Name: Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a analisar a especificidade de substrato das metiltransferases de lisina proteica (PKMTs) utilizando arrays de peptídeos SPOT. Este método permite identificar aminoácidos críticos e definir perfis de especificidade de forma eficiente.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa DFG JE 252/7.

1. Preparação do péptido Matrizes <ol><li> Programação do Peptide Sequências <ol><li> Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais. Péptido 1: TARKSTGGKA </li><li> Gerar alanina ou arginina pé bibliotecas com um comando específico (.replace, A) para rastrear os aminoácidos importantes necessários para o reconhecimento de um substrato definido. Por exemplo, no exemplo que se segue a primeira linha é a sequência de tipo selvagem e a partir da segunda linha de cada aminoácido num péptido é alterado para alanina sequencialmente. substituir, Um TARKSTG A -ARKSTG T- A -RKSTG TA A -KSTG TARGET A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G A TARKST- </li><li> Use comandos semelhantes (.replace R,.N substituir etc.), tal como descrito em 1.1.2 com todos os resíduos de aminoácido naturalmente disponíveis (eventualmente omitindo cisteína, metionina e triptofano, porque estes resíduos são propensos a oxidação e, por vezes, menor rendimento de síntese) para sintetizar um péptido de matriz para a determinação do consenso motivo da sequência substrato para uma enzima. NOTA: Como mostrado na Figura 4A, o eixo horizontal representa a sequência do péptido dada e o eixo vertical representa os aminoácidos que são seleccionadas para o comando. Semelhante à sequência mostrada em 1.1.2, uma no eixo vertical significa que uma sequencialmente Ala substitui cada posição da sequência dada na primeira fila na FIG. 4A. Do mesmo modo sequencialmente arginina substitui cada aminoácido na segunda fila e assim por diante com outros aminoácidos. Bibliotecas de matriz péptido completas são sintetizados por substituição sistemática de cada resíduo na sequência de péptido substrato fornecida com cada uma das the outros resíduos de aminoácidos naturalmente disponíveis, o que ajuda a entender a influência de cada resíduo em cada posição da sequência dada. </li><li> Como alternativa, a metilação de substratos peptídicos conhecida ou prevista pode ser facilmente verificada sintetizar bibliotecas de péptidos com os péptidos alvo do PKMT juntamente com controles de metilação positivo e negativo (ou seja, peptídeos conhecidos desnaturado ou conhecidos não ser metilado). Sintetizar peptídeos através da troca de lisina alvo putativo para alanina para confirmar a metilação da lisina-alvo, como mostrado abaixo pela programação manual. Tipo selvagem peptídeo: STGG K PRQFL Peptídeo Mutant: STGG A PRQFL NOTA: O software também tem os scripts inerentes para criar diversas bibliotecas, como mapeamento de epitopo com uma mudança de enquadramento desejada da sequência de aminoácidos para mapear importantes necessários para uma interacção. </li></ol></li><li> Preparação de Membrana, Aminoácidos umd Reagentes <ol><li> Pré-inchar a membrana SPOT em DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 minutos e em seguida, coloque a membrana molhado na armação SPOT sintetizador sem bolhas de ar ou rugas. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com etanol a 100%. Secam-se as membranas completamente durante pelo menos 10 min antes de iniciar o programa de síntese. </li><li> Em paralelo, preparar de fresco 0,5 M concentrações úteis de aminoácidos protegidos com Fmoc comercialmente disponíveis através da dissolução em NMP e também preparar o activador e de base como descrito na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de que todos os recipientes de solução resíduos do sintetizador SPOT foram esvaziados e reabastecer os reservatórios de solvente com o DMF, etanol e piperidina. NOTA: A máquina está pronta para a síntese. </li></ol></li><li> A mancha de primeiro aminoácido <ol><li> Para gerar a ligação amida com o grupo amino livre sobre a membrana, activar o grupo carboxilo do amino ácido de entrada por adding o activador (N, N &#39;-diisopropilcarbodiimida) e solução de base (hidroxiimino Cianoacetato de etilo) para o derivado de aminoácido. </li><li> Spot the volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizado Amino-PEG usando o robô programável. NOTA: Deste modo, o C-terminal do aminoácido é acoplado ao grupo amino da membrana. </li><li> Repetir esta etapa, três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido activado. Incubar a membrana durante 20 minutos e, em seguida, lava-se com DMF, para