Name: Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Aprenda a internalizar biomoléculas fluorescentes em microrganismos vivos via eletroporação. Este método permite visualizar dinâmicas celulares em tempo real, superando limitações da microinjeção em células pequenas.

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Agradecemos a Stephan Uphoff pelas discussões. 
R.C. foi apoiado pelo Linacre College, Universidade de Oxford. AP foi apoiado pelo Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD), pela Fundação Acadêmica Nacional Alemã e EPSRC. MS foi apoiado pelo Wellcome Trust. ANK foi apoiado por uma bolsa BBSRC do Reino Unido (BB / H01795X / 1) e uma bolsa Starter do Conselho Europeu de Pesquisa (261227).

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Os autores não têm nada a divulgar.

Muitos parâmetros podem variar durante a electroporação de células e de aquisição de dados, dependendo do sistema biológico de interesse e a natureza exacta da experiência (de nível celular ou análise de uma única molécula). Por exemplo, quando electroporating ADN em bactérias de 0,25 a 5 pmol de fragmentos de dsDNA marcados conduz a uma baixa eficiência de internalização, permitindo que uma única molécula de detecção directa (isto é., Sem a necessidade de fotobranqueamento previamente). Acima de 5 pmol dsDNA, as células tendem a ser muito carregado, um regime mais adequado para a análise de uma única célula. Todos os DNAs marcados devem também ser previamente, a fim de eliminar qualquer vestígio de corante livre purificado em gel (fluoróforo não reagiu) a partir da solução de DNA. Além disso, possíveis problemas com a degradação do DNA, especialmente para experimentos smFRET, podem ser tratadas usando DNAs com ácidos nucleicos não naturais, ou motivos que protegem terminais exonuclease acessível como loops hairpin. Outra adjustable em parâmetro de electroporação é a força do campo aplicado durante electroporação. Força Low campo (~ 1 kV / cm) vai levar a uma baixa eficiência de carga apropriado para estudos de molécula única. Maior força de campo (até 1,8 kV / cm) irá aumentar a eficiência de carregamento; No entanto, existe uma correlação inversa entre a intensidade do campo e a viabilidade celular após a electroporação (ver Figura 4). Para referência, uma intensidade de campo normal utilizado para bactérias e leveduras electroporação é ~ 1,5 kV / cm. A constante de tempo, que representa o comprimento deste deterioração, é um parâmetro conveniente para seguir, uma vez que as gotas de constantes de tempo, assim que qualquer formação de arco fenómeno ocorre na cuvete. Em configurações normais, a constante de tempo deve ser superior a 4 ms; valores mais baixos levará a baixa eficiência de carga ou células danificadas, mesmo não-carregados. A maioria dos outros electroporators oferecer graus de liberdade (tais como &quot;truncagem de impulso&quot; ou &quot;forma de pulso&quot;) que pode ser modificado para ajustar tantocarregamento e viabilidade celular. Aplicou-se este método para ambas as bactérias e leveduras, contudo procedimentos semelhantes também deve permitir a internalização de biomoléculas marcadas em células de mamíferos usando o electroporador configurações adequadas desde a sua membrana é, na verdade, menos complexo (única bicamada lipídica), e uma vez que já electroporação foi usado com tais células 21. Quando internalizar proteínas marcadas, todos corante livre precisa ser removido a partir da solução de proteína marcada de electroporação anteriores. As moléculas livres de corantes, devido ao seu menor tamanho, podem ser internalizadas preferencialmente sobre as proteínas de interesse, e são difíceis de discriminar durante a análise de dados (não obstante o seu esperado difusão mais rápida). Como um guia, para uma amostra de proteína marcada orgânica como sendo adequados para a electroporação, a quantidade de corante remanescente livre deve ser inferior a 2% (detectado utilizando um varrimento fluorescente de um SDS-PAGE) 22. Este processo é particularmente importante,como algumas moléculas pode aderir às membranas externas de bactérias ou leveduras a electroporação. A este respeito, a amostra de controlo negativo devem exibir a intensidade de fluorescência por célula claramente mais baixo do que as células electroporadas, idealmente tão baixa quanto o nível de autofluorescência das células vazias (células que não foram incubadas com quaisquer biomoléculas marcadas com fluorescência ou a electroporação, Figura 2). Tal como acontece com dsDNA, a eficiência de internalização proteínas marcadas está relacionada com o valor de biomoléculas adicionados às células antes da electroporação. No entanto, outros parâmetros, tais como o tamanho e carga, desempenhar um papel na internalização. As pequenas proteínas apresentam alta eficiência de internalização, enquanto que as proteínas maiores (até 98 kDa) podem ser internalizados com êxito, mas com uma eficiência mais baixa (Figura 5) 26. O ponto isoelétrico da proteína, potenciais interacções com a membrana celular e os outros parâmetros físico-químicos tambémcélula de carregamento influência durante a electroporação. Como resultado, os usuários precisam otimizar experiências para o seu próprio sistema, sabendo que a concentração inicial de alta proteína marcada (&gt; 50 M) vai lhe dar a melhor chance para o carregamento de sucesso. A electroporação também oferece uma nova ferramenta para perturbar e analisar a função celular mediante a introdução de proteínas e outras biomoléculas para as células (ou marcados ou não marcados). As experiências de ARN polimerase de T7 (Figura 5C) apresentam um exemplo de uma experiência em que se pode introduzir uma biomolécula que pode alterar a expressão de genes in vivo utilizando electroporação. Ao realizar experiências de fluorescência de molécula única, iluminação TIR é geralmente favorecido sobre os outros modos de iluminação, uma vez que oferece a melhor relação sinal-para-ruído de apenas fluoróforos excitantes dentro de uma secção fina sobre a superfície lamela (~ 100 nm). No entanto imagem rotulada biomoléculas difundem dentro microorganismos vivos pode require iluminação mais profundas (até 0,8 mm para E. coli). Iluminação mais profundo é alcançado no modo de Hilo, preservando ao mesmo tempo uma elevada relação de sinal-para-ruído. Por outro lado, a imagem de campo largo é particularmente importante para a análise de fotobranqueamento passo a passo, em que o utilizador está a estimativa do número de moléculas internalizadas por fotobranqueamento toda uma célula carregada com elevado poder de laser e dividindo a intensidade de fluorescência celular inicial pela intensidade unitária produzida por uma única molécula (fotobranqueamento passo único, Figura 3). Widefield imagiologia também é necessário para a molécula de seguimento de longo prazo, a fim de localizar as moléculas de difusão de interesse mesmo que as suas trajectórias cobrir o volume da célula inteira. Neste protocolo, apresentamos como eletroporação, uma técnica padrão para biólogos e bioquímicos para a entrega de ácidos nucleicos em células, constitui um método simples para a entrega de biomoléculas fluorescentes em vários tipos de células. Thé nova, a técnica de alto rendimento oferece uma ferramenta única para observar moléculas marcadas em seu ambiente nativo. Em adição biomoléculas marcadas com fluoróforos que abrange uma ampla gama de comprimentos de onda, a electroporação pode entregar moléculas modificadas com vários grupos químicos, tais como nucleótidos e aminoácidos não naturais, quelantes de metais, agentes de reticulação, e grupos obtido confinando. Se o sistema biológico de interesse não é essencial para o desenvolvimento celular, o gene que codifica para a proteína alvo pode também ser eliminado (ou batido para baixo), assegurando que as proteínas observadas após a internalização representam todos (ou mais) do banco de proteína intracelular . Em essência, eletroporação pode &quot;transplante&quot; a flexibilidade do in vitro bioconjugates em células vivas e, portanto, beneficiar esforços em biologia sintética, biologia de sistemas, e in vivo de detecção de uma única molécula.

