Name: Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a detectar quebras de DNA e morte celular em músculo esquelético de camundongo usando o método TUNEL com análise semi-automatizada. Esta técnica oferece rapidez e especificidade superior aos métodos tradicionais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo NIH-NINDS grant RO1-NS065895 e NIH-NINDS grant 5-F31-NS076250-02. 
Agradecemos à JHU SOM Microscope Facility pelo uso do criostato.

NOTA: Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram realizadas de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde 26. O protocolo (MO13M391) foi aprovado pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins. 1. Neonatal Rato Sacrifício, Dissection, e Fixação <ol><li> Sacrifique um rato neonatal por inalação de CO2. </li><li> Cortar imediatamente o hindlimb acima do joelho. Até o dia pós-natal aproximadamente 7, os ossos da perna são suaves o suficiente para cortar com tesoura grande laboratório ou lâmina afiada e posteriormente seção em um criostato. </li><li> Inserir o membro posterior em 10 mL de gelo frio paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um tubo de 15 ml. </li><li> Imersão fixar o membro posterior em paraformaldeído durante 4-24 h a 4 ° C. Tecido embrionário requer apenas algumas horass de fixação. <ol><li> Evite fixação mais de 24 horas, pois isso pode reduzir a eficiência TUNEL ensaio. </li></ol></li><li> Cryoprotect o membro posterior por imersão em solução de sacarose. <ol><li> Mudar de paraformaldeído a 10% de sacarose em PBS no mesmo tubo de 15 ml, incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Alterar a 30% de sacarose em PBS, incubar durante a noite a 4 ° C ou até que as pias dos membros posteriores para o fundo do tubo. Tecido podem ser deixadas em sacarose a 30% durante um período mais longo, desde que a sacarose tenha sido esterilizada por filtração. </li></ol></li></ol> 2. Inclusão do Tecido <ol><li> Encher um meio caminho marcado molde a incorporação com a incorporação de média. </li><li> Coloque membro posterior no topo do meio de fixação, com o lado do corte tão perto quanto possível a uma parede do molde. Marque a orientação do membro posterior do lado de fora do molde. <ol><li> Incorporar vários membros posteriores e cortar no mesmo bloco. No entanto, é importante para assegurar que todas as hindlimbs do bloco são orientados paralelamente uns aos outros para obter secções em níveis correspondentes ao longo do eixo do membro. </li></ol></li><li> Cubra hindlimbs com a incorporação de média. Se hindlimbs deslocar ao derramar o meio, re-orientá-los com pinças atraumáticas ou um palito. </li><li> Permitir a incorporação de forma a infiltrar-se o tecido à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. </li><li> Coloque moldes diretamente em gelo seco ou em isopentano em gelo seco para congelar a incorporação médio. Certifique-se de manter o nível de moldes em todos os momentos e evitar o deslocamento do tecido incorporado. </li><li> Mantenha moldes congelados a -80 ° C até que esteja pronto para cortar, por até vários meses. </li></ol> 3. cryosectioning incorporado Limbs <ol><li> Ajuste temperatura da câmara de criostato para -20 ° C, temperatura do objecto a -18 ° C; ajustar a temperatura do objeto para baixo, conforme necessário. </li><li> Equilibrar o bloco de tecido no interior da câmara de criostato para, pelo menos, 30 min. Temp bloco corretoratura é crucial para a qualidade do corte. </li><li> Os cortes transversais a uma espessura de 10 pm ou menos. Seções mais espessos não será totalmente penetrado por reagentes TUNEL. Use a placa anti-roll, lâminas, e ângulo de lâmina (geralmente 5 °) recomendado para o criostato. </li><li> Recolhe secções em lâminas de vidro ou gelatin- vectabond-revestidos à temperatura ambiente. Coloque imediatamente em uma caixa de lâminas em gelo seco. Mantenha a caixa de slides em um recipiente separado com gelo seco colocado perto do cryostat ao alcance do braço. <ol><li> Os cortes transversais de série através do longo eixo do membro, pulando 100-200 mm. Coletar pelo menos três seções adjacentes em cada nível de série. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Ensaio sobre Seções hindlimb usando um kit comercialmente disponível (todos os passos à temperatura ambiente, salvo indicação) <ol><li> Descongele lâminas com cortes à temperatura ambiente e secar durante a noite ou no fim de semana. </li><li> Reidratar seções por immersing lâminas em PBS para 2 x 10 min em uma jarra de Coplin. Seque com um laboratório de limpar, removendo o máximo de líquido ao redor da seção possível. </li><li> Seções permeabilizar <ol><li> Utilizar um não proteolítico, reagente à base de saponina comercial ou 0,5% de Tween 20 e 0,05% de Triton X100 em PBS. </li><li> Coloque o slide em uma câmara de umidade. Uma câmara de humidade é uma simples caixa vazia ponta da pipeta com uma tampa estanque, com água apenas suficiente adicionado para cobrir o fundo da caixa. </li><li> Pipeta reagente suficiente para o slide para cobrir a seção (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Não pipete diretamente na seção, como agitação repetida pode causar a seção para retirar a slide. </li><li> Utilizando uma pinça de ponta romba, coloque um pequeno retângulo de parafilm no topo da seção para se espalhar a gota de reagente e cobrir completamente a seção. Se as bolhas de formar sob a parafilm, levante suavemente-lo fora, seca, e reaplicar. </li><li> Incubar as lâminas com permeabilireagente zação durante 1 hora em câmara úmida coberta. Se as secções começam a levantar a partir do slide, tempo de permeabilização pode ser reduzido para 30 min. </li><li> Lavar as lâminas em PBS em uma jarra de Coplin 2 x 5 min. Os rectângulos parafilme deve flutuar para o topo e pode então ser removido e descartados. </li><li> Usando um laboratório de limpeza, seque o máximo de líquido ao redor das seções quanto possível. </li></ol></li><li> Rotulagem pausa DNA TdT mediada <ol><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de marcação 1x TdT, tampão de marcação suficiente pipeta para o slide para cobrir a secção de tecido (50 ul é suficiente para membros neonatais do mouse). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. Como alternativa, mergulhe o slide no tampão de marcação TdT em um frasco coplin. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer TdT mix rotulagem. O kit inclui cobalto, magnésio, e catiões de manganês; o catião manganês funciona bem em uma variedade de tecidos, incluindo músculo esquelético, sistema nervoso tissues, fígado, pele e osso. </li><li> Para um controlo positivo, adicionar DNase (rotulado &quot;nuclease&quot; no kit) para a mistura de marcação de TdT. Alternativamente, pré-tratamento de uma secção de controlo positivo com ADNase em tampão de nuclease durante 1 hora a 37 ° C, de acordo com as instruções do kit. Mantenha solução DNase e seções tratado com DNase longe de outras seções experimentais para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Para um controlo negativo, omitir enzima TdT da mistura de marcação. </li><li> Usar um toalhete de laboratório para remover tanto tampão de marcação a partir do slide TdT quanto possível. Pipeta TdT mistura de marcação sobre a lâmina (50 ul por ponto), cobrir com uma nova rectângulo de parafilme, e incuba-se a câmara de humidade a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Siga as instruções do kit para fazer tampão de paragem 1x. Usar um laboratório de limpar para remover TdT mistura de marcação a partir do slide, e adicionar ul de tampão de paragem 200-300 para cobrir a secção de tecido, e incuba-se a câmara de humidade durante 5 min. Al<html> ternatively, mergulhe o slide em tampão de parada em uma jarra de Coplin. </li><li> Lava-se a corrediça 2 x 2 min em PBS. Usar um toalhete de laboratório para remover o máximo de PBS a partir do slide quanto possível. </li></ol></li><li> Marcação fluorescente <ol><li> Siga as instruções do kit para preparar solução de etiquetagem fluoresceína para rotular dNTPs em quebras de DNA. Pipeta solução para o slide (50 ul por seção), cubra com um novo retângulo de parafilm, e incubar na câmara úmida por 20 min. </li><li> Wash slides para 2 min em PBS em uma jarra de Coplin. Usar um toalhete de laboratório para remover tanto quanto possível PBS a partir do slide. </li><li> Diluir a Hoechst 33258 corante nuclear de 1 ug / ml em PBS e pipeta sobre a lâmina (100-200 uL é suficiente para cobrir a secção). Incubar na câmara de humidade durante 5 min. </li><li> Lavar 3x durante 5 min em PBS. </li><li> Lamela com Antifade meios de montagem de fluorescência e selar as bordas com unha polonês. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Aquisição de Imagem Digital <ol><li> Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência convencional com DAPI, FITC, e filtros de Texas Red (ou equivalente). Use um objetivo maior ampliação (20x ou 40x) para verificar se a rotulagem foi bem sucedida e núcleos (inteiros ou fragmentados) foram marcadas. Uma objectiva 10X é suficiente para a quantificação de pontos lacrimais TUNEL positivo. </li><li> Coletar imagens da coloração Hoechst, TUNEL, e sinal autofluorescent como três canais de cores falsas separadas combinadas em uma única imagem. Se a etiqueta de TUNEL fluoróforo é verde, do sinal de imagem autofluorescente no filtro vermelho, e vice-versa. <ol><li> Mantenha todas as configurações de imagem equivalente entre os slides para thresholding e quantificação subsequente. Para cada filtro, horários predefinidos e exposição registro, ganho e binning (sem binning é melhor); não usar as configurações de exposição ou de ganho automático. </li><li> Use tentativa e erro para encontrar as configurações de exposição e ganho que melhor capturam a gama de intensidades em todas as lâminas coradas. Certifique-se de que não existem pixels saturadas nas imagens adquiridas, já que esta quantificação viés vontade. </li></ol></li><li> Tome imagens de todo o grupo muscular de interesse. Isso pode exigir várias imagens para ser &quot;costurado&quot; juntos. </li></ol> Análise 6. Imagem <ol><li> Use programas de análise de imagem disponíveis no mercado para analisar imagens digitais de coloração TUNEL. Análise utilizando software comercial é mostrado aqui. Em alternativa, o software ImageJ livre de NIH pode ser usado para analisar a coloração TUNEL. </li><li> Manchar uma seção ao lado da seção manchada de TUNEL com HE (H &amp; E) e dar uma imagem digital de seção plena com um microscópio de campo claro convencional. Use esta imagem H &amp; E em combinação com um atlas de anatomia 5,18,19 traçar as estruturas anatômicas a serem quantificados. </li><li> Com o canal de TUNEL desligado, rastrear manualmente o contorno da área a ser quantificado, utilizandoHoechst e canais autofluorescência de orientação. Converter a área rastreada em uma máscara (um conjunto de pixels selecionados coordena a ser analisado). </li><li> Ligue o canal de TUNEL. Usando a intensidade função limiarizar no programa de análise de imagem, definir o limite inferior a excluir qualquer sinal autofluorescência. </li><li> Aplicar as mesmas configurações de limite para todas as imagens no set estudo. Converso seleções limiarizadas em máscaras. </li><li> Para cada imagem, combinar a máscara da área do músculo ea máscara TUNEL. A nova máscara combinação irá representar sinal TUNEL dentro apenas a área do músculo rastreado. </li><li> Realizar a quantificação da máscara na máscara de combinação para determinar o número de objectos e da área do sinal de TUNEL dentro da área muscular rastreada objeto. Realize esta usando a função de analisador de partículas em ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um método para detectar e analisar quantitativamente a apoptose do ADN associada a danos no músculo esquelético de rato está descrito. O procedimento inclui a colheita de tecidos, coloração TUNEL, aquisição de imagem digital e análise de imagens. Fornecimentos histológicos comuns e ferramentas são necessárias, e um kit especial TUNEL comercial é necessária. Os itens de equipamento grandes essenciais necessários são um criostato, microscópio de epifluorescência, com capacidade de imagem digital, e um sistema de computado...