remover os aminoácidos desacoplados. </li></ol></li><li> Bloqueio de espaços livres em áreas não-local NOTA: Após o acoplamento do primeiro aminoácido C-terminal de todos os péptidos para o grupo amino da membrana, os grupos amino entre as manchas e também alguns dos grupos amino no local dentro das áreas não formar ligações com os aminoácidos. <ol><li> Bloquear os grupos amino livres através da incubação com a solução de nivelamento (20% de anidrido acético em DMF)durante 5 min. NOTA: Este evita o acoplamento de aminoácidos nos ciclos posteriores, com a membrana em vez da cadeia peptídica em crescimento. </li></ol></li><li> A remoção do grupo Fmoc <ol><li> Após o bloqueio, lavar a membrana com DMF 4 vezes e depois incubar com 20% de piperidina em DMF durante 20 min para remover o grupo de protecção Fmoc. NOTA: Este passo leva à remoção dos grupos Fmoc protectores de amino e é chamado de desprotecção. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana duas vezes com DMF e duas vezes com etanol e deixar secar. NOTA: Agora, a membrana está pronto para o acoplamento dos próximos amino ácidos. </li></ol></li><li> O alongamento da cadeia NOTA: A adição de cada aminoácido é chamada um ciclo. Para além do acoplamento do primeiro aminoácido, o ciclo inicia-se com a desprotecção do grupo Fmoc do aminoácido acoplado e é seguido pelo acoplamento do grupo carboxilo activado de um amino ácido de entrada para o grupo amino do pep crescentecadeia maré. <ol><li> Repita os passos 1.3 e 1.5 até que o comprimento de péptido desejado é alcançado. </li></ol></li><li> Coloração NOTA: Após o ciclo final, as matrizes de peptídeos são corados com azul de bromofenol para confirmar a síntese bem-sucedida de peptídeos. Azul de bromofenol se liga com os grupos amino livres dos péptidos. Manchas de péptidos mostrar luz cor azul após a coloração, mas a intensidade das manchas varia dependendo da sequência peptídica. Esta coloração permite a confirmação da remoção completa de piperidina, porque na presença de azul de bromofenol a piperidina não mancha os péptidos. Além disso, isto também ajuda a marcar as matrizes de péptidos para posterior utilização. <ol><li> Após desprotecção do grupo Fmoc no último ciclo de síntese, lava-se a membrana com DMF e etanol a 100%. Em seguida, tratar a membrana com azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol em DMF) durante um mínimo de 5 minutos até que se torne azul completamente. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana com DMF e ethanol seguido por secagem durante 10 min. Agora tire a membrana do sintetizador e realizar a desprotecção da cadeia lateral (seção 1.8) manualmente. Se necessário, a fotografia da membrana para registar os resultados da síntese de péptidos (Fig. 2). </li></ol></li><li> Cadeia Lateral desprotecção <ol><li> Tratar as membranas com 20 a 25 ml de mistura de desprotecção da cadeia lateral que consiste em 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para clivar os grupos de protecção de cadeia lateral e reagentes eliminadores de água (2,5% e 2,5% de triisopropilsilano) para proteger as cadeias laterais de aminoácidos a partir de modificação durante este passo. Tomar um volume suficiente da mistura de desprotecção para assegurar que abrange a membrana completamente numa caixa resistente a produtos químicos e hermeticamente fechado e que incubar durante 1 a 2 horas enquanto se agita suavemente. </li><li> Lava-se a membrana seis vezes com 20-25 mL de DCM (diclorometano), durante 2 minutos cada e, finalmente, duas vezes com etanol a 100% e seca-se num exsicador durante a noite. NOTA: Agoraa membrana pode ser utilizado para experiências. Um esquema de síntese da matriz péptido é fornecida na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Expressão de Proteína de PKMTs como GST Fusions <ol><li> Usando técnicas padrão, clonar o gene que codifica o PKMT comprimento completo ou o seu domínio catalítico num vector de expressão bacteriana (como pGEX-6p2) para expressar a proteína de fusão-GST. </li><li> Transferir o vector com o PKMT desejado inserir em BL21 BL21 codão ou mais E. células de E. coli pelo método de choque de calor ou qualquer outro método. </li><li> Prepara-se uma pré-cultura com 30 ml de meio de Luria-Bertani (LB), o dia de expressão e incubar a 37 ° C durante 7 a 8 horas com agitação contínua. </li><li> Em seguida, transferir 10 ml da pré-cultura em 2 L de frascos de grandes confundidos contendo 1 L de meio LB e incubar a 37 ° C no incubador com agitação contínua até que o alcance culturaes uma densidade óptica a 600 nm definido. NOTA: Enquanto isto pode ser optimizado