Name: Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a construir vetores de segmentação gênica usando o método SPI em E. coli. Esta técnica de recombinação permite a geração rápida de vetores personalizados em uma única reação, aumentando a eficiência da engenharia genética.

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T.R.R concebeu o projeto, projetou e realizou experimentos e preparou o manuscrito. E.J.K e S.E.M realizaram experimentos. Todos os autores contribuíram intelectualmente para o manuscrito final. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de inovação da Universidade de Leicester para SEM e por uma bolsa de pesquisa sênior do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (MRC) para SMC (MR / J009202 / 1). O sequenciamento de DNA foi realizado pelos Laboratórios de Proteínas e Ácidos Nucleicos (PNACL), Centro de Serviços de Biotecnologia Básica, Universidade de Leicester. Gostaríamos de agradecer a A. Francis Stewart por fornecer os plasmídeos Rox e Dre. Os plasmídeos pL451 e pL452 foram obtidos do National Cancer Institute (NCI), Frederick, EUA.

1. Gene Segmentação projeto <ol style="margin-left: 40px;"><li> Encomendar um clone BAC adequado que cobre a região genômica de interesse. Certifique-se de que este é isogênico com o tipo de células ES de ser modificado por exemplo, clones RPCI-23 e RPCI-24 BAC para gene alvo com C57BL / 6 ES células. </li><li> Aplicar gene convencional critérios de segmentação ao projetar o vetor de direcionamento. Parâmetros-chave incluem se a modificação é necessária para ser constitutiva ou condicional, definindo exons críticos (CE) para eliminação de uma estratégia gene nocaute e espaçamento e colocação de cassetes intrónicas. NOTA: Cada uma delas tem sido discutida em detalhe em outro lugar 10. </li><li> Escolha regiões genómicas cada 5-6 kb de flanqueamento do local de modificação alvo. NOTA: O tamanho da inserção é, portanto, tipicamente subclonado 10-12 kb, embora o limite superior possa ser tão alta como 80 kb com uma cópia do plasmídeo de subclonagem baixo como p15A, pBR322, etc., e até 200 kb, com um BACvetor. </li></ol> 2. Multiplex recombineering Oligos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oligos do projeto para a espinha dorsal plasmídeo (subcloning plasmídeo) e o marcador de selecção (cassete de inserção). Conceber cada oligo de tal modo que ele contém 180 pb HA flanqueando o local alvo genómico e 20 pb da sequência de iniciação específica da cassete de inserção ou o plasmídeo de subclonagem (Figura 2). NOTA: os braços de homologia não deve conter elementos repetitivos, presença de elementos repetitivos resultará em direcionamento incorreto e subclonagem. Elementos repetitivos pode ser detectada por meio de ferramentas baseadas na web, como o &#39;&#39; Repita Masker &#39;&#39;. </li><li> Incluir um local único da enzima de restrição (RE) em um dos oligos de vectores para linearizar o vector de abordagem selectiva de genes para células ES alvo (Figura 2). </li><li> Verifique os parâmetros oligo usando um programa analisador de oligo. Tome cuidado para evitar estruturas secundárias na região primings. </li><li> Shorter HA (50 pb) da cassete de inserção é tolerado e produz menor número de recombinantes, mas garantir que o plasmídeo subcloning HA é sempre mais longo (180 pb). </li><li> Determinar a orientação da inserção de ADN genómico do clone de BAC em particular usando ferramentas com base na web, como &#39;&#39; cloneDB &#39;&#39;. Estabelecer a direcção de replicação de oris, verificando o mapa do esqueleto de plasmídeo BAC usado na construção da biblioteca BAC. NOTA: oris é geralmente oposta à direcção de transcrição do marcador de cloranfenicol (Chl) para todos os plasmídeos de TAS vulgarmente utilizados. </li><li> Adicionar duas fosforotioato (PTO) ligações terminais com a extremidade 5 &#39;do oligonucleótido que é oposta à direcção de replicação no clone de BAC. Adicionar uma modificação 5 &#39;fosfato para o oligo inverso (Figura 2). NOTA: A cassete PCR phosphorothioated assimétrica sobre a digestão Red gera um ssDNA intermediário que pode iniciar a cadeia atrasadado garfo de replicação. NOTA: Maximal freqüência de recombinação multiplex é observado com as cassetes protegidas cadeia atrasada. Costa principal protegido ou cassetes protegidas dupla pode não produzir a eficiência de recombinação equivalentes em algum loci. </li><li> Encomende oligos com PAGE ou purificação HPLC. </li></ol> 3. BAC Transformation Clone com pSC101 BADgbaA recombineering plasmídeo. