Name: Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 15 s
Description: Aprenda a técnica de transplante renal em ratos para estudar rejeição de enxertos e imunologia de transplantes. Este modelo permite investigar mecanismos de rejeição aguda e crônica em diferentes combinações de linhagens.

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Financiamento de Kidney Research UK, The Royal College of Surgeons de Edimburgo e da Sociedade Europeia de Transplante de Órgãos apoiou esse estudo.

Ética institucionais nacionais e locais apropriados devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Especificamente no Reino Unido os seguintes experimentos foram realizados sob os Animais (Scientific Procedures) Act 1986 Onde dois microsurgeons disponíveis para operar simultaneamente o cirurgião doador deve executar os passos 1,1-1,16 então 3.1 a 3.5, enquanto o cirurgião realiza destinatário 2,1-2,8 . Para um único operador os passos podem ser seguidos sequencialmente. 1. Doador Preparação Nota: O procedimento aqui apresentado é de um doador C57BL / 6 BM12 e destinatário C57BL / 6, machos, com idade entre 8 a 16 semanas de idade com um peso corporal superior a 20 g. No entanto, este procedimento pode ser realizado de forma reprodutível de uma variedade de estirpes de ratinho. Os dados apresentados na seção de resultados representativos foi obtido a partir de C57BL / 6, C57BL / 6 BM12 e BALB / c. <ol><li> Procedimentos de Conduta using instrumentos cirúrgicos estéreis e consumíveis (autoclave), com esforços para manter a área de operações tão estéril quanto possível. Realizar a preparação dos doadores em simultâneo com a preparação destinatário se dois cirurgiões estão disponíveis. </li><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal (agulha de 31G) de medetomidina (0,5 mg / kg) e cloridrato de cetamina (200 mg / kg). Isso resulta em um plano anestésico que é mantida durante 4 horas dando tempo suficiente para a totalidade do procedimento a ser realizado. Anestesia suplementar não é necessário. </li><li> Confirme se o mouse está anestesiado (sem resposta aos pés pitada). </li><li> Raspar o abdômen do rato e remover qualquer cabelo solto com fita adesiva. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas em uma esteira aquecida esterilmente drapeado e vagamente imobilizar os membros com fita adesiva estéril. </li><li> Monitorar o mouse durante todo o procedimento para queimaduras térmicas. Se possível usar uma fonte de calor não-elétrico. </li><li> Aplique um lubrificante ocular e sanitize da parede abdominal com uma solução diluída de iodo. </li><li> Faça uma incisão na linha média do abdome para entrar na cavidade peritoneal e inserir um 3 centímetros Calibri afastador abdominal. </li><li> Aplicar soro fisiológico aquecido para manter os intestinos e área cirúrgica úmida e evitar a secagem desnecessária das vísceras. </li><li> Cubra o mouse com campos estéreis e mover os intestinos à esquerda do operador (direita do mouse) para expor a aorta, veia cava e rim esquerdo. </li><li> Aplique uma pinça reajustados para o estômago e puxar superiormente para expor os grandes vasos e rim esquerdo totalmente. Embalar amortecer zaragatoas esterilizadas (2 mm x 2 mm) no abdómen para retrair tecidos longe da área cirúrgica, tais como os lóbulos do fígado, vesículas seminais e do intestino. </li><li> Isolar o rim esquerdo de adventícia circundante, gordura e glândula adrenal esquerda na cavidade peritoneal por bruscamente dissecando o tecido conjuntivo usando uma pinça de ponta fina. Coloque as pontas fechadas da pinça entre as áreas que need para ser separados e, lentamente, permitir que as dicas fórceps para abrir a dissecar o espaço. </li><li> Isolar a veia renal esquerda por ligação e, em seguida, dividindo-se a veia supra-renal e veia gonadal esquerdo esquerda com 9 / ó de nylon. Coloque a sutura perto da veia renal. </li><li> Ligadura e dividir o ureter com 7 / S de seda de sutura para fechar a bexiga deixando o fio de sutura termina longo. Estas extremidades longo de sutura irá ser utilizado quando o rim é colhida e são necessárias para a anastomose uretérica. </li><li> Para mobilizar e dissecar totalmente a aorta ea veia cava inferior e superiormente à artéria e veia renal utilize uma pinça de ponta fina para dissecar sem rodeios vasos linfáticos e gordura da parte frontal e nas laterais dos vasos. </li><li> Encontre o plano tecido entre a aorta ea veia cava e lentamente se espalhou a pinça. Abra lentamente as pontas dos pinça fina cotado para espalhar o tecido com um mínimo de trauma. </li><li> Amarre uma solta 7 / O de seda em torno da aorta superior e inferior à artéria renal passando um bom ângulopinça de ponta em todo o volta dos vasos e desenho uma sutura através. Estas suturas serão mais rigorosas antes da recuperação renal para permitir perfusão retrógrada da Universidade de Wisconsin solução. </li></ol> 2. Destinatário