Terminal desoxinucleotidilo transferase (TdT) dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) é o processo de utilizar a enzima TdT para anexar dUTP a 3 &#39;da dupla e ADN de cadeia simples quebra 12,23. O método TUNEL para detecção de apoptose e DNA dano foi relatada pela primeira vez mais de 20 anos atrás por Gavrieli et al. 1,12,24. Desde então, foi avaliado e otimizado em diferentes preparações de tecido 7,23,27,40. TUNEL foi usado para estudar a morte celular induzida por isquemia de neurónios 6,14,29 e cardiomiócitos 43,44, morte celular neuronal excitotóxica 30,31, e como biomarcador no tratamento da artrite 39. Também tem sido utilizada como um factor de prognóstico e marcador de células tumorais em vários cancros humanos 2,3,15,32,37,38,42. Existem métodos alternativos para a detecção de danos ao DNA e morte celular, mas eles têm desafios técnicos e advertências. Southern blotting pode ser usado para quantifdanos no DNA y em tecido lisados ​​inteiras 7,9-11, mas este método não fornece resolução de nível celular e é difícil de quantificar. O ensaio do cometa é um método baseado em células alternativa que requer a extração de núcleos preservados a partir de células 4,20,28,36. Embora o ensaio do cometa funciona bem em células de cultura isoladas, é muito mais difícil de preparar os núcleos intactos a partir de tecido muscular esquelético 8,21. Tal como acontece com Southern blot, o ensaio do cometa não fornece informações específicas do tipo de células a partir de um homogeneizado de tecido músculo inteiro. Uma outra alternativa para o método de TÚNEL é imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra o ADN de cadeia simples 25,33,41 ou contra proteínas que participam em vias de resposta ao dano de ADN e morte celular (por exemplo, p53, H2AX, e caspases) 13,17,22,40. Tais métodos com base em anticorpos requerem caracterização exaustiva de anticorpos e excelente especificidade do anticorpo para se obter uma elevada relação de sinal-para-fundo. Mesmo quando especificaçãoexistem anticorpos ific, podem exigir a desnaturação da proteína-alvo através de procedimentos de recuperação antigênica 34,35. Enquanto discutimos aqui, recuperação antigênica em resultados de tecido muscular em inaceitavelmente elevado autofluorescência. Ao contrário dos métodos alternativos, TUNEL atinge a detecção de danos do ADN com um sinal alto e baixo fundo, excelente especificidade que pode ser testado com os controlos positivos e negativos simples, boa penetração nos tecidos que não necessitam de recuperação de antigénios, e resolução de nível celular. Além disso, o método de TÚNEL demora cerca de 4 horas para se completar, enquanto que os métodos alternativos tipicamente requerem incubações durante a noite. Estudamos a morte de células do músculo esquelético em um modelo de rato de atrofia muscular espinhal (AME) 10 que foi gerado por Hsieh-Li e seus colegas 16. Para quantificar as células apoptóticas no músculo, temos desenvolvido um método de preparação do tecido, de coloração e quantificação que funciona de forma robusta através skele diferenteTal grupos musculares em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento em ratinhos. Nós usamos um kit TUNEL-rotulagem comercialmente disponíveis e software de análise de imagem disponível no mercado. Temos também utilizado com sucesso o ensaio TUNEL em combinação com coloração de imunofluorescência na medula espinal 10. Os métodos descritos aqui são úteis para investigadores que desejam apreciar a patologia do tecido, os mecanismos de doença, os mecanismos de envelhecimento, e desenvolvimento (pré- e pós-natal) morte celular no músculo esquelético. A técnica de TUNEL é especialmente útil para estudos de lesão e reparação do ADN e morte celular em sistemas-modelo em que apenas um subconjunto de células é afectado e resolução a nível celular é necessária. Este vídeo descreve a dissecção, processamento de tecidos, corte, e com base em fluorescência TUNEL rotulagem de rato músculo esquelético. Ele também descreve um método de semi-automatizado de TUNEL sinal de quantificação.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>19202</td><td>Para os procedimentos descritos aqui, a solução a 4% foi preparada fresca do pó. Pode ser utilizado paraformaldeído de qualquer fornecedor. A solução de formaldeído preparada deve ser armazenada a 4 & C e não deve ser usado após a data de validade (até vários meses). O paraformaldeído é um carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear o paraformaldeído.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Usado para crioproteção de tecido antes do congelamento. Pode ser utilizada sacarose de qualquer fornecedor.</td></tr><tr><td>O.C.T. composto</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Meio de inclusão para crioseccionamento.</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Um criostato Leica CM3050S foi usado para as preparações aqui descritas. Qualquer criostato capaz de cortar 10 &mu; m seções podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Podem ser usadas lâminas de qualquer fornecedor.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>A gelatina é usada para promover a adesão da seção de tecido às lâminas de vidro. Para revestir lâminas de vidro com gelatina, dissolva 2,75 g de gelatina e 0,275 g de alúmen de cromo em 500 ml de água destilada, aqueça a 60 graus; C, mergulhe as lâminas por alguns segundos e deixe secar. Gelatina de qualquer fornecedor pode ser usada. Alternativamente, lâminas pré-revestidas com gelatina podem ser adquiridas.</td></tr><tr><td>Sulfato de potássio de cromo (III) dodecahidratado (alúmen de cromo)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>O alúmen de cromo é adicionado à solução de gelatina para promover a adesão do tecido em lâminas de vidro. É um possível carcinógeno e uma toxina por inalação e contato com a pele. Siga as precauções especificadas na MSDS ao manusear alúmen cromado.</td></tr><tr><td>Reagente de adesão tecidual Vectabond</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Substrato opcional para melhor adesão do tecido às lâminas de vidro; em vez disso, podem ser utilizadas lâminas revestidas com gelatina.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Um detergente usado para permeabilizar o tecido. Tween20 de qualquer fornecedor pode ser usado.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Um detergente usado para permeabilizar tecidos. Triton X100 de qualquer fornecedor pode ser usado.</td></tr><tr><td>Kit de detecção de apoptose TACS 2 TdT fluoresceína in situ</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Kit comercial para rotulagem TUNEL baseada em fluorescência.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(incluído com o kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease tampão</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(incluído com o kit)</td></tr><tr><td>10x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Faça 1x PBS para lavagens e diluições. PBS de qualquer fornecedor pode ser usado.</td></tr><tr><td>Água livre de DNase</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Água de qualquer fornecedor pode ser usada.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Corante nuclear. Qualquer corante nuclear fluorescente azul pode ser usado. Como um corante de ligação ao DNA, o Hoechst é suspeito de ser cancerígeno e deve ser manuseado com equipamento de proteção para minimizar o contato com a pele.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>Pode ser utilizada qualquer outra película hidrofóbica ou lamínula. Disponível em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente com câmera digital</td><td>--</td><td>-</td><td>Qualquer microscópio fluorescente capaz de capturar digitalmente fluorescência vermelha, verde e azul em canais separados pode ser usado.</td></tr><tr><td>Mídia antidesbotamento Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Mídia antidesbotamento de qualquer fornecedor pode ser usada.</td></tr><tr><td>lamínulas de vidro, espessura nº 1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Podem ser usadas lamínulas de qualquer fornecedor. O menor tamanho de 22 x 22 mm é suficiente para seções de pernas de camundongos neonatais.</td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Usado para selar lamínulas. Esmaltes de qualquer fornecedor (incluindo varejistas regulares) podem ser usados. Evite usar esmaltes com cores ou aditivos que possam refletir a luz durante a imagem fluorescente.</td></tr></tbody></table>