para cada proteína, que normalmente induzem a um OD 600 nm de cerca de 0,8. A temperatura de indução tem de ser optimizados para cada proteína individual, algumas proteínas mostram boa expressão em 22 ° C e a temperaturas um pouco mais elevadas. </li><li> Deslocar as células à temperatura de indução, durante 15 min, em seguida, induzir com 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido e permitir a cultura a crescer durante 10-12 horas à temperatura de indução. </li><li> Em seguida a colheita das células por centrifugação a 5000 xg durante 15 min e, finalmente, lavar o sedimento com 30 ml de tampão de STE (10 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM e EDTA 0,1 mM) e armazenar a -20 ° C para posterior utilização. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Descongelar o pellet celular e re-suspensão em 30 ml de tampão de sonicação (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) e perturbar por sonicação. NOTA: Este tampão needs de ser optimizados para cada proteína, eventualmente. </li><li> Centrifuga-se o lisado celular a 22000 x g durante 1 hora e, depois, recolher o sobrenadante e passar através de uma coluna contendo 600 mL de resina glutationa Sepharose 4B. </li><li> Lava-se a coluna com 50 ml de tampão de sonicação e em seguida com 100 ml de tampão de alto teor salino (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) para remover as proteínas não especificamente ligadas. Elui-se a proteína ligada com 5 ml de tampão de alto teor salino contendo glutationa 40 mM. </li><li> Dializar a proteína eluída em 2 L de tampão de diálise com baixo glicerol (20 mM de Tris, pH 7,4, KCl 100 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 10%) durante 2 horas e depois em tampão Tris 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e glicerol a 70% durante 8 horas ou durante a noite. Certifique-se de todos os buffers de purificação são a 4 ° C e realizar a purificação de proteínas na câmara fria para evitar a desnaturação das proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Peptide Matriz Methylation <ol><li> Pré-incubation of Peptide Arrays <ol><li> Realizar péptido matriz de metilação, quer dentro de uma caixa de tamanho apropriado ou em um saco de plástico para evitar o desperdício de enzima e caro marcado radioactivamente AdoMet. Pré-incubar o péptido matriz da membrana no saco de plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e rotulado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. O volume de tampão depende do tamanho da matriz, por exemplo, usar 8 ml de tampão de metilação de uma especificidade completa matriz perfil peptídico. Optimizar a quantidade e a concentração da AdoMet para cada enzima. </li></ol></li><li> A metilação do péptido Matrizes <ol><li> Descartar o tampão de pré-incubação e incubação da membrana em 8 ml de tampão de metilação contendo a respectiva PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet por 1 a 2 horas. NOTA: A quantidade de enzima necessária para uma reacção de metilação depende da actividade de PKMT específico, iniciamos nossas experiências de rastreio, tipicamente com 50 nM de enzima aletaconcentração al. </li></ol></li><li> Lavagem das matrizes Peptide <ol><li> Depois descartar o tampão de metilação de um recipiente de resíduos radioactivos e lavar as matrizes de péptidos por 5 vezes com 20 ml de tampão contendo 100 mM de bicarbonato de amónio e 1% de SDS durante 5 minutos para remover a proteína ligada. Descarte o tampão de lavagem em um recipiente de lixo radioativo. </li></ol></li><li> A detecção do sinal radioativo <ol><li> Após as lavagens da membrana incubar durante 5 min em 10 ml de solução amplificar (NAMP100V). </li><li> Em seguida, descartar a solução amplificar no contentor de resíduos radioactivos para solventes orgânicos, selar a matriz peptídeo em um saco plástico e coloque-o em uma cassete de auto-radiografia. </li><li> Coloque a película auto-radiografia da matriz sobre o péptido em quarto escuro. Fechar a cassete cuidadosamente e expô-lo a -80 ° C durante o tempo necessário. Em seguida, o desenvolvimento do filme para analisar os resultados. Capturar a imagem do casal vezes com expositio diferenten vezes para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilado. </li></ol></li></ol> 4. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Densitomï¿½rica Análise da mancha Intensities <ol><li> Digitalizar o filme em um scanner convencional e analisar as intensidades local por densitometria. Faça isso usando ImageJ (que é gratuito) ou um programa comercial. NOTA: Nós usamos o software Phoretix para esta tarefa. </li></ol></li><li> Normalização e Média dos resultados de diferentes membranas <ol><li> Conduzir as experiências de metilação péptido de matriz, pelo menos em triplicado. Normalizar as intensidades digitalizados para cada experimento por subtração de fundo e definindo a atividade em um substrato de referência como 1.0. Calcular a média dos dados para os pontos individuais e relatá-los como valores médios e desvios-padrão. </li></ol></li><li> Análise e visualização de dados <ol><li> Traçar os dados em 2D, utilizando um esquema de escala de cinza ou de cor para indicar a atividade relativa. Faça isso with Excel ou SigmaPlot imediata. Além disso, preparar um gráfico da distribuição dos desvios padrão das experiências repetidas para analisar a qualidade dos dados. </li><li> Para comparar e visualizar a exactidão do reconhecimento de cada resíduo no péptido substrato quantitativamente, calcular a preferência relativa do PKMT para cada aminoácido na posição x i por um factor de discriminação 16,17 D: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Onde v i é a taxa de metilação do péptido portador de variante de aminoácido na posição x i e &lt;v j ≠ i&gt; é a taxa média de metilação de todos os 19 péptidos que transportam um aminoácido diferente j ≠ i na posição x (incluindo o sequência de tipo selvagem). NOTA: O factor de discriminação definido por este depende do nível de fundo. Se apenas um resíduo é aceito em uma determinada posição com um fundo de 3%, a discriminaçãofator de 32,3 é obtido. Sem preferência numa posição resulta num factor de discriminação de 0. </li></ol></li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza 21 esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domínios proteicos ou c...

Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona 1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que contém mais de 60 proteínas no genoma humano. PKMTs foram inicialmente descoberto como histonas modificando enzimas que metilar resíduo de lisina específica, mas relatos posteriores demonstraram que eles também poderiam metilar proteínas não-histonas 5. Até agora, cerca de 5,000 locais de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas 6 </saté&gt;, mas as enzimas responsáveis ​​por estas modificações não são frequentemente identificados. Uma razão para isto é que a especificidade da maior parte das PKMTs não tem sido extensivamente estudada. Portanto, ocorre que recorrentemente novos substratos de PKMTs são descobertos. A falta de um conhecimento detalhado da especificidade de substrato de PKMTs dificulta a compreensão de sua função biológica e papel. Para estudar a especificidade de um PKMT em detalhe, as taxas de metilação de muitos substractos de péptidos que diferem em um ou poucos aminoácidos devem ser medidos e comparados, o que deve ser feito preferencialmente utilizando arrays de péptidos. Com base nos perfis de especificidade resultantes, os potenciais substratos de PKMTs pode ser identificado que pode ser mais estudada. Matrizes de péptidos são amplamente utilizadas ferramentas para a análise bioquímica de anticorpos, enzimas modificadoras de péptidos e o mapeamento dos locais de interacção proteína-proteína (antigénio-anticorpo, receptor-ligando) 7-9. Várias centenas de péptidos são necessários para such aplicações. Existem diferentes métodos para a síntese de péptidos, entre os quais o péptido na resina de síntese é muito usado, mas tem limitações no rendimento e é relativamente dispendioso. Esses problemas foram resolvidos com a introdução do método de síntese SPOT por Frank e seus colegas 10. O método de síntese permite a síntese de SPOT várias centenas de péptidos em paralelo e em média é barata em comparação com a síntese de resina. Os péptidos sintetizados em membrana de celulose pode ser usado, quer directamente para várias aplicações ou péptidos pode ser clivado a partir da membrana e usado como péptidos livres nos ensaios em solução ou para preparar micromatrizes de péptido 10-13. Síntese SPOT é uma variante da síntese de péptidos em fase sólida, o qual utiliza uma membrana de celulose como um suporte sólido e emprega a química padrão Fmoc-10-13. Assim, a síntese das cadeias de péptidos começa na extremidade C-terminal e prossegue em direcçãoa extremidade N-terminal, em contraste com a síntese biológica em ribossomas. Membranas de celulose são funcionalizados para a ligação do primeiro amino ácidos activados (Fig. 1). O método SPOT baseia-se na entrega sequencial de aminoácidos activados em uma gota de solvente para pontos definidos na membrana usando um sistema automático de pipetagem. A gota de líquido é