Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

O objetivo deste procedimento é internalizar e visualizar biomoléculas como DNA ou proteínas marcadas com flúor orgânico dentro de microrganismos vivos usando um método baseado em eletroporação. Isso é feito primeiro incubando células eletrocompetentes com biomoléculas marcadas com fluorescência antes de transferi-las para um veterinário de eletroporação. Ao aplicar uma alta voltagem através do vete, as formações transitórias de poros na parede celular e na membrana celular permitirão a difusão biomolecular nas células.

Em seguida, as células são incubadas em um meio rico para permitir que se recuperem antes que o excesso de biomoléculas não internalizadas seja removido. Finalmente, as células são transferidas para uma almofada de baixa fluorescência de nutrientes mínimos e, em seguida, uma lamínula de vidro é sobreposta na parte superior para formar um sanduíche de vidro agro. Em última análise, a microscopia de essência é usada para analisar a localização, o padrão de difusão e as propriedades dinâmicas das biomoléculas marcadas dentro das células vivas.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos as limitações da imagem de células vivas. Devido à rápida falha de proteínas fotofluorescentes, como a GFP, raciocinamos que, ao carregar células vivas com biomoléculas marcadas com força fluor orgânica, transplantaríamos microorganismos vivos. As principais vantagens dessa força são brilho, estabilidade fotográfica e tamanho pequeno.

Esperamos então acompanhar a localização e difusão de DNA ou proteínas em seus ambientes nativos em escalas de tempo muito mais longas, o que corresponderia a muitos processos biológicos importantes. A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como a microinjeção, é que também podem ser aplicadas a microrganismos menores que o diâmetro da agulha de microinjeção típica. Uma vantagem adicional da eletroporação é que um grande número de células pode ser carregado ao mesmo tempo com biomoléculas fluorescentes e visualizar em paralelo aquelas que tornam a eletroporação uma técnica particularmente ocular.

Embora este método possa fornecer informações sobre a difusão e o comportamento dinâmico de biomoléculas marcadas com fluorescência in vivo, ele também pode ser aplicado em outros contextos, como biomoléculas de eletrodos que não são marcadas, mas pode, por exemplo, desencadear uma resposta fisiológica quando internalizada pela célula Para construir almofadas de aros para microscopia fluorescente de bactérias ou leveduras, comece preparando cerca de dois meios de fluorescência baixa, Em seguida, derreta uma solução de 2% AROS em água destilada com um micro-ondas de laboratório imediatamente. Adicione um volume correspondente da rosa HA quente ao meio e pipete suavemente a mistura para cima e para baixo. Evitando a formação de bolhas, pipete imediatamente aproximadamente 200 microlitros da mistura levantada em uma lamínula de microscópio de tamanho padrão.

Deixe a lamínula na bancada por um minuto em temperatura ambiente até que o gel solidifique ou armazenamento temporário, coloque uma segunda lamínula limpa sobre a almofada fresca e aplique suavemente pressão de cima para baixo na rosa do ovo, começando com um estoque de biomoléculas fluorescentes preparadas em um tampão de baixa força iônica. Transfira até cinco microlitros das biomoléculas para uma alíquota de 20 microlitros de bactérias competentes ou 50 microlitros de células de levedura competentes. A quantidade de biomoléculas fluorescentes incubadas com as células se correlaciona diretamente com a quantidade de biomoléculas internalizadas por célula.

Após a eletroporação, incube a mistura no gelo por até 10 minutos. Ao mesmo tempo, selecione um vete de eletroporação com espaçamento apropriado entre eletrodos e leve à geladeira. Transfira a mistura de células para o veterinário pré-resfriado.

Bata suavemente no vete algumas vezes para remover quaisquer bolhas da solução. Remova qualquer umidade do vete com uma toalha de papel e coloque o vete no eletrotomador. Aplique um pulso de alta tensão nas células logo após este processo.

Verifique se a constante de tempo exibida no eletroator está entre quatro e seis milissegundos. Constantes de tempo mais baixas geralmente são devidas à presença de excesso de sal ou bolhas dentro do qve, e podem diminuir ou inibir completamente a absorção de biomoléculas nas células. Pulsos de tensão mais alta melhoram a carga celular, mas também podem afetar a viabilidade celular imediatamente após a eletroporação.