detecção e análise de danos no dna em rato músculo esquelético in situ usando o método tunel

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT) trifosfato de desoxiuridina (dUTP) nick end labeling (TUNEL) é o método de usar a enzima TdT para anexar covalentemente uma forma marcada de dUTP a extremidades 3' de quebras de DNA de fita dupla e simples nas células. É um método confiável e útil para detectar danos ao DNA e morte celular in situ. Este vídeo descreve a dissecção, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Ele também descreve um método de quantificação de sinal TUNEL semi-automatizado. As características normais inerentes do tecido e as condições de processamento do tecido afetam a capacidade da enzima TdT de marcar o DNA com eficiência. O processamento de tecidos também pode adicionar autofluorescência indesejável que interferirá na detecção do sinal TUNEL. Portanto, é importante determinar empiricamente os métodos de processamento de tecidos e marcação TUNEL que produzirão a relação sinal-ruído ideal para quantificação subsequente. O ensaio baseado em fluorescência descrito aqui fornece uma maneira de excluir o sinal autofluorescente por subtração de canal digital. O ensaio TUNEL, usado com técnicas e controles apropriados de processamento de tecidos, é um método quantitativo relativamente rápido e reprodutível para detectar apoptose no tecido. Pode ser usado para confirmar danos ao DNA e apoptose como mecanismos patológicos, para identificar tipos de células afetadas e para avaliar a eficácia de tratamentos terapêuticos in vivo.