A maioria dos estudos de fluorescência dentro de células vivas depender de fusões de proteínas com proteínas fluorescentes (PQ), tais como 1 GFP. Estes marcadores fluorescentes permitir estudos do número de cópias, padrão de difusão ou localização de proteínas envolvidas em processos, tais como a expressão de genes ou de transporte de membrana 2-7. PQ oferecem alta especificidade rotulagem, de fácil aplicação, e estão disponíveis em um grande estoque de variantes com vários photophysical e propriedades químicas 1. No entanto, fluorophores orgânicos continuam a ser a principal escolha para experiências in vitro, devido à sua maior fotoestabilidade (até 100 vezes mais estável que o PQ) 8,9, tamanho pequeno (até 100 vezes menor do que o volume PQ) e facilidade de rotulagem intramolecular (principalmente através do uso de resíduos de cisteína). Todos estes factores são particularmente importantes para uma única molécula de fluorescência e FRET estuda 10. Vários métodos de internalização combining as vantagens da rotulagem orgânica e na detecção vivo foram introduzidas ao longo da última década; No entanto, tais métodos ou empregar polipéptidos relativamente grandes etiquetas (tags por exemplo, TMP, halo, ou 20 kDa SNAP) 11-14, requerem a utilização de aminoácidos não naturais 15, ou estão limitadas a células eucarióticas, grandes único à membrana (por ex. , raspe o carregamento, seringa carregamento, microinjeção) 16-19. Este protocolo descreve um novo, simples e de alto rendimento método internalização que acopla as vantagens de fluoróforos orgânicos com observação in vivo. Para o desenvolvimento desta técnica, foi adaptado do procedimento de electroporação comumente usado para transformar células com o plasmídeo de ADN 20,21 a fim de carregar os microrganismos, tais como E. coli ou S. cerevisiae com biomoléculas rotulados como orgânicos. O protocolo consiste em 4 passos simples: a incubação de células com biomoléculas marcadas,electroporação, a recuperação de células, e lavagem das células para remover biomoléculas não internalizado. Aqui, apresentamos este protocolo eletroporação, bem como os processos de imagem de células e de análise de dados para o estudo de fluorescência baseada em células e única molécula e traste sinais. A electroporação depende de descarregar um campo eléctrico de alta tensão através de uma suspensão de células de força iónica baixa para formar poros da membrana através da qual transientes biomoléculas podem entrar nas células (Figura 1) 20,21. Assim como com a transformação de bactérias ou de leveduras com DNA de plasmídeo, as células têm que ser preparada antes da electroporação a garantir a sua electrocompetency. Este procedimento, que consiste em vários passos de lavagem com água, aumenta a permeabilidade da membrana e diminui a força iónica da solução de células para evitar a formação de arco eléctrico na cuvete de electroporação. Neste protocolo, as células podem ser preparadas como descrito abaixo (Veja PROTOCOLO: 1.1) ou comprados a partir de provedor comercials. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> Figura 1: Representação esquemática do protocolo internalização Da esquerda para a direita:. Adicionar alguns microlitros de biomoléculas marcadas para a alíquota de células electrocompetentes (fragmentos de DNA duplamente marcada e bactérias, neste exemplo); incubar 1 a 10 min em gelo e transferir para uma cuvete de electroporação de pré-arrefecida; electroporate e depois adicionar 0,5-1 ml meio rico para as células imediatamente após; incubar a 37 ° C (ou a temperatura requerida pelo organismo, por exemplo, 29 ° C durante levedura) para permitir que as células recuperar; executar 5 passos de lavagem para remover qualquer excesso de moléculas não-internalizados marcados; ressuspender o sedimento final em 100-200 ul de tampão PBS e pipeta de 10 uL sobre uma almofada de agarose; cobrir o teclado com uma lamela e imagem limpa em um microscópio de fluorescência (no modo de campo largo ou modo HILO). <p class='"jove_content"&gt;' c electrocompetentes s incubadas com as biomol marcadas pouco antes eletropora que podem ser executadas usando electroporators padr encontrados na