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para fazer com que a E. estirpe de E. coli que carrega o recombineering BAC proficiente, transformá-lo com o plasmídeo pSC101 BADgbaA contendo os genes vermelhas 16. NOTA: O plasmídeo pSC101 BADgbaA contém os genes vermelhos e RecA sob o controlo do promotor araC de P-arabinose BAD indutivel, um marcador de selecção de tetraciclina e o replicão pSC101 sensível à temperatura. <ol><li> Esfaquear uma ponteira estéril na cultura agar BAC e inocular 5,0 ml de caldo lysogeny (LB) pH 8,0 contendo 12,556; g ml -1 Chl. Crescer a 37 ° C durante 5 horas com agitação a 200 rpm. </li><li> Relaxar 10% (v / v) de glicerol, tubos de microcentrífuga e cuvetes de electroporação em gelo. Arrefece-se uma grande centrifugadora de microcentrífuga e refrigerado a 4 ° C. </li><li> Determinar a densidade óptica (OD) da cultura utilizando um espectrofotómetro e medir a absorvância a 600 nm. Preparar células electrocompetentes (como descrito abaixo) quando uma leitura de DO 600 de 0,3 a 0,8 é alcançado. </li><li> Girar as células num tubo de centrífuga de 50 ml em uma grande centrifugadora a 1216 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células com 1 ml de glicerol a 10% gelada e girar para baixo em células 17.949 xg durante 20 seg a 4 ° C. Realizar a lavagem passo de um total de 3 vezes. </li><li> Ressuspender as células num volume total de 50 ul de glicerol a 10% e adicionar 10-200 ng do plasmídeo pSC101 recombineering BADgbaA. Obter uma suspensão de células individuais pipetandopara cima e para baixo várias vezes e, em seguida, transferir as células para uma pré-refrigerada um milímetro lacuna cuvete de electroporação. </li><li> Electroporate as células com uma configuração de 1,8 kV, 25 mF e 200 Ω. Nota: Verifique as configurações corretas para cada marca de electroporator. Uma constante de tempo de electroporação menos do que 4 indica a presença de sal e outras impurezas. </li><li> Imediatamente recuperar as células em 1 ml de LB e transferência das células para um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Crescer a cultura BAC gbaA a 30 ° C durante 2 horas com agitação a 200 rpm. NOTA: O plasmídeo pSC101 BADgbaA é perdido quando as células são cultivadas a 37 ° C, devido à inactivação do factor de replicação sensível à temperatura repe. Cultivar células gbaA a 30 ° C, para manter as funções recombineering. </li><li> Adicionar 9 ml de LB contendo 12,5 ng ml -1 de Chl e 4 ug mL1 de tetraciclina (Tet) para a cultura de BAC gbaA recuperado. Cresça aBAC gbaA cultura O / N em 30 &#160; ° C com agitação a 200 rpm. NOTA: A eficiência de transformação do plasmídeo electroporating gbaA super-enrolado é suficientemente alta para permitir o crescimento saturação de O / N em meios líquidos. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de Inserção Cassetes e Subclonagem Plasmids <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para incorporar AH à inserção da cassete (s) e o plasmídeo de subclonagem, realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os oligos longo modificados tal como descrito abaixo. <ol><li> Opcional: para evitar plasmídeo transição na reacção recombineering, usar uma origem R6K ou molde estreito plasmídeo gama de hospedeiros semelhante para amplificar a cassete de inserção. </li><li> Alternativamente, linearizar o plasmídeo molde utilizando uma digest RE (Tabela 2). Escolha um RE que corta fora da região de amplificação da PCR e é inativada calor. Calor inactivar o RE, como recomendado pelo manufacturer. </li><li> Defina-se reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando um sistema de DNA polimerase de alta fidelidade HotStart. Prepara-se uma mistura principal de PCR como descrito (Tabela 3). Realizar o ciclo térmico, como mostrado (Tabela 3). </li></ol></li><li> Analisar os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose. Carga de 1-5 uL de cada PCR sobre um 1% (w / v) de gel de agarose contendo 0,5 mg mL-1 de brometo de etídio (EtBr). NOTA: A presença de produtos de amplificação não-específicos não interfere na reação recombineering. Em alguns casos, no entanto, dimeros de iniciadores pode diminuir a eficiência recombineering. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR utilizando um kit de purificação de PCR. <ol><li> Opcional: remover o plasmídeo molde de PCR por tratamento com Dpnl seguido por PCR clean-up. Eluir ADN num volume mínimo de água desionizada estéril (como recomendado pelo fabricante). NOTA: A adição de DpnI para não purificados de PCR reações resulta em redução da eficiência de clivagem de the modelo do DNA de plasmídeo desnaturado. </li></ol></li><li> Quantificar por PCR de ADN amplificado por análise em gel de agarose de encontro a um conjunto de padrões de ADN conhecidos por exemplo, λ HindIII digest ou usando um espectrofotómetro NanoDrop. </li></ol> 5. Além disso Subclonagem Inserção <ol style="margin-left: 40px;"><li> Dilui-se a S / N BAC gbaA cultura de 50 vezes por adição de 200 ul em 10 ml de LB + + Chl Tet. Crescer em 30 &#160; ° C com agitação a 200 rpm durante 1 h 50 min. Incluir uma amostra a ser utilizada como controlo negativo. </li><li> Relaxar todos os materiais e equipamentos recombineering a 4 ° C, conforme descrito no passo 3.1.2. </li><li> Pour LB agar pH 8 placas contendo a concentração correcta de o antibiótico selectivo apropriado (s), que irá permitir a selecção do fragmento de ADN que é inserida, assim como para a selecção do vector de subclonagem (Tabela 4). NOTA: Alguns antibióticos são sensíveis ao pH. Use LBágar pH 8 como uma regra. </li><li> Prepara-se uma solução a 10% de L-arabinose (v w /). Filtre através de esterilizar um filtro de seringa de 0,2 um. NOTA: A arabinose induz a expressão de proteínas a partir do plasmídeo recombineering gbaA. </li><li> Verifique o OD da cultura BAC gbaA usando um espectrofotômetro. Uma vez que um OD 600 de 0,25-0,3 é atingido, induzir as proteínas recombineering como descrito no passo seguinte. </li><li> Adicionar 200 ul da solução de arabinose a 10% até 10 ml de cultura de BAC para atingir uma concentração final de arabinose de 0,2%. Incluir uma cultura não induzida (sem arabinose) a ser utilizada como controlo negativo. </li><li> Transferir a cultura para um BAC 37 &#160; ° C incubadora de agitação e induzir a expressão vermelho por 45 min com agitação a 230 rpm. NOTA: Expressão de proteínas vermelhos é ineficiente a 30 ° C. </li><li> Girar as células e lava-se com 10% de glicerol, 3 vezes, conforme descrito no passo 3.1.5. </li><li> Adicionar 600-1,000 ng de cada um do plasmídeo de subclonagem e a cassete (s) de inserção para a reacção recombineering. Incluir um vector apenas e vector além de controles individuais de inserção para verificar a proficiência recombinação e integridade do vector e as cassetes. </li><li> Obter uma suspensão de células individuais por pipetagem cima e para baixo. Realizar a electroporação tal como descrito no passo 3.1.7 e recuperação subsequente em 1 ml de LB a 37 ° C durante 1 h para os plasmídeos de multi-cópias ou em 10 ml de LB a 37 ° C durante 3 h para os vectores BAC. </li><li> Placa de diferentes diluições da cultura recuperado por exemplo, 90%, 10%, 1%, nas placas de agar de selecção dupla e crescer a 37 &#160; ° C durante 16 horas. </li></ol> 6. Análise de recombinantes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Opcional: Escolha de 6 a 12 colônias e realizar colônia PCR utilizando um iniciador de flanqueamento HA e um primer específico de inserção. Inclua o plasmídeo subcloning eo cas inserçãoSette plasmídeo assim como o clone de BAC-mãe como controlos negativos. <ol><li> Realizar análise em gel de agarose das PCRs colônia. Identificar os clones positivos pela presença de uma banda brilhante com o tamanho esperado. NOTA: A elevada eficiência do processo de clonagem recombinantes SPI gera principalmente correctas. </li></ol></li><li> Escolha colónias em 5 ml de LB pH 8 contendo o antibiótico selectivo e crescer O / N a 37 ° C. </li><li> Preparar mini-preparações de ADN utilizando um kit de purificação de coluna de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Prepare BAC ADN miniprep usando isolamento de fenol-clorofórmio padrão ou um protocolo semelhante. </li><li> Execute digere RE no DNA miniprep. DNA separado por eletroforese em gel de agarose. Analisar os padrões de ER para identificar os clones contendo os tamanhos de fragmentos esperados do vector direcionamento correto. Escolha um RE claramente que discrimina entre o vector sem inserto (s) e o vector contendo o inserto (s). </li><li> Optional: a obtenção de células que são desprovidas do BAC, que ainda está presente na E. coli após recombineering, usar o plasmídeo miniprep de ADN para transformar DH5alpha ou DH10B E. células de E. coli. </li><li> Execute sequenciamento de DNA em todo o HA e cassete de inserção para verificar erros de síntese oligo. </li></ol>