Com coloração bem sucedido, sinal TUNEL-positivo deve ser brilhante o suficiente para isolar a partir de autofluorescência definindo limites de intensidade. Objetos TUNEL-positivos em baixa ampliação pode aparecer fragmentos irregulares como brilhantes no músculo esquelético (Figura 1A). No entanto, a maior ampliação, alguns objetos TUNEL-positivo com a morfologia apoptótica clássico deve ser observado, se o tipo de morte celular envolvido é a apoptose (Figura 1B). O controlo positivo (...

Este vídeo descreve a dissecação, o processamento de tecidos, o seccionamento e a marcação TUNEL baseada em fluorescência do músculo esquelético de camundongos. Também descreve um método para análise semiautomatizada da rotulagem TUNEL.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar quebras de DNA e morte celular em C dois. Isso é feito pelas primeiras seções de tecido permanente para permitir que os reagentes do túnel entrem no núcleo da célula. Em seguida, a enzima TDT é usada para ligar covalentemente DTPs a três extremidades primárias de quebras de DNA nessas células.Em seguida, o DUTP é marcado com uma sonda fluorescente. Em última análise, o sinal positivo do túnel é quantificado em seções de tecido refletindo a frequência relativa de quebras de DNA nas células. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como southern blotting ou imuno-histoquímica, é que ela é relativamente rápida, específica e fornece uma maneira de eliminar o ruído e a autofluorescência.Comece fixando os membros posteriores isolados em 4% de formaldeído em PBS em um tubo de 15 mililitros e permita que a fixação dure de quatro a no máximo 24 horas a quatro graus Celsius. Apenas duas horas são necessárias se o tecido for embrionário. No entanto, após a fixação, substitua a solução por sacarose a 10% para crioproteger o tecido e incube-o durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, troque a solução para sacarose 30% filtrada estéril e continue a incubação durante a noite ou até que os membros posteriores afundem no fundo do tubo. Ao incorporar, é importante que os membros posteriores estejam completamente submersos no meio de incorporação. Os moldes de incorporação podem ser colocados diretamente em gelo seco ou em pentano isop em gelo seco para congelar o meio.Ao criosseccionar. Os blocos cortam seções de transferência com 10 mícrons de espessura ou mais finas, seções mais espessas não serão penetradas pelos reagentes de rotulagem do túnel. Colete essas seções finas em lâminas de vidro revestidas com gelatina ou vetor à temperatura ambiente.Muito rapidamente, transfira as lâminas para gelo seco para armazenamento. Primeiro descongele uma lâmina de tecido congelado à temperatura ambiente e deixe secar por 16 a 64 horas. Quando a lâmina estiver em temperatura ambiente, reidratar a seção em um frasco de acoplamento cheio de PBS por 10 minutos.Repita esta etapa de reidratação uma vez e, em seguida, seque cuidadosamente a lâmina com um lenço umedecido sem perturbar a seção de tecido para permear a seção, coloque a lâmina em uma câmara de umidade e pipete 50 microlitros de reagentes comerciais à base de saponina não proteolítica na seção. Não pipete diretamente nas seções, pois pode se soltar ou ser danificada. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de filme sobre a seção para espalhar o reagente.Se formarem bolhas, reaplique o filme para. Deixe a lâmina incubar por uma hora após uma hora. Remova os reagentes usando duas lavagens de cinco minutos em PBS e seque com cuidado.Ao lado de rotular quebras de DNA por TDT, use um kit disponível comercialmente. Primeiro, faça o buffer XTDT e pipete sobre a seção. Em seguida, incube a lâmina por cinco minutos na câmara de umidificação.Em segundo lugar, faça uma mistura de rotulagem TDT de acordo com as instruções do kit ou uma lâmina de controle positivo. Adicione DNA à mistura de rotulagem TDT. Para uma lâmina de controlo negativo, omita a enzima TDT da mistura.Agora, usando um lenço, remova o máximo de tampão possível da lâmina e pipete-o na mistura de rotulagem. 