Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético In Situ Usando o método TUNEL

O objetivo geral deste procedimento é detectar quebras de DNA e morte celular em C dois. Isso é feito pelas primeiras seções de tecido permanente para permitir que os reagentes do túnel entrem no núcleo da célula. Em seguida, a enzima TDT é usada para ligar covalentemente DTPs a três extremidades primárias de quebras de DNA nessas células.

Em seguida, o DUTP é marcado com uma sonda fluorescente. Em última análise, o sinal positivo do túnel é quantificado em seções de tecido refletindo a frequência relativa de quebras de DNA nas células. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como southern blotting ou imuno-histoquímica, é que ela é relativamente rápida, específica e fornece uma maneira de eliminar o ruído e a autofluorescência.

Comece fixando os membros posteriores isolados em 4% de formaldeído em PBS em um tubo de 15 mililitros e permita que a fixação dure de quatro a no máximo 24 horas a quatro graus Celsius. Apenas duas horas são necessárias se o tecido for embrionário. No entanto, após a fixação, substitua a solução por sacarose a 10% para crioproteger o tecido e incube-o durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, troque a solução para sacarose 30% filtrada estéril e continue a incubação durante a noite ou até que os membros posteriores afundem no fundo do tubo. Ao incorporar, é importante que os membros posteriores estejam completamente submersos no meio de incorporação. Os moldes de incorporação podem ser colocados diretamente em gelo seco ou em pentano isop em gelo seco para congelar o meio.

Ao criosseccionar. Os blocos cortam seções de transferência com 10 mícrons de espessura ou mais finas, seções mais espessas não serão penetradas pelos reagentes de rotulagem do túnel. Colete essas seções finas em lâminas de vidro revestidas com gelatina ou vetor à temperatura ambiente.

Muito rapidamente, transfira as lâminas para gelo seco para armazenamento. Primeiro descongele uma lâmina de tecido congelado à temperatura ambiente e deixe secar por 16 a 64 horas. Quando a lâmina estiver em temperatura ambiente, reidratar a seção em um frasco de acoplamento cheio de PBS por 10 minutos.

Repita esta etapa de reidratação uma vez e, em seguida, seque cuidadosamente a lâmina com um lenço umedecido sem perturbar a seção de tecido para permear a seção, coloque a lâmina em uma câmara de umidade e pipete 50 microlitros de reagentes comerciais à base de saponina não proteolítica na seção. Não pipete diretamente nas seções, pois pode se soltar ou ser danificada. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de filme sobre a seção para espalhar o reagente.

Se formarem bolhas, reaplique o filme para. Deixe a lâmina incubar por uma hora após uma hora. Remova os reagentes usando duas lavagens de cinco minutos em PBS e seque com cuidado.

Ao lado de rotular quebras de DNA por TDT, use um kit disponível comercialmente. Primeiro, faça o buffer XTDT e pipete sobre a seção. Em seguida, incube a lâmina por cinco minutos na câmara de umidificação.

Em segundo lugar, faça uma mistura de rotulagem TDT de acordo com as instruções do kit ou uma lâmina de controle positivo. Adicione DNA à mistura de rotulagem TDT. Para uma lâmina de controlo negativo, omita a enzima TDT da mistura.

Agora, usando um lenço, remova o máximo de tampão possível da lâmina e pipete-o na mistura de rotulagem. 50 microlitros devem ser suficientes. Novamente, espalhe a solução com paraforme sem fazer bolhas.

Deixe a lâmina incubar na câmara por uma hora agora a 37 graus Celsius. Terceiro, faça o buffer de parada um x de acordo com as instruções do kit. Depois de remover a mistura de rotulagem com o lenço umedecido, adicione entre dois e 300 microlitros da mistura de parada para cobrir completamente a seção.

Em seguida, incubar a lâmina durante cinco minutos na câmara. Nenhum filme para é usado nesta etapa. Para remover o buffer de parada, use duas lavagens de dois minutos em PBS.

Agora pipete 50 microlitros de solução de marcação de fluoresceína recém-preparada. Na lâmina, aplique o perfil e incube por 20 minutos na câmara, mas agora no escuro. Remova a solução de rotulagem com uma única lavagem de dois minutos em PBS enquanto lava diluir alguns ganchos.

3, 3, 2, 5, 8 a um micrograma por mililitro em PBS. Após as lavagens, cubra as seções em um a 200 microlitros da solução diluída dos ganchos. Em seguida, incube a lâmina por cinco minutos, protegida da luz para remover os ganchos para manchar, use três lavagens de cinco minutos em PBS.

Em seguida, seque cuidadosamente a lâmina com um lenço umedecido e aplique uma lamínula para obter imagens. Visualize a seção usando filtros dpi, fitzy e Texas red para separar a mancha de ganchos, mancha de túnel e sinais de autofluorescência em três canais de cores falsas em uma única imagem. Padronize e mantenha as mesmas configurações de imagem entre todas as lâminas para que possam ser facilmente comparadas.

Não use nenhuma configuração automática de exposição ou ganho para referência anatômica. Use uma imagem de campo claro brilhante de uma seção adjacente do membro posterior corada com h e e no software de análise de imagem. Desligue o canal do túnel.

Em seguida, trace manualmente o contorno da área muscular a ser quantificada usando os outros canais. Converta a área traçada em uma máscara. Em seguida, ligue o canal do túnel novamente e ajuste o limite mínimo de intensidade para excluir o sinal autofluorescente.

Use o mesmo limite em todas as seções analisadas no estudo. Em seguida, converta os pixels de limite em uma máscara. Em cada imagem, combine a máscara da área muscular e a máscara do túnel do limiar.

Isso faz uma representação do sinal do túnel dentro da área muscular traçada. Agora quantifique a máscara combinada para determinar o número de objetos positivos do túnel e a área total de pixels do sinal do túnel dentro do músculo. Use esses valores para análise estatística.

Objetos positivos do túnel com baixa ampliação podem aparecer como fragmentos irregulares brilhantes no músculo esquelético. No entanto, em maior ampliação, alguns objetos positivos para túnel com a morfologia apoptótica clássica devem ser observados se o tipo de morte celular envolver essa apoptose. O controle positivo com DNAs D adicionados deve exibir sinal positivo de túnel abundante distribuído uniformemente por todos os tecidos.

Na seção. O controle negativo sem a enzima TDT deve ter um fundo de baixa intensidade e mostrar apenas autofluorescência. Com o protocolo descrito, verificou-se que as células ósseas e endoteliais das hemácias contribuíram para o sinal autofluorescente nas seções de membros altos preparadas.

O sinal positivo do túnel verdadeiro foi muito mais intenso. Ele pode ser isolado do sinal autofluorescente usando um limite de intensidade de pixel. Outra opção para isolar o sinal do túnel era subtrair digitalmente o canal de autofluorescência vermelho do canal do túnel.

Usando esta técnica, morte de células musculares esqueléticas. Em um modelo de camundongo de SMA foi avaliado, a marcação do túnel revelou mais células apoptóticas em camundongos SMA de cinco dias de idade do que nos controles. Ao quantificar a coloração do túnel, essa observação mostrou-se estatisticamente significativa para vários grupos musculares dentro do membro posterior.

Uma vez dominada, a técnica do túnel pode ser feita em cerca de quatro horas para gerar resultados quantitativos confiáveis.