Preparação De acordo com o acompanhamento preparação doador passos 1.2 a 1.8. <ol><li> Mova os intestinos à direita do operador (à esquerda do mouse) para expor a aorta, veia cava. Cubra os intestinos com uma solução salina estéril cotonete embebido. </li><li> Realize uma nefrectomia direita por ligadura de artéria renal direita e veia juntamente com 7/0 fio de seda e depois dividir. </li><li> Ligadura do ureter direito com 7 / O fio de seda e dividir. </li><li> Mobilizar e dissecar totalmente a aorta ea veia cava inferior à artéria e veia renal tal como descrito no passo 1.14 e 1.15. Certifique-se de dissecção completa entre a aorta ea veia cava. Tome o cuidado de preservar a artéria espermática interna que corre anterior à veia cava e aortum juntamente com o feixe linfático. </li><li> Identificar vasos lombares em execução no retroperitônio da veia cava e da veia para a coluna, ligar com o 9 / O de seda em continuidade, não há necessidade de dividir os vasos. </li><li> Identificar espaço suficiente para colocar grampos microvasculares com espaço entre para anastomoses vasculares. </li><li> Administrar heparina intravenosa (5 unidades) através da veia dorsal do pênis. </li></ol> 3. doador de rim Retrieval Apertar os 7 / S laços de seda que foram colocados em torno da aorta inferior e superior para isolar o rim a partir da circulação arterial. <ol><li> Infundir retrógradas frio 0,2-0,5 ml de solução da Universidade de Wisconsin, com uma agulha (31G) na aorta. </li><li> Dividir a aorta dentro das suturas e dividir a veia renal na sua junção com a veia cava para remover o rim e a artéria renal com um comprimento da aorta. Divide vasos lombares decorrentes da aorta, se estiverem presentes, wligadura ithout. </li><li> Inserir o rim em solução salina fria numa compressa estéril numa placa de cultura. </li><li> Eutanásia do camundongo doador por deslocamento cervical. </li></ol> 4. Transplante renal - Kidney Preparação <ol><li> Criar um remendo aórtico dividindo a parede da aorta longitudinalmente em frente à artéria renal. Identificar os lúmenes embarcação no patch que precisam ser ligados ou evitado ao realizar a anastomose arterial. </li><li> Coloque um fio de sutura 10 / O de fora para dentro do lúmen da veia renal superiormente e uma segunda sutura separada inferiormente. As suturas usadas para dividir a veia supra-renal e veia gonadal pode ser utilizado para orientar o recipiente. </li><li> Coloque o rim no flanco direito do destinatário (Figura 1.1) e garantir as suturas estão bem colocados para garantir anastomoses vasculares pode ser concluída sem as suturas fiquem entrelaçados em cotonetes ou outros instrumentos. </li></ol> 5. Kidney Transplantação - Vascular Anastomose Aplicar grampos microvasculares primeiro inferiormente então superiormente abrangendo a veia cava e aorta. <ol><li> Adicione uma ventomy com uma agulha (31G) por punção da parede anterior da veia cava. Lavar o sangue a partir da veia cava por injecção de cerca de 50 ul de 0,9% de NaCl. </li><li> Alargar a venotomia usando fórceps de ponta fina abrindo-os dentro do venotomia modo que o comprimento é equivalente ao diâmetro da veia renal doador. </li><li> Coloque a sutura superior, 10 / O (que já está na luz da veia renal) pela primeira vez no ápice da venotomia (Figura 1.2) e juntar-se a parede de trás da anastomose em sutura contínua até que o vértice inferior é alcançada (Figura 1.3). </li><li> Coloque a 10 / O sutura inferior e gravata pela primeira vez com um único nó (Figura 1.4), em seguida, amarre a sutura contínua da parede do fundo. </li><li> Usando fio de sutura inferior criar a parede frontall da anastomose (Figura 1.5), com uma sutura contínua e gravata para o final de sutura superior no ápice superiores (Figura 1.6). </li><li> Criar um Aortotomia por pegar a parede da aorta com uma pinça e corte um remendo elíptica com uma tesoura (aproximadamente aortotomia deve ser um quinto da circunferência da aorta e três vezes o lúmen da artéria renal de comprimento). </li><li> Coloque um 10 / S de sutura no ponto superior do remendo da aorta a partir do exterior para o interior (figura 1.7) e passar através da aorta para amarrar fora dos vasos no vértice superior do Aortotomia. </li><li> Criar a anastomose arterial com sutura contínua começando superiormente (Figura 1.8) anastomose o patch doador para o receptor aorta, tomar cuidado para não contrair a anastomose por amarrar a sutura muito apertado (Figura 1.9). </li><li> Retirar os grampos vasculares inferiores primeira então o grampo superior a reperfundir o rim (Figura 1.10 e 1.11). Peristaltismo visível do ureter talvez visto se o fornecimento de sangue adequado para o ureter é alcançado. </li></ol> 6. Transplante Renal - anastomose ureteral <ol><li> Divida os anexos da bexiga na parede abdominal. </li><li> Passar uma agulha (21G) a partir da esquerda para a direita da bexiga por meio de ambas as