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</ol>

T.R.R é o inventor de um pedido de patente britânico sobre a tecnologia de recombinação multiplex.

Construção de linhas de células ES e modelos de mouse tem historicamente envolvidos gene alvo usando construções de plasmídeos que continham o alelo 4 modificado. No entanto, a construção destes vectores de direccionamento de genes complexos provou ser um gargalo significativo na produção tempo de tais modelos. O desenvolvimento de estratégias de construção vector recombineering baseado permitiu melhores desenhos vetoriais e montagem do vetor mais eficiente. No entanto, os protocolos recombineering atuais ainda envolvem várias etapas, exigem intermediário de purificação de plasmídeos e usar diferentes estirpes bacterianas. A sub-clonagem de inserção mais oferece uma nova abordagem para a construção do vector que pode ser realizada em um evento de electroporação na estirpe hospedeira BAC residente. O utilitário de SPI em segmentação gene foi aqui testado numa variedade de aplicações de construção de vector. Em todos os casos aqui examinados, SPI mostrou-se eficiente e o plasmídeo recombinante correta foi produzido.Na maioria dos casos, as múltiplas cassetes diferentes foram correctamente inserido no vector de direccionamento. Grandes cassetes de ADN e vectores foram facilmente acomodados no protocolo SPI e demonstrou a flexibilidade do presente sistema. SPI baseia-se na utilização de sequências longas de homologia e fosforotioato (PTO) protecção das cassetes de ADN linear. Modificação PTO confere protecção contra exonucleases para o ADN linear e a longo 20,21 HA aumenta a eficiência de recombinação para permitir a multiplexação. No entanto, a síntese de sequências oligo mais longos aumenta as possibilidades de acumulação de erros especialmente deleções. Mutações no oligo pode ser particularmente prejudicial se eles cobrem regiões de proteína codificação. Sequenciamento de DNA em todo o HA e cobrindo todo o comprimento da fita inserida é altamente recomendável para eliminar clones com quaisquer alterações de sequência. Uso de um sistema de polimerase de ADN de alta fidelidade também é sugerido para evitar a introdução de umy erros de PCR. O comprimento e composição do HA do plasmídeo de subclonagem é mais crítico em relação à inserção da cassete (dados não mostrados). Para aplicações particularmente sensíveis, tais como a construção de vectores knockin, onde quaisquer mutações em regiões de exão não são tolerados, o HA da cassete de inserção pode ser reduzido (pb 50-120) para evitar problemas associados com os oligos longos. A cassete de inserção também pode ser não modificado ou deixado phosphorothioated dupla (onde o conhecimento do sentido de replicação não está disponível). Mas multiplexing, nestes casos, ainda requer longo protegido HA plasmídeos subclonagem. Uma advertência desta estratégia particular é a diminuição da eficiência de multiplexação que podem potencialmente impactar SPI clonagem em loci diferentes. O comprimento da inserção da cassete e do plasmídeo de subclonagem é um outro parâmetro importante na SPI clonagem. Moléculas de ADN maiores electroporate menos eficientemente e o efeito cumulativo é, dado o reexi- para introduzir todos os alimentadores na mesma célula (resultados não apresentados). Multiplexing é mais eficiente com cassetes de inserção menores. DNA fragmentos maiores que 3 kb também colocar um limite no processamento ssDNA Red mediada, que é mais eficiente até 3 kb 30. Cassetes de inserção superiores a 3 kb são dual ressecada e recombinar com menos eficiência através de um beta via independente 20. Portanto, a seleção de colônias suficientes para identificar o clone correto torna-se importante nestes casos. A longa duração da recombinação pós eletroporação também aumenta as chances de recuperação do clone correto