maioria dos laborat de bioqu imediatamente ap a electropora em meio enriquecido permita sua recupera da lavagem>(Figura 1). O excesso de biomoléculas marcadas não-internalizados é removido em primeiro lugar por lavagem com um tampão contendo uma concentração razoavelmente elevada de sal e um pouco de detergente (Ver PROTOCOLO: 3,3). A presença de sal perturba interacções electrostáticas não-específicos formados por não internalizados biomoléculas marcadas que de outra forma podem colar na membrana exterior. De igual modo, a presença de detergente no tampão de lavagem rompe as interacções hidrófobas não específicas. Enquanto internalização DNA é simples (Figura 2), as precauções devem ser tomadas quando internalizar proteínas marcadas utilizando eletroporação. Em primeiro lugar, a amostra estoque de proteína organicamente marcado ainda pode conter uma pequena percentagem de corante livre. As moléculas livres de corantes são muito menores do que as proteínas e pode, portanto, ser internalizada preferencialmente. Para assegurar que a vasta maioria das moléculas fluorescentes internalizadas observados correspondem à proteína de interesse, a amostra de proteína inicial deve conter menos de ~ 2% de corante livre (Figura 5) 22. O excesso de proteínas marcadas não-internalizadas também pode furar a membrana exterior da célula após a electroporação; este fenómeno é específico para a proteína e deve ser verificada para cada nova proteína. Propomos várias opções que permitem a remoção de proteínas não-internalizado a partir da amostra celular carregado (Ver PROTOCOLO: 3.3.3). Finalmente, as células são ressuspensas num pequeno volume de tampão de fosfato e pipetou-se para uma almofada de agarose, permitindo a sua imagem através de um microscópio de fluorescência. A imobilização sobre almofadas de agarose é um simple e forma eficiente de imagiologia células em uma lamela sem prejudicar sua integridade. A almofada deve conter um meio de cultura de baixa fluorescência. Imagens de células pode ser realizada tanto em microscopia widefield, o total de fluorescência reflexão interna (TIRF) ou utilizando HILO (altamente inclinadas e laminado folha óptica). Na configuração Hilo, o feixe de laser penetra mais profundamente do que a amostra em TIRF, ainda não ilumina toda a amostra como para campo amplo, permitindo uma maior razão sinal-para-ruído de 23. Dependendo da resolução de energia laser e tempo de utilização, biomoléculas internalizados podem ser contadas (utilizando a análise de fotobranqueamento-gradual, Figura 3), localizada, ou rastreados 24-28. Internalização de construções duplamente marcados com um par de fluoróforos FRET permite a quantificação de FRET tanto a uma única célula ou níveis de molécula única (Figura 6). Diferentes parâmetros podem ser variadosdependendo do resultado desejado e o sistema biológico estudado. Em primeiro lugar, a quantidade de material internalizados por células pode ser ajustado através da alteração da concentração de biomoléculas marcadas adicionado à electroporação as células antes (Figura 2). A intensidade do campo electroporação também irá influenciar tanto a eficiência do carregamento e a viabilidade celular; como esperado, enquanto que a eficiência aumenta com o aumento da carga de intensidade de campo, a viabilidade das células electroporadas diminui (Figura 4A). Ambos os parâmetros podem ser quantificados por registo da percentagem de células em divisão e carregado após a electroporação. Este ensaio de viabilidade juntamente com imagens de fluorescência também verifica a observação de biomoléculas internalizados em células vivas e permite a observação contínua ao longo de várias gerações (Figura 4B). Em resumo, este protocolo permite que a internalização de DNA e marcado por fluorescência em moléculas proteicasE. coli ou S. cerevisiae 26. Moléculas individuais marcadas com fluoróforos orgânicos podem ser rastreados com alta resolução espaço-temporal para escalas de tempo uma ordem de magnitude maior do que PQ. Finalmente, este método é compatível com widefield, TIRF e detecção confocal, bem como regimes de excitação por impulsos, tais como Alex (alternando excitação laser 28,29).