Adicione 500 microlitros de rich media e transfira as células para um novo tubo de 1,5 mililitro. Deixe a membrana celular se recuperar incubando as bactérias de 37 graus Celsius ou leveduras de 29 graus Celsius por dois a 10 minutos. Após a incorporação da biomolécula e a recuperação do crescimento, gire as células por um minuto em uma centrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius e descarte o agente supino Reese.

Suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão e repita os processos de centrifugação e remoção e suspensão de buffer resus. Mais três vezes. Essas etapas de lavagem removerão todos os vestígios de biomoléculas não internalizadas da suspensão celular.

No caso de internalização de proteína marcada e etapa de purificação adicional é realizada pipetando a suspensão celular em um tubo de 1,5 mililitro equipado com um filtro de membrana de 0,22 mícron na parte superior. Separe as células do tampão por centrifugação, garantindo que haja líquido suficiente acima do filtro para evitar que as células sequem e descarte o fluxo através da fração. Abaixo do filtro, adicione 500 microlitros de PBS fresco sobre as células e repita a combinação de uma rotação para baixo seguida de uma edição de PBS fresca.

Mais duas vezes. Faça uma rotação final a 3.300 G por um minuto. Para remover a lavagem anterior do PBS, suspenda novamente as células com 150 microlitros de PBS.

Por fim, remova a lamínula superior da almofada aros feita anteriormente. Carregue as células na almofada pipetando 10 microlitros da suspensão da célula gota a gota. Depois de colocar uma nova lamínula limpa em cima da almofada levantada, as células sanduíche estão prontas para microscopia fluorescente.

Controles negativos, como controles não classificados, que foram incubados com biomoléculas marcadas ou células vazias, que não foram eletroclassificadas nem incubadas, também devem ser preparados em paralelo com quaisquer amostras carregadas, as células carregadas podem ser visualizadas em qualquer microscópio de fluorescência apropriado. Enquanto o modo de imagem de campo amplo permite imagens e análises em nível de célula, relva ou alta iluminação baixa ou ideal para observação e rastreamento de molécula única. Para evitar o excesso de fotobranqueamento das biomoléculas, certifique-se de que todas as iluminações a laser no palco estejam desligadas ou bloqueadas com um filtro opaco antes do carregamento da amostra.

Além disso, desligue o ganho da câmera E-M-C-C-G para evitar danos por superexposição à câmera. Para uma configuração de microscópio invertido, coloque o sanduíche de almofada Aris no microscópio stage com o lado coberto da célula voltado para baixo em direção à objetiva inferior. Em seguida, ligue a luz halógena do lado superior e coloque as células em foco no modo de microscopia de luz branca transmitida antes de ligar o laser, tire uma fotografia das células no modo de transmissão de luz branca.

Esta foto será usada como um mapa de referência posicional que se correlacionará entre regiões de fluorescência biomolecular com localizações reais de células dentro do mesmo campo de visão. Para medição de viabilidade, use um aquecedor objetivo ajustado na temperatura ideal e registre imagens sequenciais do mesmo campo de view sob iluminação de luz branca a cada 30 minutos sem mover o palco, desligue a iluminação superior superior e proteja sua amostra de todas as outras fontes de luz ambiente no laboratório. Em seguida, ligue a câmera CCD e inicie a aquisição de dados.

Comece a gravar o íon fluorescente antes de ligar a iluminação do laser. Depois de realizar a microscopia fluorescente, inicie a análise de dados abrindo todas as fotografias com um software de processamento de imagem, como a Imagem J, para começar a normalizar todos os parâmetros fundamentais da imagem, como brilho ou contraste em todas as imagens, pressionando o botão definir e selecione a propagação para todas as outras imagens. A opção um pode verificar qualitativamente se o carregamento celular foi bem-sucedido, pois as células carregadas devem ser significativamente mais brilhantes do que as células não eletroporadas usadas como controle negativo para uma determinada imagem.

Use a ferramenta de seleção à mão livre e circunde diferentes regiões de fluorescência com polígonos desenhados à mão. Compare a intensidade de fluorescência entre todos os polígonos pertinentes escolhendo a opção de medição no menu analisar. Repita esse processo manualmente ou usando um script automatizado para extrair a intensidade por pixel de todas as células em cada amostra e controles negativos.