distribuído sobre a membrana porosa, onde forma uma zona molhada circulares, que mais tarde actua como um reactor aberto para as reacções químicas na síntese de péptidos. O tamanho do ponto é determinado pelo volume dispensado e a capacidade de absorção da membrana, múltiplos de tais pontos estão dispostos como matrizes. A escala de síntese está correlacionada com o tamanho do local e a capacidade de carga da membrana. A distância entre os pontos e a densidade das matrizes são geridas através da variação dos tamanhos de ponto. Membrana de celulose tem várias vantagens como fase sólida em síntese de péptidos, que é barato, tolerante ao químicoals utilizados na síntese de peptídeos, estável em soluções aquosas e fácil de manusear. Além disso, a sua natureza hidrofilica a torna adequada para vários sistemas de ensaio biológicos. SPOT síntese pode ser realizada manualmente ou automatizada (para 1000 de peptídeos), dependendo do número necessário de péptidos. Um sintetizador SPOT totalmente automatizado de Intavis (Köln, Alemanha) é usado para as nossas aplicações. Ele permite a síntese de péptidos em quantidades diferentes e de comprimento diferente. Os péptidos lineares são regularmente sintetizado com um comprimento de ácido de 15 a 20 aminoácidos, em adição de péptidos até 42 aminoácidos podem também ser preparados por síntese passo a passo 14,15. No entanto, o aumento do número de aminoácidos leva a reduções nos rendimentos de acoplamento gerais, o que afecta a qualidade dos péptidos. Devido à baixa quantidade de péptidos por local, os produtos são frequentemente difíceis de purificar e a qualidade dos péptidos individuais não podem ser facilmente avaliadas. Portanto, os resultados obtidos a partir de SPOT Peptide matrizes devem ser confirmados quer com péptidos sintetizados através de métodos padrão em maior escala, que podem ser purificados e analisados ​​de acordo com as normas em síntese de péptidos ou por síntese de proteínas que contêm as sequências de péptidos desejados. Ainda assim, encontramos a síntese SPOT para ser altamente confiável e resulta geralmente ser reprodutível. SPOT síntese não é restrita a proteinogenic vários aminoácidos, aminoácidos modificados comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para a síntese, permitindo que os péptidos a ser modificado antes e após a clivagem final do grupo de protecção da cadeia lateral e, além disso, também permite a incorporação de aminoácidos fosforilados, acetilados ou metilados 11. Bibliotecas peptídicas imobilizadas sintetizados pelo método seco pode ser utilizado directamente para muitos ensaios biológicos e bioquímicos. Nós empregamos matrizes péptido compreendendo 300-400 peptídeos para investigar a especificidade de substrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatião, os arrays de péptidos são incubadas com o respectivo PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. A metilação do respectivo substrato é analisada por após a transferência enzimática dos grupos metilo marcados radioactivamente de AdoMet para o substrato péptido através de auto-radiograf ia (Fig. 3). Por este procedimento, as matrizes peptídicos permite o estudo da metilação de diferentes substratos peptídicos, ao mesmo tempo. Uma vantagem importante deste método é que todos os péptidos são metilados em competição, de modo a que durante a fase linear da cinética de metilação, a metilação relativa de cada péptido é proporcional à constante de velocidade catalítica dividida pela constante de dissociação (k cat / K D) da enzima para o respectivo substrato péptido. Portanto, a quantidade de radioactividade incorporada dentro de cada local está directamente correlacionada com a actividade enzimática relativamente a péptido particular. Usando oresultados de uma experiência de metilação matriz péptido, o perfil de especificidade do PKMT pode ser definida e com base neste novos substratos podem ser baseiam. Matrizes de péptidos permite a validação rápida e eficiente custo da metilação de novos substratos para o nível de péptidos. Por isso, as matrizes são preparadas que contêm os novos substratos previstos em conjunto com os péptidos modificados contendo um Ala em vez de Lys nos locais-alvo, assim como péptidos de controlo positivos e negativos. Finalmente, os novos substratos podem ser preparados como proteínas, juntamente com os mutantes, em que o alvo é alterada Lys para Ala e a metilação pode ser confirmada ao nível da proteína. Dependendo dos resultados, este é então seguido por estudos biológicos referentes ao potencial papel da metilação dos substratos de proteínas recentemente descrita.