paredes. </li><li> Coloque dicas fórceps retas no lúmen da agulha e passar tanto de volta através da bexiga de tal forma que as pinças são agora passando da direita para a esquerda para fora do lado esquerdo da bexiga. </li><li> Desenhar a sutura no ureter dador através da bexiga tal que a uretra passa no defeito do lado esquerdo, em seguida, para fora da bexiga do lado direito. </li><li> Suturar a adventícia do ureter à adventícia da bexiga com três únicos pontos isolados ao redor do ponto de entrada com 9 / O nylon sutura em uma agulha round-bodied. </li><li> Corte o ureter proximal à ligadura, th abrindo assime do ureter para permitir que a urina e permitir que a extremidade do ureter para retrair para dentro do corpo da bexiga. Visible produção de urina pode ser observado junto com o sangramento de vasos peri-ureterais. </li><li> Feche a lesão da bexiga lado direito, com uma única interrupção 9 / O fio de seda. </li></ol> 7 Recuperação e cuidados pós-operatórios Substitua as vísceras gastrointestinal no abdômen na orientação original e fechar a parede abdominal, aproximando os músculos retos com 6 / O fio absorvível. <ol><li> Aproximar a pele com agrafos para pele de metal. </li><li> Pouco inverter a anestesia com uma injecção subcutânea de cloridrato de atipamazole (10 ul / g). </li><li> Administrar analgesia por cloridrato de buprenorfina por via subcutânea (0,05 mg / kg) e para a injecção de fluido de apoio de 1 ml de NaCl a 0,9% por via subcutânea. </li><li> Recuperar o mouse em um gabinete de aquecimento a 28 ° C por 24-48 horas. Observe o mouse para a doença até oconclusão da experiência. </li><li> Remova os clipes de pele de metal 7-10 dias pós-operatório. </li><li> Uma vez que a experiência é concluída a eutanásia por deslocamento cervical do rato. </li><li> Retire e recolher o rim contralateral e enxerto para análise histológica. </li></ol>

<ol><li>Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+homotransplantation+of+the+kidney+in+an+identical+twin%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol+Assoc%22%5BJournal%5D)">Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin.</a> Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).</li>
<li>Wolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mortality+in+all+patients+on+dialysis%2C+patients+on+dialysis+awaiting+transplantation%2C+and+recipients+of+a+first+cadaveric+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1725-1730 (1999).</li>
<li>Nankivell, B. J., Alexander, S. I. Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).</li>
<li>Tse, G. H., Hughes, J., Marson, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+mouse+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Systematic review of mouse kidney transplantation.</a> Transplant International. 26, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+between+mice+of+graded+immunogenetic+diversity.+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant.</a> Proc. 5, 721-725 (1973).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+liver%2C+kidney%2C+heart%2C+and+intestine+allograft+rejection+in+different+mouse+strain+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations.</a> Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).</li>
<li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+cells+of+monocyte+lineage+prevents+loss+of+renal+microvasculature+in+murine+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation.</a> Transplantation. 86, 1267-1274 (2008).</li>
<li>Dang, Z., Mackinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+atrophy+and+interstitial+fibrosis+after+renal+transplantation+is+dependent+on+galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3.</a> Transplantation. 93, 477-484 (2012).</li>
<li>Jabs, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+Evolution+and+Mechanisms+of+the+Lesions+of+Kidney+Allograft+Rejection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the Evolution and Mechanisms of the Lesions of Kidney Allograft Rejection in Mice.</a> Am. J. Transplant. 3, 1501-1509 (2003).</li>
<li>Lin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+C4+from+Donor+or+Recipient+Mouse+Fails+to+Prevent+Renal+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of C4 from Donor or Recipient Mouse Fails to Prevent Renal Allograft Rejection.</a> Am. J. Pathol. 168, 1241-1248 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A forma mais bem descrito a anastomose arterial é usar a aorta distai do doador, com a artéria renal em continuação, de uma maneira extremo-a-lado para o aorta do receptor. Descreve-se o uso de um tapa-aórtica, semelhante ao espelhamento &#39;Carrell remendo &quot;que realizou no transplante de rim humano que acreditamos ser mais conveniente. Apesar de relatos na literatura de doador e receptor operatório tempo são escassos, acreditamos que a utilização de um remendo da aorta para aorta destinatário em vez de ponta-a-la...