em exercícios SPI difíceis. Até quatro pequenas cassetes (&lt;1,5 kb) podem ser inseridos simultaneamente com o processo de SPI, embora a eficiência de multiplexação diminui com cada cassete adicional (dados não mostrados). No entanto, isso reflete o resultado de um experimento SPI óptima e é aconselhável a considerar os limites de multiplexação ao usar muitas grandes cassetes. </p&gt; O desenvolvimento de ferramentas de edição de genoma como cluster repete palindrômicas curtas regularmente intercaladas (CRISPR) sistema endonuclease -cas9 permitiu a criação de novas modificações do genoma e tem levado a mais eficiente engenharia genoma 36. No entanto, essas tecnologias novas complementaram vectores de genes alvo em vez de suplantado eles. Prevê-se que o sistema CRISPR-cas poderia substituir seleção antibiótico e aperfeiçoar o protocolo recombineering multiplex.

O desenvolvimento de tecnologias de segmentação de genes permitiu a construção de linhas de células e modelos de ratos para investigar diferentes sistemas biológicos 1-3. A primeira etapa chave na modificação de uma sequência genômica é a concepção e construção de um gene alvo vetor 4. Vectores de recombinação são as construções de plasmídeos que transportam o alelo de interesse contendo as modificações (s) desejados flanqueadas por um marcador de selecção (por exemplo, neomicina), e regiões genómicas longos necessários para recombinação homóloga eficiente em células de mamíferos 5. Modificação gene preciso que é conseguido através da introdução do vector de direccionamento para estaminais embrionárias (ES) 6 células ou células somáticas 7, em que a recombinação homóloga entre extensões idênticas de sequência de ADN no vector de abordagem selectiva e o locus genómico resultados na transferência da modificação pretendida para a conversão do gene por genoma 8. Tal modified células ES podem ser injectados em blastocistos de ratinho para produzir prole (quimeras) que pode, em seguida, transmitir estes alelos modificados através da linha germinativa 9. Uma via alternativa para produzir ratinhos transgénicos envolve a microinjecção de um vector de expressão de genes individuais em zigotos de ratinho unicelulares, o que leva a uma integração aleatória do vector no genoma do rato 10. Os métodos tradicionais de construção do vector ter invocado convencional &quot;corta e cola&quot; clonagem usando enzimas de restrição e ligases de ADN a clonar o marcador de selecção diferente e fragmentos genómicos em uma estrutura do vector. No entanto, um factor de limitação inerente de clonagem tradicional é o posicionamento e escolha de sítios de restrição, especialmente com sequências de DNA mais longos. Isso muitas vezes requer várias etapas de subclonagem e também apresenta sequências de DNA estranhos no vector, o que muitas vezes leva a uma menor eficiência do gene alvo. Recombineering (eng recombinagênicoineering) é uma tecnologia de engenharia de ADN que ultrapassa estas limitações através da utilização de recombinação homóloga (HR) mediada por proteínas de recombinação do fago em E. coli 11,12. Uma vez que qualquer região de uma sequência homóloga pode servir como um substrato de recombineering, as restrições sobre disponibilidade de locais de restrição são removidos. Grandes sequências de DNA podem ser facilmente modificados diretamente in vivo, assim também preservar a sua integridade estrutural 13. Recombineering é muito eficiente com homologias curtas (50 pb) 14 e, portanto, braços de homologia (HA) pode ser convenientemente incorporados em sequências oligo sintéticos. Em um experimento recombineering típico, um oligo ou um DNA de cadeia (dsDNA) fragmento duplo contendo HA é electroporados em recombineering E. competente células de E. coli contendo o alvo localizados no cromossoma ou num plasmídeo de 15. O potencial de recombinação é conferido pela expressão induzida do rec Redombination proteínas do fago 16,17 ou as proteínas de RecET do profago 18 rac. A exonuclease Vermelho / RecE converte dsDNA linear a um ADN de cadeia simples (ssDNA) intermediária, que é então ligado pelo seu parceiro, Vermelho / RecT, uma proteína de cadeia simples de recozimento (SSAP) 19. O emparelhamento de um longo ssDNA ou a uma curta oligo com a sua sequência complementar alvo ocorre na costa de retardamento do garfo de replicação