<table><tbody><tr><td>Etanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Inflamável</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida Síntese de Peptídeos</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Inflamável, Tóxico</td></tr><tr><td>Piperidina &ge; 99% para a síntese de peptídeos</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Inflamável, tóxico, corrosivo</td></tr><tr><td>Oxyma puro (etilo (hidroxiimino) cianoacetato )</td> <td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N, N' -Diisopropilcarbodiimida purum &ge; 98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Inflamável, Tóxico, corrosivo</td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Inflamável, Tóxico, corrosivo</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano 99%</td> <td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Inflamável, Tóxico</td></tr><tr><td>Diclormetano &ge; 99,9%</td> <td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogênico</td></tr> <tr><td> N-Metil-2-Pirrolidona</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Membrana</td></tr> de <tr><td>celulose derivatizada</td> tóxica <td>Intavis AG K & ouml; ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Tóxico, corrosivo</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de amônio</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Pellets tóxicos</td></tr><tr><td>de dodecil sulfato de sódio</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Sintetizador MultiPep tóxico e inflamável</td></tr><tr><td></td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>n.a.Filme</td><td></td></tr> <tr><td>de alto desempenho HyperfilmTM</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>software Phoretix</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

especificidade análise de proteína lisina metiltransferases usando spot peptide arrays

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.

Matrizes de péptidos foram utilizados com sucesso para caracterizar bioquimicamente a especificidade de PKMTs, e foram identificados vários novel histonas e não-histonas substratos de PKMT por esta abordagem 5,16-19. Definindo o espectro substrato correta de um PKMT (ou qualquer enzima) é um passo essencial para a compreensão do seu mecanismo molecular e funções celulares. Como um exemplo da aplicação do método da matriz de metilação péptido SPOT, descrevem-se os resultados da aná...

As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a especificidade do substrato da proteína lisina metil transferases ou PK mts. Isso é obtido pela identificação de um substrato inicial e preparação de matrizes de peptídeos com várias variantes desse substrato contendo trocas de aminoácidos únicos em diferentes posições. Como segunda etapa, o arranjo de peptídeos é incubado com o PKMT na presença de um doador de grupo metil radioativo, o que permite a detecção da metilação do peptídeo por transferência de radioatividade para o ponto peptídico correspondente.Em seguida, a matriz é exposta a um filme de raios-x e analisada quantitativamente para determinar a atividade de metilação em cada um dos peptídeos. E para definir o perfil de especificidade do PKMT, os resultados mostram quais aminoácidos no peptídeo substrato são críticos para sua metilação pelo PKMT. A principal vantagem dessa técnica ou de métodos existentes, como a metilação de peptídeos individuais, é que vários peptídeos diferentes podem ser testados em um experimento de maneira econômica.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metilação do lym de proteínas, como a especificação de novos substratos anteriormente desconhecidos de PK mtss. Portanto, este método pode fornecer informações sobre a especificidade do PK mts. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como proteínas quinases, outro método de proteína, transferases ou adicionar a transferases.Tive a ideia para esse método pela primeira vez quando me familiarizei com a possibilidade de preparar grandes matrizes de peptídeos personalizadas a custos razoáveis usando a síntese de pontos de peptídeos Para iniciar este procedimento, projete sequências de peptídeos para a síntese usando o software multi pep spotter. Insira as sequências de peptídeos como um código de letra única com cada letra definindo o aminoácido específico após este pré-inchaço, a membrana do ponto funcionalizado amino peg na extremidade, final dimetilformamida ou DMF por 10 minutos. Quando terminar, coloque a membrana úmida na estrutura do sintetizador de pontos sem bolhas de ar ou rugas.Seque a membrana completamente por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o programa de síntese. Lave a membrana três vezes com 100% de etanol para gerar a ligação amida com o grupo amino livre na membrana. Ative o grupo carboxi do aminoácido de entrada adicionando DIC