Transplante renal bem sucedido para o tratamento da insuficiência renal foi descrita pela primeira vez em 1955 entre gêmeos monozigóticos 1, desde então, tornou-se um tratamento revolucionário para pacientes com insuficiência renal terminal em todo o mundo, oferecendo a melhoria da esperança e qualidade de vida 2. No entanto sobrevida do enxerto a longo prazo tem sido dificultado por uma multidão de processos patológicos, resultando em danos crônica do enxerto 3. A rejeição do rim transplantado em humanos continua a ser uma das principais causas de morbidade, apesar das melhorias significativas nos regimes immunosupporessive. O objetivo de desenvolver um modelo do rato de transplante renal é replicar de perto o processo e patologia encontrada no transplante renal humano 4. Skoskiewicz et al. Descreveu pela primeira vez o modelo do rato de transplante renal em 1973 5. Embora sejam necessárias técnicas de microcirurgia avançados, é um valioso tool por várias razões: o genoma de ratinho foi bem caracterizada e não existe uma grande variedade de métodos e técnicas experimentais disponíveis para estudos com ratinhos. Muitos grupos utilizam o modelo do rato de transplante renal têm usado o rim transplantado como um órgão de apoio à vida, no entanto, em outros estudos e na nossa metodologia descrita um dos rins nativa do rato destinatário é deixado no local durante todo o período do experimento 4. A vantagem é que o rato passa por uma única operação de anestesia e reduzindo desse modo a morbidade para o rato e o risco de morte de um segundo procedimento. Além disso, o mouse não sofrer com os efeitos adversos da insuficiência renal progressiva. Apesar de existirem modelos de rejeição alogênico em outros órgãos, como o coração e pele, estes nem sempre são diretamente relevantes para o transplante renal. Há evidências de que esses modelos suscitar diferentes modos e dynamics de rejeição, por exemplo, o curso de tempo de rejeição do enxerto cardíaco em enxerto renal e difere significativamente em determinadas combinações de cepa 6. Nós descrevemos padrões de rejeição do enxerto renal aguda em BALB doadores / c em não-transgênicos camundongos FVB / NJ, este modelo mostrou lesão celular mediada com acúmulo de células T e macrófagos 7. Alternativamente, também descrito um modelo de dano do aloenxerto crónica que apresenta fibrose intersticial e atrofia tubular, isto resulta a partir do transplante de um rim de ratinhos C57BL / 6 doadores BM12 em ratinhos C57BL / 6 receptores, uma vez que estes ratos são caracterizadas por uma única classe de MHC II mis loci -match 8. Vários aspectos do transplante, foram estudados utilizando o modelo do rato de transplante renal, incluindo a rejeição aguda, rejeição celular e humoral, isquemia lesão de reperfusão, e testando novos agentes terapêuticos. Nós modificamos o cirúrgico technique para reduzir o tempo de operação e melhorar a facilidade de operação. Particularmente descrevemos doador simultânea e preparação destinatário e uma técnica de anastomose vascular simplificado através da utilização de uma anastomose remendo aórtico contínuo. Este vídeo e manuscrito fornecerá pontos-chave para ajudar na criação desta técnica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Instrumentos Cirúrgicos</td></tr><tr><td>Tesouras de Dissecção Blunt</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>&nbsp; 14072-10</td><td>Para corte de pele</td></tr><tr><td>Tesoura Castoviejo curvada</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15017-10</td><td>Para corte de tecidos</td></tr><tr><td>Tesouras de mola - retas</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>15000-08</td><td>Para corte de sutura</td></tr><tr><td>Pinça dentada 1x2 dentes</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>2 x pinças de ponta fina (Dumont No.5)</td> <td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina angular (Dumont No. 5/45)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11253-25</td><td>Para dissecação sem corte</td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina curva (Dumont No.7)</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11273-22</td><td>Útil para passar vasos</td></tr><tr><td>Hemostato de cril curvo</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>1300-04</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de micro clipe com trava</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>18056-14</td><td></td></tr><tr><td>2 x Micro serrefines largura da mola 2mm, comprimento da mandíbula 4mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Grampos microvasculares</td></tr><tr><td>2 x Colibri 3cm afastador de fio</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha Castroviejo com trava</td><td>Fine Science Tools</td><td>120660-01</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de clipe de ferida</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Clipes de