e conduz à incorporação da sequência no local alvo. Retardamento ADNcs recombinação é a base da alta eficiência de recombineering e pode ser descrita pela &quot;beta&quot; modelo recombinação 20,21. Um fluxo de trabalho recombineering típico para construir um vector de abordagem selectiva de genes envolve qualquer uma das duas seguintes vias. Uma via envolve a subclonagem da região genómica desejado a partir de um clone de BAC de rato dentro de um plasmídeo seguido pela inserção sequencial dos locais de recombinação LoxP, um marcador de selecção <saté&gt;, 22, etc., ou a rota alternativa envolve segmentação do local genómico BAC com os diferentes elementos do vetor segmentação por várias rodadas de recombineering 10,23 e, em seguida subclonando o locus modificado em um plasmídeo por reparação gap clonagem 24,25. Variações sobre o tema têm sido usados ​​em diferentes condutas de alto rendimento recombineering como parte de programas de produção em grande rato 26,27. No entanto, esses procedimentos envolvem etapas demoradas e complicadas, requerem o uso de vectores especializados e E. coli estirpes (por exemplo, as células que expressam Cre) e utilizar um ou mais passos intermédios de purificação de ADN de vector e re-transformação (Tabela 1). A sub-clonagem de inserção de adição (SPI) é uma técnica recombineering romance que combina beta recombinação e reparação da clonagem num único processo (Figura 1). Montagem vector SPI é simples, rápida e flexível e oferece uma melhoria significativa em recombi padrãonharia abordagens (Tabela 1). Aqui, vamos demonstrar a facilidade e utilidade de usar SPI para diferentes aplicações de construção vector com especial destaque para a construção de projetos de vetores não-padrão e desafiadoras. Os casos de teste incluiu a construção de um vector repórter batendo fluorescente, uma expressão da proteína marcada batendo vector dupla, um vector BAC fluorescente repórter e um vector de knockout condicional. Estes examinados variadamente o requisito de localizar um receptor da superfície da célula, purificar um complexo proteína nuclear ou condicionalmente ablação a expressão de um gene.

<table><tbody><tr><td>Antibióticos, exceto Zeocin</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>Ampicilina, A9518-5G; Cloranfenicol, C1919-5G; Blasticidina, 15205-25MG; Gentamicina, G1264-50MG; Higromicina, H3274-50MG; Canamicina: K1876-1G; Cloridrato de tetraciclina, T7660-5G; Trimetoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>O zeocina ant-zn-1</td><td>também está disponível nos clones Life technologies / Fisher</td></tr><tr><td>C57BL / 6 BAC</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>RPCI-23 ou RPCI-24 Bibliotecas</td><td>BAC 129/Sv Os clones de BAC podem ser obtidos a partir do sistema de DNA polimerase Invivogen ou Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD hotstart</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Oligos longos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; Ligação genética: https://www.genelink.com</td><td>ultrameros IDT ou oligos longos Gene</td><td>Link PTO e fosfato disponíveis como modificações personalizadas. Purificação PAGE fortemente recomendada para oligos longos.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR MinElute</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>Os kits de purificação PCR de eluição mínima são preferidos.</td></tr><tr><td>Kit de preparação mini QIAPrep Spin</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>Coluna de sílica ou kits de matriz semelhantes são preferidos.</td></tr><tr><td>Enzimas de restrição</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>Consulte o site do NEB para obter uma lista de RE.</td></tr></tbody></table>

subclonagem além disso inserção (spi) - um método recombineering novel para a construção rápida de gene segmentação vetores

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