50 microlitros devem ser suficientes. Novamente, espalhe a solução com paraforme sem fazer bolhas.Deixe a lâmina incubar na câmara por uma hora agora a 37 graus Celsius. Terceiro, faça o buffer de parada um x de acordo com as instruções do kit. Depois de remover a mistura de rotulagem com o lenço umedecido, adicione entre dois e 300 microlitros da mistura de parada para cobrir completamente a seção.Em seguida, incubar a lâmina durante cinco minutos na câmara. Nenhum filme para é usado nesta etapa. Para remover o buffer de parada, use duas lavagens de dois minutos em PBS.Agora pipete 50 microlitros de solução de marcação de fluoresceína recém-preparada. Na lâmina, aplique o perfil e incube por 20 minutos na câmara, mas agora no escuro. Remova a solução de rotulagem com uma única lavagem de dois minutos em PBS enquanto lava diluir alguns ganchos.3, 3, 2, 5, 8 a um micrograma por mililitro em PBS. Após as lavagens, cubra as seções em um a 200 microlitros da solução diluída dos ganchos. Em seguida, incube a lâmina por cinco minutos, protegida da luz para remover os ganchos para manchar, use três lavagens de cinco minutos em PBS.Em seguida, seque cuidadosamente a lâmina com um lenço umedecido e aplique uma lamínula para obter imagens. Visualize a seção usando filtros dpi, fitzy e Texas red para separar a mancha de ganchos, mancha de túnel e sinais de autofluorescência em três canais de cores falsas em uma única imagem. Padronize e mantenha as mesmas configurações de imagem entre todas as lâminas para que possam ser facilmente comparadas.Não use nenhuma configuração automática de exposição ou ganho para referência anatômica. Use uma imagem de campo claro brilhante de uma seção adjacente do membro posterior corada com h e e no software de análise de imagem. Desligue o canal do túnel.Em seguida, trace manualmente o contorno da área muscular a ser quantificada usando os outros canais. Converta a área traçada em uma máscara. Em seguida, ligue o canal do túnel novamente e ajuste o limite mínimo de intensidade para excluir o sinal autofluorescente.Use o mesmo limite em todas as seções analisadas no estudo. Em seguida, converta os pixels de limite em uma máscara. Em cada imagem, combine a máscara da área muscular e a máscara do túnel do limiar.Isso faz uma representação do sinal do túnel dentro da área muscular traçada. Agora quantifique a máscara combinada para determinar o número de objetos positivos do túnel e a área total de pixels do sinal do túnel dentro do músculo. Use esses valores para análise estatística.Objetos positivos do túnel com baixa ampliação podem aparecer como fragmentos irregulares brilhantes no músculo esquelético. No entanto, em maior ampliação, alguns objetos positivos para túnel com a morfologia apoptótica clássica devem ser observados se o tipo de morte celular envolver essa apoptose. O controle positivo com DNAs D adicionados deve exibir sinal positivo de túnel abundante distribuído uniformemente por todos os tecidos.Na seção. O controle negativo sem a enzima TDT deve ter um fundo de baixa intensidade e mostrar apenas autofluorescência. Com o protocolo descrito, verificou-se que as células ósseas e endoteliais das hemácias contribuíram para o sinal autofluorescente nas seções de membros altos preparadas.O sinal positivo do túnel verdadeiro foi muito mais intenso. Ele pode ser isolado do sinal autofluorescente usando um limite de intensidade de pixel. Outra opção para isolar o sinal do túnel era subtrair digitalmente o canal de autofluorescência vermelho do canal do túnel.Usando esta técnica, morte de células musculares esqueléticas. Em um modelo de camundongo de SMA foi avaliado, a marcação do túnel revelou mais células apoptóticas em camundongos SMA de cinco dias de idade do que nos controles. Ao quantificar a coloração do túnel, essa observação mostrou-se estatisticamente significativa para vários grupos musculares dentro do membro posterior.Uma vez dominada, a técnica do túnel pode ser feita em cerca de quatro horas para gerar resultados quantitativos confiáveis.