ferida de 7mm</td><td>Fine Science Ferramentas</td><td>12032-07</td><td>Remover 7 a 10 dias após a cirurgia</td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Microscópio pico OPMI</td> Carl <td>Zeiss</td><td>S100</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de cautério térmico com ponta</td><td>fina Geiger</td><td>150A</td><td></td></tr><tr><td>Almofada eletrônica</td><td>de calor Cozee Cumfort</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Euroklav 23-S</td><td>Melag</td><td>n/a</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td colspan="4">Descartável equipamento</td></tr><tr><td>7/O Sutura trançada de seda</td><td>Pearsall</td><td>30514</td><td></td></tr><tr><td>10/O Dafilon (poliamida) sutura</td><td>B-Braun</td><td>&nbsp; </td><td></td>G1118099</tr><tr><td>6/O Vicryl (plygalectin)</td><td>Ethicon</td><td>W9537</td><td></td></tr><tr><td>Agulha chanfrada regular, 1 polegada, 21G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>305175</td><td>Para anastamose ureteral</td></tr><tr><td>Agulha chanfrada regular, 5/8 polegada, 25G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Agulha chanfrada regular, 1/2 polegada, 30G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de insulina 1ml, 29G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de insulina 0,3ml, 30G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>ponta deslizante da seringa de 1 ml</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>300184</td><td></td></tr><tr><td>ponta deslizante da seringa de 5 ml</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de papel Wypall</td><td>Kimberley-Clark</td><td>L40</td><td>esterilizado por autoclave</td></tr><tr><td>Botões de algodão</td><td>Johnson e Johnson</td><td>n/a</td><td>esterilizados por autoclave</td></tr><tr><td>Cortinas lisas</td><td>Guardian</td><td>CB03</td><td>esterilizado por autoclave</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células 60mm x 15mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Pino de distribuição</td><td>B-Braun</td><td>DP3500L / 413501</td><td>Usado com NaCl 0,9%</td></tr><tr><td>Reagentes e Medicamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lacri-Lube) Parafina branca macia 57,3%, óleo mineral 42,5% e álcoois de lanolina 0,2%</td><td>Allergan Ltd</td><td>21956GB10X</td><td></td></tr><tr><td>(Videne) Iodopovidona 10%</td><td>Ecolab Ltd</td><td>PL 04509/0041</td><td></td></tr><tr><td>(Vetalar V) Cloridrato de cetamina</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>Vm 42058/4165</td><td>Solução 100mg/ml (dose 200mg/kg)</td></tr><tr><td>(Domitor) Cloridrato de medetomidina&nbsp;</td><td>Orion Pharma</td><td>Vm 06043/4003</td><td>1mg/ml (dose 0.5mg/kg)</td></tr><tr><td>(Vetergesic) Cloridrato de Bupernorfina&nbsp;</td><td>Alsto Animal Health</td><td>Vm 00063/4002</td><td>0,3mg/ml (dose 0,05mg/kg</td></tr><tr><td>)(Antisedan) Hidrocorido de atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vm 06043/4004</td><td>5mg/ml (dose 2mg/kg)</td></tr><tr><td>Solução da Universidade de Wisconsin</td><td>Belzer Bridge to Life</td><td>n/a</td><td>dose de aproximadamente 500 microlitros/camundongo</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Baxter</td><td>FKE1323</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de heparina</td><td>não patenteado</td><td>N/A</td><td>5000 unidades/ml (dose de 5 unidades/camundongo)</td></tr></tbody></table>

rato transplante renal: modelos de rejeição de enxertos

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

A rejeição do rim transplantado em humanos ainda é uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O modelo de transplante renal em camundongos replica de perto os processos técnicos e patológicos que ocorrem no transplante renal humano. Embora existam modelos de camundongos de rejeição alogênica em outros órgãos que não o rim e sejam mais tecnicamente viáveis, há evidências de que diferentes órgãos provocam modos e dinâmicas de rejeição díspares, por exemplo, o curso do tempo de rejeição no aloenxerto cardíaco e renal difere significativamente em certas combinações de cepas. Este modelo é uma ferramenta atraente por muitas razões, apesar de seus desafios técnicos. Como os haplótipos de cepas de camundongos endogâmicos são bem caracterizados, é possível escolher combinações de doadores e receptores para modelar a rejeição aguda do aloenxerto por transplante em loci MHC classe I e II. Por outro lado, pelo transplante entre cepas com haplótipos semelhantes, um processo crônico pode ser provocado onde o rim do aloenxerto desenvolve fibrose intersticial e atrofia tubular. Modificamos a técnica cirúrgica para reduzir o tempo cirúrgico e melhorar a facilidade da cirurgia, porém ainda é preciso superar uma curva de aprendizado para replicar fielmente o modelo. Este estudo fornecerá pontos-chave no procedimento cirúrgico e auxiliará no processo de estabelecimento dessa técnica.