O direcionamento de genes refere-se à modificação precisa de um locus genético usando recombinação homóloga. A geração de novas linhagens celulares e modelos de camundongos transgênicos usando este método requer a construção de um vetor 'direcionador', que contém sequências de DNA homólogas ao gene alvo e tem sido por muitos anos uma etapa limitante no processo. A construção do vetor pode ser realizada in vivo em células de Escherichia coli usando recombinação homóloga mediada por recombinases de fagos usando uma técnica denominada recombinação. A recombinação é a técnica preferida para subclonar as sequências de homologia longas (>4kb) e vários elementos de direcionamento, incluindo marcadores de seleção que são necessários para mediar a troca alélica eficiente entre um vetor de direcionamento e seu locus genômico cognato. Os protocolos típicos de recombinação seguem um esquema iterativo de integração gradual dos elementos de segmentação e requerem etapas intermediárias de purificação e transformação. Aqui, apresentamos uma nova metodologia de recombinação de montagem de vetores usando uma abordagem multiplex. O reparo da lacuna de plasmídeo é realizado pela captura simultânea da sequência genômica de bibliotecas de cromossomos artificiais bacterianos de camundongos e pela inserção de marcadores duplos de seleção bacteriana e de mamíferos. Este método de subclonagem mais inserção é altamente eficiente e produz a maioria dos recombinantes corretos. Apresentamos dados para a construção de diferentes tipos de vetores condicionais de nocaute genético, ou knock-in, e vetores repórteres BAC que foram construídos usando este método. A construção de vetores SPI amplia muito o repertório da caixa de ferramentas de recombinação e fornece um método simples, rápido e econômico de construir esses vetores altamente complexos.

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados. Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

O objetivo geral do experimento a seguir é construir vetores de direcionamento de genes usando subclonagem mais inserção. Isso é conseguido transformando o dorso contendo e coli com um plasmídeo recombinante. A segunda etapa envolve a geração de de inserção fosforolada assimétrica e a subclonagem de plasmídeos por reação em cadeia da polimerase.Após a adição de arabinose, as proteínas recombinantes GBAA são expressas e o de inserção modificado terminal e o plasmídeo de subclonagem são eletroporados. A sequência de DNA desejada é simultaneamente cativa do verso e modificada com o de inserção no plasmídeo de subclonagem. A principal vantagem desta técnica de métodos existentes, como a recombinação padrão, é que a construção do vetor de direcionamento de genes pode ser realizada em uma única reação.Para começar a projetar oligos para o de inserção e o plasmídeo de subclonagem, projete cada oligo de modo que contenha 180 braços de homologia de pares de bases flanqueando o local alvo genômico e 20 pares de bases, uma sequência de preparação específica para o de inserção ou plasmídeo de subclonagem. Em seguida, determine a orientação da inserção de DNA genômico do clone traseiro usando uma ferramenta baseada na web como o clone db. Estabeleça a direção da replicação de ou ES verificando o mapa do backbone do plasmídeo traseiro usado no dorso.Construção da biblioteca, adicione duas ligações terminais de fosfo oito, de modo que as cinco extremidades primas do oligo que são opostas à direção de replicação no clone traseiro. Em seguida, adicione uma modificação de fosfato de cinco primos ao oligo reverso. Primeiro, coloque uma ponta de pipeta estéril na cultura de ágar traseiro e inocule 5,0 mililitros de caldo de odino.Cultive a cultura a 37 graus Celsius por cinco horas com agitação a 200 RPM. Em seguida, resfrie, solução de glicerol a 10%, microcentrífuga, tubos e eletroporação, cubetas no refrigerador de gelo, centrífuga grande refrigerada e microcentrífuga a quatro graus Celsius. Após a incubação, determinar a densidade óptica da cultura usando um espectrofotômetro.Medindo a absorbância. A 600 nanômetros. Prepare as células eletrocompetentes quando uma leitura OD 600 de 0.3 a 0.8 for atingida.Quando a cultura estiver pronta, gire as células em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Lave as células com um mililitro de glicerol a 10% resfriado e gire novamente. Execute essas etapas de lavagem um total de três vezes.Ressuspenda as células em um volume total de 50 microlitros e adicione 10 a 200 nanogramas do plasmídeo recombinante. Obtenha uma suspensão de célula única pipetando para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, transfira as células para uma eletroporação pré-resfriamento. Vete. Em seguida, coloque o vete em um