e acetato de etil hidroxi amino sino ao derivado de aminoácido.Após a ativação, identifique os volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizada do amino peg usando o robô programável. Repita o passo anterior três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido ativado. Depois de incubar a membrana por 20 minutos, lave-a com DMF para remover os aminoácidos desacoplados após a secagem e o bloqueio dos grupos amino livres.Lave a membrana com DMF quatro vezes e depois incube com piperina a 20% em DMF por 20 minutos para remover o grupo protetor FM. Depois de lavar e secar a membrana, repita as etapas de remoção de manchas e F MOC até que o comprimento do peptídeo desejado seja alcançado. Após a última proteção F MOC grupo D, lave a membrana com DMF e etanol 100%.Em seguida, trate a membrana com 0,02% de azul de fenol em DMF por no mínimo cinco minutos até que fique completamente azul. Após lavar e secar a membrana, retire-a do sintetizador e coloque-a em uma caixa resistente a produtos químicos. Trate-o com 20 a 25 mililitros de uma mistura de proteção de cadeia lateral D, consistindo de ácido tricloroacético a 95% para clivar os grupos de proteção da cadeia lateral e reagentes de limpeza para proteger as cadeias laterais de aminoácidos contra modificações.Depois de garantir que a mistura de proteção profunda cubra a membrana, feche completamente a caixa e incube-a por uma a duas horas, agitando suavemente após a incubação. Lave a membrana seis vezes com 20 a 25 mililitros de di clorometano por dois minutos cada. Depois de lavar duas vezes com etanol 100%, seque a membrana em um desidratado durante a noite.Em seguida, pré-incube a membrana da matriz de peptídeos em um saco plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e amet com grupo metil marcado radioativamente Por 10 minutos, descarte o tampão de pré-incubação e incube a membrana em oito mililitros de tampão de metilação contendo o respectivo PKMT por uma a duas horas. Em seguida, descarte o tampão de metilação em um recipiente de resíduos radioativos e lave as matrizes de peptídeos cinco vezes com 20 mililitros de tampão contendo 100 milimolares de bicarbonato de amônio e 1% STS por cinco minutos para remover a proteína ligada. Depois de descartar o último tampão de lavagem no recipiente de resíduos radioativos, incubar a membrana por cinco minutos em 10 mililitros de solução amplificada.Em seguida, rejeitar a solução amplificada no recipiente de resíduos radioactivos para solventes orgânicos. Sele a matriz de peptídeos em um saco plástico e coloque-a em um de auto-radiografia. Coloque o filme de auto-radiografia no peptídeo em uma sala escura.Em seguida, feche o com cuidado. Depois de expor o filme a 80 graus Celsius negativos, revele-o para analisar os resultados. Finalmente, capture a imagem algumas vezes com diferentes tempos de exposição para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilados.Um exemplo de uma reação de metilação de uma matriz de peptídeos com NSD um é mostrado aqui. O eixo horizontal representa a sequência do peptídeo e na direção vertical. O aminoácido alterado é indicado metilação com nsd, mostra-se que atua especificamente em H três K 36 e reconhece três a quatro resíduos de aminoácidos em ambos os lados da consolidação de lisina alvo dos três experimentos de matriz de peptídeos de NSD um é mostrado aqui.Cerca de 85% dos peptídeos mostram desvios padrão menores que mais ou menos 20% e mais de 97% dos peptídeos demonstram desvios padrão menores que mais ou menos 30% Os dados calculados do fator de discriminação mostram que o NSD um prefere resíduos aromáticos na posição menos dois. Nos locais menos um e mais dois, prefere resíduos hidrofóbicos. E no local mais um, há uma preferência por arginina, lisina, glutamina ou asparagina.Novos substratos peptídicos em potencial podem ser encontrados por pesquisas no banco de dados do proteoma humano. A forte metilação de alguns desses peptídeos com ome confirma sua identidade como novos substratos peptídicos NSD um. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o substrato inicial mais apropriado após este procedimento.Outros métodos, como a metilação das proteínas correspondentes in vitro e nas células, podem ser realizados para descobrir se as proteínas são aceitas como substratos, bem como após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da mesilação de proteína lisina definirem a especificidade do substrato de muitos mts PK e identificarem vários novos substratos. Isso ajudou a entender a importante função biológica da PK mts.Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade e solventes orgânicos na síntese de peptídeos pode ser afirmado, e as devidas precauções devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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