A rejeição do aloenxerto renal pode ser avaliada através da análise histológica de secções de tecido embebidos em parafina fixados com Methacarn do rim transplantado (Figura 2). Transplante de rins entre isoenxerto resultados ratos singï¿½icas em renal lesão de reperfusão isquêmica, porém por 4 semanas, os túbulos se recuperaram e são histologicamente comparável à rins nativos. A rejeição aguda pode ser modelado por C57BL / 6 em receptores de transplante de rim de BALB / c, no prazo de 1 semana, há infi...

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a imunologia da rejeição. O modelo cirúrgico apresentado relata um curto tempo operatório e uma técnica concisa. Dependendo da combinação de cepas doador-receptor, o rim transplantado pode desenvolver rejeição celular aguda ou dano crônico ao aloenxerto, definido por fibrose intersticial e atrofia tubular.

Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Este vídeo apresenta um modelo de transplante renal em camundongos. Ao utilizar as múltiplas cepas endogâmicas, que conheceram as principais classes de histocompatibilidade, somos capazes de recriar diferentes aspectos da rejeição do aloenxerto renal. Os dados apresentados ilustram como este é um modelo útil No estudo desses mecanismos, este desenho esquemático demonstra as principais etapas deste modelo.Uma nefrectomia esquerda é realizada em um camundongo doador e o rim do doador é então preparado em um cotonete estéril. Em uma placa de cultura, o camundongo receptor é submetido a uma nefrectomia direita antes que o rim do doador seja transplantado. O procedimento é realizado usando instrumentos autoclavados estéreis e consumíveis posicionados dentro de um campo cirúrgico estéril.Se vários animais forem operados, um novo conjunto de instrumentos estéreis é usado para cada procedimento ou os instrumentos são esterilizados entre os procedimentos. Usando um esterilizador de contas, o operador usará um avental estéril, máscara, chapéu e luvas. Um único operador pode realizar este procedimento preparando o doador até o ponto de recuperação do rim.O receptor é então preparado para o transplante antes de retornar ao doador para remover o rim. Isso reduz o tempo de isquemia fria. Alternativamente, dois operadores podem preparar o doador e o receptor simultaneamente.Isso permite que vários animais sejam operados em um dia. Aqui está um macho de oito semanas de idade C 57 preto de seis camundongos que foi anestesiado por uma injeção intraperitoneal de cetamina e cloridrato e meína. A área cirúrgica foi raspada e higienizada com solução diluída de iodo.O mouse foi colocado em uma almofada cirúrgica aquecida coberta estéril com as extremidades afixadas à almofada. Pomada para os olhos foi aplicada. Uma laparotomia é realizada por uma incisão na linha média da pele.Em seguida, a cavidade peritoneal é aberta através do Albert linear usando uma tesoura separadora de tecidos. O mouse é então coberto e um afastador calibra é inserido na incisão. Os intestinos são deslocados para a esquerda ou direita do campo cirúrgico para expor o rim esquerdo e o ureter para preparar o rim doador.Para o transplante, o ureter é ligado e dividido o mais próximo possível da bexiga. As veias gonadal inferior e adrenal superior são ligadas e divididas perto da veia renal. A aorta é ligada, superior e inferior à artéria renal e a solução fria da Universidade de Wisconsin é injetada na aorta para perfundir o rim.O ureter pode ser facilmente dissecado do retroperitônio e rastreado até a terminação da bexiga. Deve ser ligado o mais próximo possível da bexiga com sutura 7.0 e, em seguida, dividido, a veia gonadal esquerda normalmente deságua na veia renal. Deve ser duplamente ligado com sutura 9.0 e dividido entre os pontos próximos à veia renal.Como mostrado neste clipe de maneira semelhante, a veia adrenal esquerda deságua na veia renal e deve ser ligada e dividida. A atenção deve então se voltar para a dissecação da aorta doadora do tecido linfático circundante e o advento para permitir a colocação da primeira sutura inferior solta e abrangente. Em seguida, uma sutura superior à artéria renal.Uma vez que o camundongo doador esteja pronto, cinco unidades de heparina intravenosa são administradas pela veia penal dorsal. Primeiro, a sutura da aorta inferior é amarrada firmemente seguida pela ligadura superior. Isso isola o rim da circulação arterial.Aproximadamente 500 microlitros de solução fria da universidade Wisconsin são administrados pela aorta. A profusão bem-sucedida é identificada pelo branqueamento do rim doador. A aorta é dividida inferiormente primeiro e depois superiormente à artéria renal.Em seguida, a