Quando uma célula com classificação electroeléctrica é carregada com uma ou várias biomoléculas fluorescentes, a sua intensidade média de emissão será superior à intensidade média de uma amostra de controlo negativo. Para avaliar a viabilidade celular, conte manualmente a porcentagem de divisão intacta por células não divisórias e danificadas. No mesmo campo de visão para o qual os dados foram registrados a cada 30 minutos em várias divisões, nem sempre é possível contar o número de biomoléculas internalizadas por célula diretamente, particularmente quando as biomoléculas se difundem rapidamente ou quando as células são carregadas com mais de cinco biomoléculas marcadas.

A análise de fotobranqueamento baseada em células permite a avaliação do número de biomoléculas marcadas por célula em tais condições. Usando o botão de seleção à mão livre, trace o contorno de uma determinada célula fluorescente e extraia e plote a fluorescência da célula bruta em função do tempo devido aos efeitos do fotobranqueamento. O gráfico de intensidade versus tempo será uma curva exponencialmente decrescente, as células fortemente carregadas, mas para células contendo menos de 10 biomoléculas, etapas claras devem ser distinguíveis.

Calcule a autofluorescência média após o fotobranqueamento calculando a média dos valores brutos de intensidade fluorescente perto da parte final plana do experimento, que pode ser, por exemplo, dos últimos 50 a 100 quadros de imagem na série de lapso de tempo. Depois de determinar a intensidade da linha de base também, calcule a intensidade do fotobranqueamento dependente do tempo subtraindo a autofluorescência da linha de base dos dados brutos de fluorescência e, em seguida, bloqueie os dados de intensidade do fotobranqueamento resultantes e quantize a altura de cada etapa manualmente ou usando um algoritmo. Este processo deve ser repetido para várias células exibindo mais de 100 passos no total, a fim de obter uma estimativa precisa da altura média do degrau, este valor corresponde à intensidade unitária de fluoro quatro devido ao branqueamento de um único fluoro quatro.

Finalmente, o número de moléculas internalizadas por célula pode ser calculado dividindo a intensidade celular subtraída da linha de base no tempo igual a zero pelo flúor unitário. Quatro intensidades para este protocolo de eletroporação. A quantidade de DNA ou proteína marcada com fluorescência que pode ser internalizada em bactérias ou leveduras pode ser controlada ajustando a quantidade de sondas de DNA presentes no tampão de eletroporação.

Quando a taxa de internalização biomolecular é alta, o tempo de vida de fotobranqueamento da biomolécula marcada, que pode ser encontrado primeiro plotando a intensidade fluorescente em função do tempo e, em seguida, extraindo sua constante de tempo exponencial, fornece informações sobre a fotoestabilidade dos corantes in vivo. No caso de baixas taxas de incorporação, a quantização da intensidade fluorescente fornecerá um meio para aproximar o número total de biomoléculas dentro de uma determinada célula. A eletroporação também pode ser usada para incorporar proteínas em bactérias ou leveduras.

No caso de proteína marcada com fluorescência. Como os próprios fluoróforos livres podem ser internalizados de forma muito eficiente, é importante remover todo o excesso de fluoróforos livres e não covalentemente ligados do estoque de proteínas. Finalmente, duplamente marcado por nossas moléculas também pode ser internalizado usando nosso método para permitir a observação de trastes de molécula única em células vivas por vários segundos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar e analisar também as amostras de controle, como células não elétricas, que são incubadas com uma biomolécula marcada ou células vazias, que não são eletroporadas nem incubadas com uma molécula marcada. Esses controles nos permitem avaliar o nível de autofluorescência celular e a deficiência das etapas de lavagem e, como tal, são necessários para avaliar se o experimento de eletroporação foi bem-sucedido após seus desenvolvimentos. Essa técnica abriu novos caminhos para pesquisadores no campo da biofísica e da terceira biologia explorarem a difusão e o comportamento dinâmico da biomolécula de rótulo em microrganismos vivos.

E isso em escala de tempo de uma a duas ordens de magnitude maior do que com proteínas autofluorescentes, como GFPs. Ele transferiu a flexibilidade da marcação orgânica d in vivo, tornando os experimentos de ameaça de molécula única muito mais viáveis para o estudo da dinâmica intra e intermolecular em células vivas.