dispositivo de eletroporação e eletro-opere as células imediatamente, recupere as células em um mililitro de LB e transfira as células para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Cultive a cultura de volta a 30 graus Celsius por duas horas com agitação a 200 RPM. Após este tempo, adicione nove mililitros de LB à cultura recuperada. Cresça durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM para incorporar os braços de homologia no de inserção e no plasmídeo de clonagem subc.Realize a PCR usando os oligos longos modificados preparados anteriormente. Alternativamente, linearize o modelo de plasmídeo Usando uma enzima de restrição, escolha uma que corte fora da região de amplificação de PCR e seja ativada pelo calor. Configure o PCR usando um sistema de DNA polimerase de partida a quente de alta fidelidade.Prepare uma mistura mestre de PCR e execute ciclos térmicos de acordo com as melhores práticas. Após a reação, analise os produtos de PCR por eletroforese em gel AROS. Carregue de um a cinco microlitros de cada PCR em um gel 1%aros.Em seguida, purifique os produtos de PCR usando um kit de purificação de PCR. Quantifique o DNA amplificado por PCR em relação a um conjunto conhecido de padrões de DNA ou usando um espectrofotômetro NanoDrop. Após uma incubação durante a noite, dilua a cultura GBAA de volta 50 vezes e prepare uma cultura separada para um controle negativo.Cultive as culturas diluídas a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM por uma hora e 50 minutos. Em seguida, resfrie todos os materiais e equipamentos recombinados a quatro graus Celsius, conforme demonstrado anteriormente. Prepare uma solução de OSE a 10% de peso por volume e esterilize por filtro através de um filtro de seringa de 0,2 mícron.Quando a DO da cultura de costas atingir o nível desejado, prossiga com a indução das proteínas recombinantes. Adicione 200 microlitros da solução árabe a 10% a 10 mililitros da cultura de costas para obter uma concentração final de AOSE de 0,2% Inclua uma cultura não induzida para ser usada como controle negativo. Transferir as culturas para uma incubadora com agitação a 37 graus Celsius e induzir a expressão vermelha durante 45 minutos com agitação a 230 RPM.Gire as células e lave com 10% de glicerol três vezes, como mostrado anteriormente em 600 a 1000 nanogramas. Cada um dos de inserção e o plasmídeo de subclonagem para a reação de recombinação incluem um controle de inserção única de vetor e vetor mais um para verificar a proficiência e integridade de recombinação do vetor. Em seguida, obtenha uma única suspensão de célula e eletro-opere as células conforme mostrado anteriormente.Permita a recuperação em mídia LB a 37 graus Celsius por uma hora para plasmídeos multicópia ou em 10 lb a 37 graus Celsius por três horas para vetores traseiros. Completar diferentes diluições com a cultura recuperada em dupla seleção. Ágar, por favor, e cresça a 37 graus Celsius por 16 horas.Quando estiver pronto, escolha as colônias em cinco mililitros de LB contendo o antibiótico seletivo e cresça durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, use um kit de purificação de coluna para preparar o mini DNA de preparação, introduza a enzima de restrição apropriada e, em seguida, identifique os clones contendo os tamanhos de fragmentos esperados por eletroforese em gel. Finalmente, execute o sequenciamento de DNA nos braços de homologia e no de inserção para verificar se há erros de fotossíntese de oli.Neste exemplo, a análise de digestão de restrição de P dois RX uma inserção EYFP contendo clones mostrou o padrão esperado indicando que eles contêm o vetor knockin montado corretamente. Este esquema ilustra o conceito de corte de bloco. O uso de subclonagem e análise de inserção de produtos de PCR confirmou que os foram incorporados corretamente.Além disso, quando os clones positivos foram analisados após a adição da enzima de restrição apropriada, o padrão esperado foi obtido. A análise de digestão de restrição de 12 clones de R SR dois SBI mostrou montagem correta do vetor na maioria dos recombinantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir vetores de direcionamento de genes rapidamente usando subclonagem e inserção.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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