veia renal é dividida em sua junção com a veia cava. O rim do doador é então removido e colocado em gaze estéril fria. Em uma placa de cultura, a aorta é incisada longitudinalmente diretamente oposta à aorta renal.Para criar um remendo aórtico para anastomose, identifique o lúmen da artéria renal e certifique-se de que não haja artérias polares extras. A veia renal é então preparada colocando primeiro uma sutura de poliamida 10 O no ápice inferior da veia renal e, em seguida, uma sutura no ápice superior. As ligaduras que dividiram a veia adrenal e a veia gonadal são marcadores úteis para orientar a veia.Neste ponto, após a colheita do rim do doador, um camundongo receptor é preparado conforme descrito anteriormente, o camundongo receptor é coberto e um afastador calibra é inserido. Os intestinos são deslocados para a direita ou para a esquerda do campo cirúrgico e cobertos com campos estéreis umedecidos com solução salina. Primeiro, uma nefrectomia direita é realizada por ligadura, a artéria e veia renais com sete oh sutura, e então o ureter é isolado e ligado antes da divisão.Finalmente, a artéria e a veia renais são divididas, após o que o rim pode ser removido. Isso cria espaço dentro da cavidade peritoneal para a aorta e a veia do receptor renal transplantado, Caver precisa ser preparado para a anastomose vascular. Primeiro, o feixe linfático é mobilizado da aorta e da veia cava e o retroperitônio é aberto.Disseque sem rodeios os vasos lombares dos aspectos esquerdo e direito para permitir a colocação de uma sutura ao redor dos vasos lombares. Os vasos podem então ser ligados em continuação sem se dividir. Isso evita sangramento nas costas ao realizar a anastomose vascular.A dissecção adicional é então realizada para criar uma janela entre a aorta e a veia cava e do tecido do advento circundante. Identifique uma posição para clamp microvascular superior e inferior, garantindo que esteja livre de excesso de tecido e pronta para anastomose. Neste ponto, a heparina pode ser administrada por injeção intravenosa, como mostrado anteriormente, O rim do doador é colocado na cavidade peritoneal do receptor.Deve-se tomar cuidado com o mouse para garantir que as suturas colocadas na veia não fiquem emaranhadas. Este desenho esquemático mostra o rim do doador junto com a aorta e a bexiga da VCI do receptor após a nefrectomia direita para transplantar um rim de doador dois. Pinças traumáticas são aplicadas na VCI e na aorta acima e abaixo do local da anastomose vascular.O rim, a veia renal e a artéria do doador são anastomoses na VCI e na aorta do receptor, respectivamente. Em seguida, os grampos atraumáticos são removidos e o rim do doador é reperfundido. O ureter é então anastomoso na bexiga do receptor primeiro.A pinça microvascular inferior é aplicada abrangendo a aorta e a veia cava. Um grampo superior é então colocado. A atomia é feita com uma agulha de calibre 30 e a veia cava lavada com solução salina.A otomia venosa é ampliada com fórceps. A sutura previamente colocada no ápice superior da veia renal do doador é então passada através da veia cava do receptor no ápice superior da veotomia. A sutura é então amarrada e uma anastomose de sutura contínua da parede posterior da veia renal com a veia caver é feita assim que o ápice inferior da otomia de pH é atingido.A segunda sutura previamente colocada na veia renal é passada pela veia cava inferior e amarrada. Isso pode então ser amarrado à primeira sutura e uma anastomose vascular em execução realizada para completar a parede frontal. No protocolo anexo, é fornecida uma representação esquemática de cada etapa da anastomose vascular.É extremamente importante evitar suturar inadvertidamente a parede frontal à parede posterior e também envolver a artéria real ou remendo aórtico nas suturas da anastomose de Vênus. A autotomia doadora ou autotomia pode então ser criada pegando uma pequena elipse da aorta na pinça e cortando precisamente com uma tesoura. Uma sutura de 10 oh é então colocada no ponto superior do remendo aórtico.Tome cuidado para realizar o manuseio mínimo de qualquer uma das superfícies endoteliais arteriais. Como isso aumenta o risco de trombose, a sutura é então passada pelo ápice superior da autotomia A e maré. O adesivo aórtico pode então ser anastomoso em uma sutura contínua à aorta do receptor e amarrado a si mesmo.Tome cuidado para não amarrar com muita força, pois isso pode causar um efeito por corda e comprometer o influxo. O grampo microvascular inferior é removido primeiro, muitas vezes a reperfusão ocorre devido ao refluxo para a artéria renal a partir da aorta distal. Em seguida, o grampo superior é removido.A