Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a especificidade do substrato da proteína lisina metil transferases ou PK mts. Isso é obtido pela identificação de um substrato inicial e preparação de matrizes de peptídeos com várias variantes desse substrato contendo trocas de aminoácidos únicos em diferentes posições. Como segunda etapa, o arranjo de peptídeos é incubado com o PKMT na presença de um doador de grupo metil radioativo, o que permite a detecção da metilação do peptídeo por transferência de radioatividade para o ponto peptídico correspondente.

Em seguida, a matriz é exposta a um filme de raios-x e analisada quantitativamente para determinar a atividade de metilação em cada um dos peptídeos. E para definir o perfil de especificidade do PKMT, os resultados mostram quais aminoácidos no peptídeo substrato são críticos para sua metilação pelo PKMT. A principal vantagem dessa técnica ou de métodos existentes, como a metilação de peptídeos individuais, é que vários peptídeos diferentes podem ser testados em um experimento de maneira econômica.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metilação do lym de proteínas, como a especificação de novos substratos anteriormente desconhecidos de PK mtss. Portanto, este método pode fornecer informações sobre a especificidade do PK mts. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como proteínas quinases, outro método de proteína, transferases ou adicionar a transferases.

Tive a ideia para esse método pela primeira vez quando me familiarizei com a possibilidade de preparar grandes matrizes de peptídeos personalizadas a custos razoáveis usando a síntese de pontos de peptídeos Para iniciar este procedimento, projete sequências de peptídeos para a síntese usando o software multi pep spotter. Insira as sequências de peptídeos como um código de letra única com cada letra definindo o aminoácido específico após este pré-inchaço, a membrana do ponto funcionalizado amino peg na extremidade, final dimetilformamida ou DMF por 10 minutos. Quando terminar, coloque a membrana úmida na estrutura do sintetizador de pontos sem bolhas de ar ou rugas.

Seque a membrana completamente por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o programa de síntese. Lave a membrana três vezes com 100% de etanol para gerar a ligação amida com o grupo amino livre na membrana. Ative o grupo carboxi do aminoácido de entrada adicionando DIC e acetato de etil hidroxi amino sino ao derivado de aminoácido.

Após a ativação, identifique os volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizada do amino peg usando o robô programável. Repita o passo anterior três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido ativado. Depois de incubar a membrana por 20 minutos, lave-a com DMF para remover os aminoácidos desacoplados após a secagem e o bloqueio dos grupos amino livres.

Lave a membrana com DMF quatro vezes e depois incube com piperina a 20% em DMF por 20 minutos para remover o grupo protetor FM. Depois de lavar e secar a membrana, repita as etapas de remoção de manchas e F MOC até que o comprimento do peptídeo desejado seja alcançado. Após a última proteção F MOC grupo D, lave a membrana com DMF e etanol 100%.

Em seguida, trate a membrana com 0,02% de azul de fenol em DMF por no mínimo cinco minutos até que fique completamente azul. Após lavar e secar a membrana, retire-a do sintetizador e coloque-a em uma caixa resistente a produtos químicos. Trate-o com 20 a 25 mililitros de uma mistura de proteção de cadeia lateral D, consistindo de ácido tricloroacético a 95% para clivar os grupos de proteção da cadeia lateral e reagentes de limpeza para proteger as cadeias laterais de aminoácidos contra modificações.

Depois de garantir que a mistura de proteção profunda cubra a membrana, feche completamente a caixa e incube-a por uma a duas horas, agitando suavemente após a incubação. Lave a membrana seis vezes com 20 a 25 mililitros de di clorometano por dois minutos cada. Depois de lavar duas vezes com etanol 100%, seque a membrana em um desidratado durante a noite.

Em seguida, pré-incube a membrana da matriz de peptídeos em um saco plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e amet com grupo metil marcado radioativamente Por 10 minutos, descarte o tampão de pré-incubação e incube a membrana em oito mililitros de tampão de metilação contendo o respectivo PKMT por uma a duas horas. Em seguida, descarte o tampão de metilação em um recipiente de resíduos radioativos e lave as matrizes de peptídeos cinco vezes com 20 mililitros de tampão contendo 100 milimolares de bicarbonato de amônio e 1% STS por cinco minutos para remover a proteína ligada. Depois de descartar o último tampão de lavagem no recipiente de resíduos radioativos, incubar a membrana por cinco minutos em 10 mililitros de solução amplificada.

Em seguida, rejeitar a solução amplificada no recipiente de resíduos radioactivos para solventes orgânicos. Sele a matriz de peptídeos em um saco plástico e coloque-a em um de auto-radiografia. Coloque o filme de auto-radiografia no peptídeo em uma sala escura.

Em seguida, feche o com cuidado. Depois de expor o filme a 80 graus Celsius negativos, revele-o para analisar os resultados. Finalmente, capture a imagem algumas vezes com diferentes tempos de exposição para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilados.

Um exemplo de uma reação de metilação de uma matriz de peptídeos com NSD um é mostrado aqui. O eixo horizontal representa a sequência do peptídeo e na direção vertical. O aminoácido alterado é indicado metilação com nsd, mostra-se que atua especificamente em H três K 36 e reconhece três a quatro resíduos de aminoácidos em ambos os lados da consolidação de lisina alvo dos três experimentos de matriz de peptídeos de NSD um é mostrado aqui.

Cerca de 85% dos peptídeos mostram desvios padrão menores que mais ou menos 20% e mais de 97% dos peptídeos demonstram desvios padrão menores que mais ou menos 30% Os dados calculados do fator de discriminação mostram que o NSD um prefere resíduos aromáticos na posição menos dois. Nos locais menos um e mais dois, prefere resíduos hidrofóbicos. E no local mais um, há uma preferência por arginina, lisina, glutamina ou asparagina.

Novos substratos peptídicos em potencial podem ser encontrados por pesquisas no banco de dados do proteoma humano. A forte metilação de alguns desses peptídeos com ome confirma sua identidade como novos substratos peptídicos NSD um. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o substrato inicial mais apropriado após este procedimento.

Outros métodos, como a metilação das proteínas correspondentes in vitro e nas células, podem ser realizados para descobrir se as proteínas são aceitas como substratos, bem como após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da mesilação de proteína lisina definirem a especificidade do substrato de muitos mts PK e identificarem vários novos substratos. Isso ajudou a entender a importante função biológica da PK mts.

Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade e solventes orgânicos na síntese de peptídeos pode ser afirmado, e as devidas precauções devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.