<table><tbody><tr><td>Células ElectroMax DH5-alfa Comptent</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>ou qualquer outra bactéria ou levedura eletrocompetante comercial ou de laboratório.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>baixa fluorescência rich media</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporation Apparatus&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>ou qualquer eletroporador clássico para transformação de microrganismos</td></tr><tr><td>Agarose certificada em Biologia Molecular</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>agarose de baixa fluorescência para almofada de agarose</td></tr><tr><td>Lamínulas de microscópio No 1.5 espessura</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>remover partículas de fundo aquecendo lâminas no forno a 500 &deg; C para microscópio</td></tr><tr><td>de fluorescência de molécula única</td> de 1h <td>Construído</td><td></td><td>em casa descrito em REFs</td></tr><tr><td>Software de localização</td> Pacote de <td></td><td>software MATLAB e C++ online personalizado e disponível que pode ser adaptado para análise de localização.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de rastreamento</td><td>Disponível</td><td>online Implementação MATLAB por Blair e Dufresne.&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

internalização e observação de fluorescent biomoléculas em microorganismos vivos via eletroporação

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

A capacidade de estudar biomoléculas in vivo é crucial para entender sua função em um contexto biológico. Uma abordagem poderosa envolve a fusão de moléculas de interesse a proteínas fluorescentes, como a GFP, para estudar sua expressão, localização e função. No entanto, a GFP e seus derivados são significativamente maiores e menos fotoestáveis do que os fluoróforos orgânicos geralmente usados para experimentos in vitro, e isso pode limitar o escopo da investigação. 
Recentemente, introduzimos um método simples, versátil e de alto rendimento baseado em eletroporação, permitindo a internalização de biomoléculas marcadas com fluoróforos orgânicos em microrganismos vivos. Aqui descrevemos como usar a eletroporação para internalizar fragmentos de DNA ou proteínas marcadas em Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiæ, como quantificar o número de moléculas internalizadas usando microscopia de fluorescência e como quantificar a viabilidade de células eletroporadas. Os dados podem ser adquiridos no nível de célula única ou molécula única usando fluorescência ou FRET. A possibilidade de internalizar moléculas não marcadas que desencadeiam uma resposta fisiológica observável in vivo também é apresentada. Por fim, são discutidas estratégias de otimização do protocolo para sistemas biológicos específicos.

