Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

O objetivo geral do experimento a seguir é construir vetores de direcionamento de genes usando subclonagem mais inserção. Isso é conseguido transformando o dorso contendo e coli com um plasmídeo recombinante. A segunda etapa envolve a geração de de inserção fosforolada assimétrica e a subclonagem de plasmídeos por reação em cadeia da polimerase.

Após a adição de arabinose, as proteínas recombinantes GBAA são expressas e o de inserção modificado terminal e o plasmídeo de subclonagem são eletroporados. A sequência de DNA desejada é simultaneamente cativa do verso e modificada com o de inserção no plasmídeo de subclonagem. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a recombinação padrão, é que a construção do vetor de direcionamento de genes pode ser realizada em uma única reação.

Para começar a projetar oligos para o de inserção e o plasmídeo de subclonagem, projete cada oligo de modo que contenha 180 braços de homologia de pares de bases flanqueando o local alvo genômico e 20 pares de bases, uma sequência de preparação específica para o de inserção ou plasmídeo de subclonagem. Em seguida, determine a orientação da inserção de DNA genômico do clone traseiro usando uma ferramenta baseada na web como o clone db. Estabeleça a direção da replicação de ou ES verificando o mapa do backbone do plasmídeo traseiro usado no dorso.

Construção da biblioteca, adicione duas ligações terminais de fosfo oito, de modo que as cinco extremidades primas do oligo que são opostas à direção de replicação no clone traseiro. Em seguida, adicione uma modificação de fosfato de cinco primos ao oligo reverso. Primeiro, coloque uma ponta de pipeta estéril na cultura de ágar traseiro e inocule 5,0 mililitros de caldo de odino.

Cultive a cultura a 37 graus Celsius por cinco horas com agitação a 200 RPM. Em seguida, resfrie, solução de glicerol a 10%, microcentrífuga, tubos e eletroporação, cubetas no refrigerador de gelo, centrífuga grande refrigerada e microcentrífuga a quatro graus Celsius. Após a incubação, determinar a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro.

Medindo a absorbância. A 600 nanômetros. Prepare as células eletrocompetentes quando uma leitura OD 600 de 0.3 a 0.8 for atingida

Quando a cultura estiver pronta, gire as células em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lave as células com um mililitro de glicerol a 10% resfriado e gire novamente. Execute essas etapas de lavagem um total de três vezes.

Ressuspenda as células em um volume total de 50 microlitros e adicione 10 a 200 nanogramas do plasmídeo recombinante. Obtenha uma suspensão de célula única pipetando para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, transfira as células para uma eletroporação pré-resfriamento. Vete. Em seguida, coloque o vete em um dispositivo de eletroporação e eletro-opere as células imediatamente, recupere as células em um mililitro de LB e transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Cultive a cultura de volta a 30 graus Celsius por duas horas com agitação a 200 RPM. Após este tempo, adicione nove mililitros de LB à cultura recuperada. Cresça durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM para incorporar os braços de homologia no de inserção e no plasmídeo de clonagem subc.

Realize a PCR usando os oligos longos modificados preparados anteriormente. Alternativamente, linearize o modelo de plasmídeo Usando uma enzima de restrição, escolha uma que corte fora da região de amplificação de PCR e seja ativada pelo calor. Configure o PCR usando um sistema de DNA polimerase de partida a quente de alta fidelidade.

Prepare uma mistura mestre de PCR e execute ciclos térmicos de acordo com as melhores práticas. Após a reação, analise os produtos de PCR por eletroforese em gel AROS. Carregue de um a cinco microlitros de cada PCR em um gel 1%aros.

Em seguida, purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR. Quantifique o DNA amplificado por PCR em relação a um conjunto conhecido de padrões de DNA ou usando um espectrofotômetro NanoDrop. Após uma incubação durante a noite, dilua a cultura GBAA de volta 50 vezes e prepare uma cultura separada para um controle negativo.

Cultive as culturas diluídas a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por uma hora e 50 minutos. Em seguida, resfrie todos os materiais e equipamentos recombinados a quatro graus Celsius, conforme demonstrado anteriormente. Prepare uma solução de OSE a 10% de peso por volume e esterilize por filtro através de um filtro de seringa de 0,2 mícron.

Quando a DO da cultura de costas atingir o nível desejado, prossiga com a indução das proteínas recombinantes. Adicione 200 microlitros da solução árabe a 10% a 10 mililitros da cultura de costas para obter uma concentração final de AOSE de 0,2% Inclua uma cultura não induzida para ser usada como controle negativo. Transferir as culturas para uma incubadora com agitação a 37 graus Celsius e induzir a expressão vermelha durante 45 minutos com agitação a 230 RPM.

Gire as células e lave com 10% de glicerol três vezes, como mostrado anteriormente em 600 a 1000 nanogramas. Cada um dos de inserção e o plasmídeo de subclonagem para a reação de recombinação incluem um controle de inserção única de vetor e vetor mais um para verificar a proficiência e integridade de recombinação do vetor. Em seguida, obtenha uma única suspensão de célula e eletro-opere as células conforme mostrado anteriormente.

Permita a recuperação em mídia LB a 37 graus Celsius por uma hora para plasmídeos multicópia ou em 10 lb a 37 graus Celsius por três horas para vetores traseiros. Completar diferentes diluições com a cultura recuperada em dupla seleção. Ágar, por favor, e cresça a 37 graus Celsius por 16 horas.

Quando estiver pronto, escolha as colônias em cinco mililitros de LB contendo o antibiótico seletivo e cresça durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, use um kit de purificação de coluna para preparar o mini DNA de preparação, introduza a enzima de restrição apropriada e, em seguida, identifique os clones contendo os tamanhos de fragmentos esperados por eletroforese em gel. Finalmente, execute o sequenciamento de DNA nos braços de homologia e no de inserção para verificar se há erros de fotossíntese de oli.

Neste exemplo, a análise de digestão de restrição de P dois RX uma inserção EYFP contendo clones mostrou o padrão esperado indicando que eles contêm o vetor knockin montado corretamente. Este esquema ilustra o conceito de corte de bloco. O uso de subclonagem e análise de inserção de produtos de PCR confirmou que os foram incorporados corretamente.

Além disso, quando os clones positivos foram analisados após a adição da enzima de restrição apropriada, o padrão esperado foi obtido. A análise de digestão de restrição de 12 clones de R SR dois SBI mostrou montagem correta do vetor na maioria dos recombinantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir vetores de direcionamento de genes rapidamente usando subclonagem e inserção.