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

Neste vídeo, o ensaio TUNEL é realizado para detectar a presença de células apoptóticas em uma amostra. O estudo envolve o uso de uma DNA polimerase especial - desoxinucleotidil transferase terminal - que catalisa a adição de dUTPs marcados ao terminal 3 'de DNA fragmentado, que pode ser observado e identificado sob um microscópio de fluorescência.

Marcação final de dUTP intermediada por transferase terminal - ensaio TUNEL: um método in situ para detectar fragmentação de DNA em células apoptóticas

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

Aqui, propomos um método para obter eficientemente fibras musculares únicas nos estágios iniciais pós-natal do modelo de camundongo Lamin Δ8-11, um modelo muito severo para distrofia muscular Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e Cultura de Miofibra único de um modelo murino de distrofia muscular em emery-dreifuss no desenvolvimento pós-natal antecipado

A eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético é um método viável para modular a expressão genética sem comprometer a contratilidade muscular em camundongos.

Eletroporação do DNA plasmídeo no músculo esquelético do rato

A manutenção da integridade do genoma do ovócito é necessária para garantir a fidelidade genética no embrião resultante. Aqui, apresentamos um protocolo preciso para detectar quebras de fita dupla de DNA em células germinativas femininas de mamíferos.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.

Identificação e análise de progenitores miogênicos in vivo durante lesão muscular esquelética aguda por citometria de massa de célula única de alta dimensão

Injeções locais de um corante mitocondrial marcando mitocôndrias da célula terminal de Schwann in vivo para microscopia confocal. Esse método utiliza prova de conceito demonstrada em tecido muscular esquelético de camundongos com músculo saudável ou doente para fornecer visualização mitocondrial de alta resolução.

Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Aprenda a detectar quebras de DNA e morte celular em músculo esquelético de camundongo usando o método TUNEL com análise semi-automatizada. Esta técnica oferece rapidez e especificidade superior aos métodos tradicionais.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL

Explorar mais vídeos