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

O objetivo deste procedimento é internalizar e visualizar biomoléculas como DNA ou proteínas marcadas com flúor orgânico dentro de microrganismos vivos usando um método baseado em eletroporação. Isso é feito primeiro incubando células eletrocompetentes com biomoléculas marcadas com fluorescência antes de transferi-las para um veterinário de eletroporação. Ao aplicar uma alta voltagem através do vete, as formações transitórias de poros na parede celular e na membrana celular permitirão a difusão biomolecular nas células.Em seguida, as células são incubadas em um meio rico para permitir que se recuperem antes que o excesso de biomoléculas não internalizadas seja removido. Finalmente, as células são transferidas para uma almofada de baixa fluorescência de nutrientes mínimos e, em seguida, uma lamínula de vidro é sobreposta na parte superior para formar um sanduíche de vidro agro. Em última análise, a microscopia de essência é usada para analisar a localização, o padrão de difusão e as propriedades dinâmicas das biomoléculas marcadas dentro das células vivas.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos as limitações da imagem de células vivas. Devido à rápida falha de proteínas fotofluorescentes, como a GFP, raciocinamos que, ao carregar células vivas com biomoléculas marcadas com força fluor orgânica, transplantaríamos microorganismos vivos. As principais vantagens dessa força são brilho, estabilidade fotográfica e tamanho pequeno.Esperamos então acompanhar a localização e difusão de DNA ou proteínas em seus ambientes nativos em escalas de tempo muito mais longas, o que corresponderia a muitos processos biológicos importantes. A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como a microinjeção, é que também podem ser aplicadas a microrganismos menores que o diâmetro da agulha de microinjeção típica. Uma vantagem adicional da eletroporação é que um grande número de células pode ser carregado ao mesmo tempo com biomoléculas fluorescentes e visualizar em paralelo aquelas que tornam a eletroporação uma técnica particularmente ocular.Embora este método possa fornecer informações sobre a difusão e o comportamento dinâmico de biomoléculas marcadas com fluorescência in vivo, ele também pode ser aplicado em outros contextos, como biomoléculas de eletrodos que não são marcadas, mas pode, por exemplo, desencadear uma resposta fisiológica quando internalizada pela célula Para construir almofadas de aros para microscopia fluorescente de bactérias ou leveduras, comece preparando cerca de dois meios de fluorescência baixa, Em seguida, derreta uma solução de 2% AROS em água destilada com um micro-ondas de laboratório imediatamente. Adicione um volume correspondente da rosa HA quente ao meio e pipete suavemente a mistura para cima e para baixo. Evitando a formação de bolhas, pipete imediatamente aproximadamente 200 microlitros da mistura levantada em uma lamínula de microscópio de tamanho padrão.Deixe a lamínula na bancada por um minuto em temperatura ambiente até que o gel solidifique ou armazenamento temporário, coloque uma segunda lamínula limpa sobre a almofada fresca e aplique suavemente pressão de cima para baixo na rosa do ovo, começando com um estoque de biomoléculas fluorescentes preparadas em um tampão de baixa força iônica. Transfira até cinco microlitros das biomoléculas para uma alíquota de 20 microlitros de bactérias competentes ou 50 microlitros de células de levedura competentes. A quantidade de biomoléculas fluorescentes incubadas com as células se correlaciona diretamente com a quantidade de biomoléculas internalizadas por célula.Após a eletroporação, incube a mistura no gelo por até 10 minutos. Ao mesmo tempo, selecione um vete de eletroporação com espaçamento apropriado entre eletrodos e leve à geladeira. Transfira a mistura de células para o veterinário pré-resfriado.Bata suavemente no vete algumas vezes para remover quaisquer bolhas da solução. Remova qualquer umidade do vete com uma toalha de papel e coloque o vete no eletrotomador. Aplique um pulso de alta tensão nas células logo após este processo.Verifique se a constante de tempo exibida no eletroator está entre quatro e seis milissegundos. Constantes de tempo mais baixas geralmente são devidas à presença de excesso de sal ou bolhas dentro do qve, e podem diminuir ou inibir completamente a absorção de biomoléculas nas células. Pulsos de tensão mais alta melhoram a carga celular, mas também podem afetar a viabilidade celular imediatamente após a eletroporação.Adicione 500 microlitros de rich media e transfira as células para um novo