Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

O objetivo geral deste procedimento é derivar de forma reprodutível o epitélio pigmentar da retina de alta qualidade, ou RPE, de células-tronco. Isso é conseguido primeiro cultivando células-tronco pluripotentes induzíveis até a cofluência. Na segunda etapa, a mídia é alterada para direcionar as células para destinos de EPR.

Em seguida, as células RPE são isoladas das outras células diferenciadas no prato e, em seguida, as culturas são expandidas até que um número suficiente de células seja obtido. Em última análise, a pigmentação escura e as morfologias de paralelepípedos das culturas podem ser usadas para confirmar que as células RPE estão atingindo a diferenciação terminal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a diferenciação espontânea, é que a adição de fatores definidos acelera a diferenciação, o tempo e aumenta o rendimento do EPR.

Até o momento, milhares de roedores foram curados usando células RPE, derivadas de uma variedade IPSA de doenças degenerativas da retina. No entanto, se traduzirmos isso de forma eficiente e eficaz no tratamento de humanos nas clínicas com essas doenças, é absolutamente imperativo que desenvolvamos protocolos reprodutíveis bem estabelecidos, que nos forneçam alta qualidade, alto número de vendas de RPE e IPS A apresentação visual deste método é essencial se apenas uma pessoa puder trabalhar no microscópio sob o capô a qualquer momento, dificultando a visualização da etapa de isolamento. Mitchell Prince, um técnico de pesquisa do meu laboratório, agora demonstrará o protocolo associado aos aspectos de cultura digital do procedimento Para direcionar a diferenciação da cultura de RPE derivada de células-tronco, a linha de células-tronco de interesse em uma camada de células alimentadoras embrionárias de camundongo em duas vezes 10 elevado a seis células por poço de uma placa de seis poços, Permita que as colônias atinjam a fluência do COF e, em seguida, mudem para a alimentação diária com diferenciação.

Meio suplementado com nicotinamida. Após três semanas, comece a adicionar ativo em um ou IDE às alimentações para aumentar a diferenciação do RPE. Duas semanas depois, voltar ao meio de diferenciação e apenas a nicotinamida interrompe as mamadas diárias.

Assim que os indicadores de pH no meio pararem de amarelar no dia seguinte à alimentação, retorne a cultura à incubadora até que apareçam ilhós das células pigmentadas que sejam grandes o suficiente para serem cortados e removidos. Para isolar os ilhós pigmentados próxima camada, os poços de uma placa de 24 poços com uma matriz livre de xeno que imita o ambiente celular natural. Em seguida, preencha quantos poços da placa de 24 poços forem necessários com meios de diferenciação.

E em uma capa de cultura de células, use um escopo de dissecação e um bisturi para cortar cada ilhó pigmentado na parte inferior da placa original em duas a seis peças e pegue as partes pigmentadas com uma pinça afiada e, em seguida, transfira uma a duas peças pigmentadas para cada uma.24. Bem, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três a cinco dias até que as células adiram. Em seguida, comece a mudar a mídia três vezes por semana.

Expanda as células por três a quatro semanas no meio de diferenciação. Continuando a alimentar as células três vezes por semana até a passagem. O RPE adiciona 200 microlitros de solução de dissociação celular sem tripsina pré-aquecida a 37 graus Celsius para separar as células.

Após cinco a oito minutos, pare a reação com meio de diferenciação fresco e, em seguida, ressuspenda as culturas em suspensões unicelulares com uma pipeta de 200 microlitros, agrupando as colônias com poucas células. Em seguida, transfira as colônias dissociadas para tubos de 15 mililitros e gire as células. Resus suspendendo os pellets em três mililitros de meios de diferenciação, cada um transfere as colônias para cada poço de uma placa de seis poços codificada por matriz contendo três mililitros adicionais de meios de diferenciação por poço.

Em seguida, expanda as células por uma a duas semanas até que as células estejam aproximadamente 90% confluentes e separe as células novamente em um mililitro de solução de dissociação, como acabamos de demonstrar. Desta vez. Usando uma pipeta de 1000 microlitros para ressuspender as células, transfira a solução de célula única para um tubo cônico de 50 mililitros.

E depois de girar as células novamente res, suspenda o pellet. Em 18 mililitros de diferenciação, os meios finalmente substituem as células em um recipiente de cultura codificado por matriz para obter o número máximo de células desejadas no número mínimo de passagens para análise posterior a jusante, colônias pigmentadas começam a aparecer após cinco a sete semanas de cultura de linhagem de células-tronco pluripotentes induzíveis. Essas colônias podem continuar a crescer por semanas à medida que as culturas são mantidas.

Quando atingirem um tamanho suficiente, podem ser extirpados manualmente. A excisão cuidadosa para evitar a contaminação com células não RPE facilita muito a geração de culturas de RPE suficientemente puras. Uma vez dominado, um grande número de células RPE pode ser derivado em oito a 12 semanas se a técnica for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado para não contaminar as culturas durante a fabricação de meios e células de alimentação. Depois de assistir a este vídeo, nossa esperança é que muitos de vocês sejam capazes de produzir um grande número de células RPE de alta qualidade a partir do IPS. Esperançosamente, isso facilitará uma tradução mais rápida da bancada para a beira do leito e oferecerá terapias baseadas em células para pacientes que sofrem de doenças neovasculares degenerativas da retina atualmente intratáveis.