anastomose ureteral é então realizada passando uma agulha de calibre 21 para dentro e para fora da bexiga. As pinças são então passadas de volta pelo trato e, em seguida, o ureter é puxado pela sutura. O tecido advento do ureter é então suturado ao tecido advento da bexiga com nove ou poliamida em três pontos para fixar o ureter no lugar.O ureter é então cortado, lavado na bexiga e, muitas vezes, a urina pode ser vista sendo produzida pelo rim do doador. Observe também sangramento dos vasos ureterais. O ureter pode ficar frouxo na bexiga e o defeito fechado após a substituição dos intestinos.O peritônio é suturado e a pele é fechada com clipes metálicos. O iodo é então aplicado na área cirúrgica e a anestesia é parcialmente revertida por uma injeção subcutânea de cloridrato de tapazol. Analgésicos São administrados por uma injeção de cloridrato de buprenorfina.Os fluidos são administrados por uma injeção subcutânea de solução salina aquecida por um mil. Os ratos são cuidadosamente monitorados até que você recupere a consciência, parecem alertas e incapazes de escrever sozinhos. Os ratos podem recuperar qualquer caixa aquecida mantida a 29 graus por 24 horas para experimentos de longo prazo.Analgésicos contínuos são administrados e os clipes de pele são removidos. Sete dias após a cirurgia. Aqui está um camundongo 24 horas após a cirurgia que é totalmente móvel e passa pela urina manchada de sangue no tecido da cama.É importante monitorar a paralisia do manuseio neste modelo, pois isso pode indicar complicações vasculares apresentadas. Em seguida, há dados que indicam como esse modelo e diferentes cepas de camundongos podem ser usados para estudar o desenvolvimento da rejeição de transplante renal para modelar a rejeição aguda de transplante. A cepa de camundongo mutante BM 12 é usada como doador.Esses camundongos BM 12 mutantes diferem da cepa parental C 57 black six por uma única diferença de classe dois do MHC transplantando um rim BM 12 em um receptor C intestinal. Resulta em rejeição aguda devido a uma incompatibilidade completa de MHC de classe um e classe dois. Um aloenxerto de seis pretos C 57 leva ao desenvolvimento de rejeição crônica devido à incompatibilidade isolada de MHC Os enxertos BM 12 ISO têm uma correspondência completa de MHC de classe um e classe dois e, portanto, não exibem sinais de rejeição.A estrutura renal é examinada por histopatologia em cortes renais embebidos em parafina corados com hematina e eoína. Como este modelo não depende do transplante para sobrevivência, o rim nativo pode ser usado como controle Após o transplante renal de enxerto ISO, o rim sofre lesão de isquemia e reperfusão, mas em quatro semanas os túbulos se recuperaram após o BM 12 no transplante de aloenxerto de biópsia. A rejeição aguda é aparente com infiltrados difusos de células mononucleares denotados pelos túbulos necróticos de asterisco único com asterisco duplo e rins do túbulo BM 12 transplantados para C 57 camundongos pretos seis.Resulta em dano crônico do aloenxerto caracterizado por infiltrado linfático perivascular denotado pelas setas de bloqueio com fibrose intersticial e atrofia tubular indicada por setas ocas. A quantificação de túbulos por campo de alta potência pode ser usada para avaliar a massa funcional do néfron. Não houve diferença entre a contagem de enxerto ISO e túbulos renais nativos de quatro semanas após o transplante.A rejeição aguda resulta em uma perda significativa de túbulos em quatro semanas. Em comparação, a rejeição crônica mostra uma perda mais variada, mas gradual. Piro vermelho grave é uma mancha de colágeno pan e pode ser realizada em seções renais embebidas em parafina Para quantificar a fibrose intersticial.O transplante renal de enxerto ISO está associado a fibrose insignificante em comparação com o rim nativo BM 12 inter C 57. O bloco seis resulta em fibrose em 12 semanas. Após o transplante, descrevemos um modelo de transplante renal com ênfase na demonstração das técnicas cirúrgicas.Este modelo está associado a uma curva de aprendizado significativa, que pode ser superada para alcançar um modelo de transplante renal de camundongo funcional reprodutível. A combinação de cepas descrita desenvolve características-chave de danos crônicos ao transplante renal e pode ser usada para investigar a patologia resultante de fibrose intersticial e atrofia tubular. Além disso, a rejeição aguda também pode ser modelada, permitindo a investigação de importantes mecanismos fisiopatológicos dessa entidade.Este vídeo fornece os principais pontos cirúrgicos para ajudar o espectador a replicar fielmente este modelo.

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