tubo de 1,5 mililitro. Deixe a membrana celular se recuperar incubando as bactérias de 37 graus Celsius ou leveduras de 29 graus Celsius por dois a 10 minutos. Após a incorporação da biomolécula e a recuperação do crescimento, gire as células por um minuto em uma centrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius e descarte o agente supino Reese.Suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão e repita os processos de centrifugação e remoção e suspensão de buffer resus. Mais três vezes. Essas etapas de lavagem removerão todos os vestígios de biomoléculas não internalizadas da suspensão celular.No caso de internalização de proteína marcada e etapa de purificação adicional é realizada pipetando a suspensão celular em um tubo de 1,5 mililitro equipado com um filtro de membrana de 0,22 mícron na parte superior. Separe as células do tampão por centrifugação, garantindo que haja líquido suficiente acima do filtro para evitar que as células sequem e descarte o fluxo através da fração. Abaixo do filtro, adicione 500 microlitros de PBS fresco sobre as células e repita a combinação de uma rotação para baixo seguida de uma edição de PBS fresca.Mais duas vezes. Faça uma rotação final a 3.300 G por um minuto. Para remover a lavagem anterior do PBS, suspenda novamente as células com 150 microlitros de PBS.Por fim, remova a lamínula superior da almofada aros feita anteriormente. Carregue as células na almofada pipetando 10 microlitros da suspensão da célula gota a gota. Depois de colocar uma nova lamínula limpa em cima da almofada levantada, as células sanduíche estão prontas para microscopia fluorescente.Controles negativos, como controles não classificados, que foram incubados com biomoléculas marcadas ou células vazias, que não foram eletroclassificadas nem incubadas, também devem ser preparados em paralelo com quaisquer amostras carregadas, as células carregadas podem ser visualizadas em qualquer microscópio de fluorescência apropriado. Enquanto o modo de imagem de campo amplo permite imagens e análises em nível de célula, relva ou alta iluminação baixa ou ideal para observação e rastreamento de molécula única. Para evitar o excesso de fotobranqueamento das biomoléculas, certifique-se de que todas as iluminações a laser no palco estejam desligadas ou bloqueadas com um filtro opaco antes do carregamento da amostra.Além disso, desligue o ganho da câmera E-M-C-C-G para evitar danos por superexposição à câmera. Para uma configuração de microscópio invertido, coloque o sanduíche de almofada Aris no microscópio stage com o lado coberto da célula voltado para baixo em direção à objetiva inferior. Em seguida, ligue a luz halógena do lado superior e coloque as células em foco no modo de microscopia de luz branca transmitida antes de ligar o laser, tire uma fotografia das células no modo de transmissão de luz branca.Esta foto será usada como um mapa de referência posicional que se correlacionará entre regiões de fluorescência biomolecular com localizações reais de células dentro do mesmo campo de visão. Para medição de viabilidade, use um aquecedor objetivo ajustado na temperatura ideal e registre imagens sequenciais do mesmo campo de view sob iluminação de luz branca a cada 30 minutos sem mover o palco, desligue a iluminação superior superior e proteja sua amostra de todas as outras fontes de luz ambiente no laboratório. Em seguida, ligue a câmera CCD e inicie a aquisição de dados.Comece a gravar o íon fluorescente antes de ligar a iluminação do laser. Depois de realizar a microscopia fluorescente, inicie a análise de dados abrindo todas as fotografias com um software de processamento de imagem, como a Imagem J, para começar a normalizar todos os parâmetros fundamentais da imagem, como brilho ou contraste em todas as imagens, pressionando o botão definir e selecione a propagação para todas as outras imagens. A opção um pode verificar qualitativamente se o carregamento celular foi bem-sucedido, pois as células carregadas devem ser significativamente mais brilhantes do que as células não eletroporadas usadas como controle negativo para uma determinada imagem.Use a ferramenta de seleção à mão livre e circunde diferentes regiões de fluorescência com polígonos desenhados à mão. Compare a intensidade de fluorescência entre todos os polígonos pertinentes escolhendo a opção de medição no menu analisar. Repita esse processo manualmente ou usando um script automatizado para extrair a intensidade por pixel de todas as células em cada amostra e controles negativos.Quando uma célula com classificação electroeléctrica é carregada com uma ou várias biomoléculas