são proteínas que se associam às extremidades em crescimento dos microtúbulos.
- A análise quantitativa da dinâmica das +TIPs é essencial para compreender os processos celulares.
- Os métodos existentes para rastrear microtúbulos podem ser demorados e menos eficientes.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para analisar a dinâmica dos microtúbulos utilizando o plusTipTracker.
- Aprimorar a compreensão do comportamento dos +TIPs em células vivas.
- Demonstrar as vantagens do rastreamento automatizado em comparação com métodos manuais.
Métodos Utilizados
- Utilização do comando plusTip, get tracks para detectar cometas EB1-GFP.
- Conexão de cometas em trajetórias para determinar parâmetros de dinâmica dos microtúbulos.
- Visualização das trajetórias de microtúbulos usando o comando plusTip C tracks.
- Análise em grupo dos parâmetros das trajetórias de microtúbulos em múltiplos vídeos.
Resultados Principais
- A detecção e o rastreamento automatizados da dinâmica dos microtúbulos foram alcançados.
- Técnicas de visualização proporcionaram insights claros sobre o comportamento dos microtúbulos.
- A análise por grupos permitiu estudos comparativos entre diferentes condições.
- O método mostrou-se mais rápido e eficiente do que os métodos tradicionais de rastreamento.
Conclusões
- O plusTipTracker é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica dos microtúbulos.
- A abordagem automatizada aumenta a precisão e a eficiência da análise.
- Este protocolo pode ser adaptado para diversos tipos celulares e condições.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da dinâmica dos microtúbulos em cones de crescimento neurais fornece subsídios mecanicistas sobre o direcionamento axonal e a formação sináptica, processos relevantes para modelos de transtornos neurodesenvolvimentais. A análise automatizada das trajetórias dos cometas +TIP permite triagem de alto conteúdo de compostos que afetam a regulação do citoesqueleto, apoiando a validação de alvos em pipelines de descoberta em neurociência. A abordagem reduz o viés analítico e aumenta a produtividade em comparação com o rastreamento manual, melhorando a confiança preditiva em estudos iniciais de engajamento de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da dinâmica de polimerização de microtúbulos como leitura funcional de alvos que regulam o crescimento ou a estabilidade axonal.
- Valor Operacional: Fornece parâmetros padronizados e quantitativos (velocidade de crescimento, frequência de pausas, taxa de catástrofe) para avaliação consistente do fenótipo de alvos em bibliotecas de compostos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras reprodutíveis e multiparamétricas do comportamento dos microtúbulos, adequadas para miniaturização e automação de ensaios em formatos de 96 e 384 poços.
- Valor Operacional: Facilita a padronização de ensaios entre laboratórios ao definir claramente a seleção de regiões de interesse, parâmetros de rastreamento e limiares de análise de grupos.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Relaciona fenótipos de dinâmica de microtúbulos in vitro a mecanismos relevantes para doenças em modelos neurodesenvolvimentais ou neurodegenerativos.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade desde culturas neuronais primárias até validação em fatias organotípicas ou in vivo, por meio de uma metodologia conservada de rastreamento de +TIP.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial da descoberta, na qual fenótipos quantitativos do citoesqueleto orientam a seleção de alvos antes da identificação de compostos líderes e dos testes pré-clínicos de eficácia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos de quinases, fosfatases ou proteínas associadas a microtúbulos por meio da medição direta da dinâmica de cometas +TIP em cones de crescimento vivos.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e prontas para ensaio (densidade de cometas, comprimento de trajetórias, distribuições de velocidade) que permitem o cálculo do fator Z' e a confirmação de hits.
- Análises: Oferece comparações estatísticas em nível de grupo (média, variância, desvios na distribuição), essenciais para avaliar os efeitos de compostos em réplicas biológicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos do citoesqueleto a ensaios de alongamento de axônios ou formação de sinapses, alinhando-se com desfechos funcionais pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma estrutura analítica centralizada baseada em MATLAB, aplicável a diversos tipos celulares (neurônios, fibroblastos, linhagens de câncer) que expressam +TIPs fluorescentes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a variabilidade inerente ao rastreamento manual e permitir a detecção de mudanças dinâmicas sutis.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da detecção automatizada de cometas, algoritmos padronizados de rastreamento e processamento em lote de séries de imagens com lapso de tempo.
- Valor Estratégico: Aprimora a eficiência das decisões de avançar ou não ao fornecer perfis multiparamétricos do citoesqueleto mais cedo na linha do tempo da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na gravidade quantitativa do fenótipo de microtúbulos e na magnitude do resgate induzido por compostos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de células vivas, ambiente MATLAB e marcação com proteínas fluorescentes (por exemplo, EB1-GFP) em culturas primárias de neurônios.
- Depende de sistemas de aquisição com lapso de tempo de alta resolução e baixa fototoxicidade, capazes de capturar a dinâmica de cometas +TIP em intervalos de 1–2 segundos.
- Necessita padronização entre equipes quanto à definição da região de interesse (perímetro do cone de crescimento), parâmetros de rastreamento (distância de ligação, intervalo entre quadros) e filtros de pós-processamento.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes morfologias celulares (por exemplo, cones de crescimento versus hastes axonais) e níveis de expressão de +TIP entre diferentes sistemas modelo.
- Limitado pela necessidade de cometas +TIP detectáveis e persistentes; pode não se aplicar a condições com eventos de polimerização de microtúbulos altamente instáveis ou escassos.