fluorescentes, a sua intensidade média de emissão será superior à intensidade média de uma amostra de controlo negativo. Para avaliar a viabilidade celular, conte manualmente a porcentagem de divisão intacta por células não divisórias e danificadas. No mesmo campo de visão para o qual os dados foram registrados a cada 30 minutos em várias divisões, nem sempre é possível contar o número de biomoléculas internalizadas por célula diretamente, particularmente quando as biomoléculas se difundem rapidamente ou quando as células são carregadas com mais de cinco biomoléculas marcadas.A análise de fotobranqueamento baseada em células permite a avaliação do número de biomoléculas marcadas por célula em tais condições. Usando o botão de seleção à mão livre, trace o contorno de uma determinada célula fluorescente e extraia e plote a fluorescência da célula bruta em função do tempo devido aos efeitos do fotobranqueamento. O gráfico de intensidade versus tempo será uma curva exponencialmente decrescente, as células fortemente carregadas, mas para células contendo menos de 10 biomoléculas, etapas claras devem ser distinguíveis.Calcule a autofluorescência média após o fotobranqueamento calculando a média dos valores brutos de intensidade fluorescente perto da parte final plana do experimento, que pode ser, por exemplo, dos últimos 50 a 100 quadros de imagem na série de lapso de tempo. Depois de determinar a intensidade da linha de base também, calcule a intensidade do fotobranqueamento dependente do tempo subtraindo a autofluorescência da linha de base dos dados brutos de fluorescência e, em seguida, bloqueie os dados de intensidade do fotobranqueamento resultantes e quantize a altura de cada etapa manualmente ou usando um algoritmo. Este processo deve ser repetido para várias células exibindo mais de 100 passos no total, a fim de obter uma estimativa precisa da altura média do degrau, este valor corresponde à intensidade unitária de fluoro quatro devido ao branqueamento de um único fluoro quatro.Finalmente, o número de moléculas internalizadas por célula pode ser calculado dividindo a intensidade celular subtraída da linha de base no tempo igual a zero pelo flúor unitário. Quatro intensidades para este protocolo de eletroporação. A quantidade de DNA ou proteína marcada com fluorescência que pode ser internalizada em bactérias ou leveduras pode ser controlada ajustando a quantidade de sondas de DNA presentes no tampão de eletroporação.Quando a taxa de internalização biomolecular é alta, o tempo de vida de fotobranqueamento da biomolécula marcada, que pode ser encontrado primeiro plotando a intensidade fluorescente em função do tempo e, em seguida, extraindo sua constante de tempo exponencial, fornece informações sobre a fotoestabilidade dos corantes in vivo. No caso de baixas taxas de incorporação, a quantização da intensidade fluorescente fornecerá um meio para aproximar o número total de biomoléculas dentro de uma determinada célula. A eletroporação também pode ser usada para incorporar proteínas em bactérias ou leveduras.No caso de proteína marcada com fluorescência. Como os próprios fluoróforos livres podem ser internalizados de forma muito eficiente, é importante remover todo o excesso de fluoróforos livres e não covalentemente ligados do estoque de proteínas. Finalmente, duplamente marcado por nossas moléculas também pode ser internalizado usando nosso método para permitir a observação de trastes de molécula única em células vivas por vários segundos.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de preparar e analisar também as amostras de controle, como células não elétricas, que são incubadas com uma biomolécula marcada ou células vazias, que não são eletroporadas nem incubadas com uma molécula marcada. Esses controles nos permitem avaliar o nível de autofluorescência celular e a deficiência das etapas de lavagem e, como tal, são necessários para avaliar se o experimento de eletroporação foi bem-sucedido após seus desenvolvimentos. Essa técnica abriu novos caminhos para pesquisadores no campo da biofísica e da terceira biologia explorarem a difusão e o comportamento dinâmico da biomolécula de rótulo em microrganismos vivos.E isso em escala de tempo de uma a duas ordens de magnitude maior do que com proteínas autofluorescentes, como GFPs. Ele transferiu a flexibilidade da marcação orgânica d in vivo, tornando os experimentos de ameaça de molécula única muito mais viáveis para o estudo da dinâmica intra e intermolecular em células vivas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Entrega por eletroporação de biomoléculas fluorescentes em células bacterianas

Este vídeo demonstra a técnica de eletroporação que introduz o DNA do plasmídeo codificador de proteínas fluorescentes em precursores de células granulares cerebelares primárias de camundongos.

Entrega de genes in vitro mediada por eletroporação: uma técnica de pulso elétrico para introduzir plasmídeos codificadores de proteínas repórter fluorescentes em células cultivadas

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Biolistic transformação é um método usado para gerar a integração estável de ADN no genoma das oportunistas Cryptococcus neoformans patogénio através de recombinação homóloga. Iremos demonstrar transformação biolística de uma construção, o qual tem o gene que codifica a quinase de etilo fundido com o marcador fluorescente mCherry em C. neoformans.

Transformação Biolistic de uma fluorescente Tagged Gene para o oportunista fúngica Pathogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Compreender a função dos processos essenciais de bactérias é um desafio. Microscopia de fluorescência com corantes de destino específico pode fornecer insights-chave em progressão de crescimento e ciclo celular de células microbianas. Aqui, a Agrobacterium tumefaciens é usado como uma bactéria modelo para destacar métodos para geração de imagens de células vivas para a caracterização de processos essenciais.

Viver a microscopia de fluorescência da célula para observar os processos essenciais durante o crescimento de células microbianas

A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

A eletroporação é o uso de campos elétricos pulsados (PEFs) para criar poros transitórios em culturas de células para introduzir carga molecular. Esta técnica tornou-se recentemente amplamente utilizada em ambientes clínicos e de pesquisa. Aqui, descrevemos técnicas de eletroporação usando o recentemente desenvolvido "Sistema de Citometria de Eletroporação" para realizar microscopia de fluorescência de células vivas.

Um protocolo de citometria de eletroporação para microscopia de fluorescência de células vivas usando cultura de células U2 OS

Aprenda a internalizar biomoléculas fluorescentes em microrganismos vivos via eletroporação. Este método permite visualizar dinâmicas celulares em tempo real, superando limitações da microinjeção em células pequenas.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

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