Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento
23 de novembro de 2014
A imagem intravital de dois fótons pode ser usada para investigar interações entre diferentes tipos de células na medula espinhal em seu ambiente de tecido nativo em um animal quimérico da medula óssea com uma lesão traumática por esmagamento da medula espinhal da coluna dorsal.
O objetivo geral deste procedimento é observar o movimento e a interação entre microglia, monócitos e outros tipos de células na medula espinhal lesionada. Isso é feito criando primeiro camundongos quiméricos da medula óssea que terão micróglia residente ou macrófagos derivados da medula óssea marcados com um marcador fluorescente. O segundo passo é produzir uma lesão por esmagamento da coluna dorsal na medula espinhal.
Em seguida, os animais são reabertos e a medula espinhal é estabilizada Para imagens multifótons, a etapa final é tirar imagens únicas ou filmes de lapso de tempo dentro da lesão. Em última análise, a análise da imagem mostra o movimento celular e a interação celular com os substratos circundantes. As principais vantagens dessa técnica sobre a técnica tradicional, como cultura de células e tecido fixo, é que as células podem ser visualizadas em seu ambiente complexo natural no animal vivo.
Para esta cirurgia, use animais quiméricos ou transgênicos duplos. Veja o protocolo de texto sobre como rotular células residentes ou derivadas da medula óssea após a indução da anestesia, mantê-lo com flúor ISO de um a 2% para uma taxa de respiração de cerca de 60 a 100 respirações por minuto. Agora, aplique pomadas para os olhos e confirme um plano cirúrgico de anestesia com uma pitada no dedo do pé.
Prepare-se para a cirurgia raspando primeiro a área da medula espinhal e, em seguida, limpando a pele com iodopovidona e esfoliantes com álcool 70%, cubra o animal e faça um orifício para acessar o local da cirurgia. Em seguida, coloque as ferramentas de autoclave em uma cortina estéril. Isso inclui uma pinça número quatro que é fixada a um milímetro entre os dentes e tem marcas a um milímetro das pontas.
Agora poderia abrir a pele na linha média usando uma tesoura de íris, expondo a musculatura. Prossiga com a cirurgia sob um microscópio de dissecação. Ao longo da linha média, corte os músculos das costas onde eles se ligam aos processos dorsais da coluna vertebral com o objetivo de expor a coluna vertebral.
Isso envolve o corte do trapézio e dos ligamentos do grande dorsal. Em seguida, remova os músculos rotadores entre os processos transversos e o processo dorsal para revelar a lâmina da vértebra específica alvo de remoção. Aqui T 10 é exposto.
Prossiga inserindo as pontas do jurado RO no espaço acima e abaixo do processo. Em seguida, levante ligeiramente para se certificar de que as pontas estão bem encaixadas e não muito profundas. Em seguida, feche os jurados RO para remover a lâmina.
Agora, remova todas as partes menores da vértebra restante, ampliando assim a abertura. Usando uma agulha de calibre 30, faça dois furos, um milímetro de distância na dura-máter para fazer um ponto de acesso para a pinça fixa. Em seguida, insira a pinça fixa em um ângulo de 90 graus através da dura-máter, mantendo as marcas nos dentes acima da dura-máter.
Agora, aperte o fórceps por 10 segundos. Faça o aperto de dez segundos mais duas vezes e remova a pinça. Em seguida, molhe um pedaço de gelatina absorvível, esponja comprimida em solução salina e cubra o local da lesão com ela.
Feche o músculo sobre a esponja de gelatina usando suturas de corrida sintéticas não náilon número quatro. Em seguida, use clipes de cinco milímetros para prender a pele. Complete o procedimento com uma injeção subcutânea de 10 microlitros de bupivacaína em 490 microlitros de solução salina por um miligrama por quilograma.
Em seguida, injete cinco microlitros de buprenorfina no músculo glúteo por 100 microgramas por quilograma. Pós-operatório. Aqueça o animal e monitore-o até que ele recupere a consciência. Para reabrir o animal para exames de imagem, induza a anestesia como antes e, em seguida, remova os clipes da ferida de acordo com o fabricante e as instruções.
Se necessário, aplique um produto de depilação na área ao redor da incisão. Desta vez, aplique esfoliantes extras com iodopovidona e álcool 70%. Agora, reabra a pele ao longo da incisão anterior.
Remova as suturas restantes e abra os músculos com uma pinça usando uma tesoura conforme necessário. Sob o microscópio de dissecação, use a tesoura para fazer bolsas para os grampos da medula espinhal ao longo dos processos transversos da vértebra, um nível acima da laminectomia e um nível abaixo da laminectomia. Insira os grampos do estabilizador da medula espinhal ao redor de cada vértebra e aperte os grampos.
Ajuste as pinças para que a medula espinhal fique paralela à plataforma de imagem e o tecido fique estável. Se um artefato respiratório for visto, ajuste os grampos para minimizar o movimento. Em seguida, cubra os grampos e paraforme.
Em seguida, remova delicadamente a espuma de gel usando uma pinça. Remova o máximo possível. Além disso, remova qualquer tecido cicatricial espesso sobre as meninges que possa estar presente.
Depois que toda a espuma de gel for removida, cubra a medula espinhal com solução salina. Se for observado sangramento, use uma esponja de gelatina para estancar o sangramento. Se necessário, use cauterização durante a cauterização.
Tenha cuidado para não tocar na medula espinhal e mantenha-a coberta com solução salina e espuma de gel. Agora crie um poço para segurar o fluido de imersão, sele a pele e os tecidos com adesivo de cianoacrilato. Em seguida, construa um poço de acrílico dental entre os dois grampos.
Dê tempo ao poço para curar. Depois de curado, encha o poço com LCR artificial. Continue monitorando o sangramento durante essas etapas.
Neste ponto, opcionalmente, injete matrizes de vasos fluorescentes na veia da cauda. Para destacar os vasos sanguíneos durante a imagem, use uma fita DExT fluorescente acima de 70 kilodalton pontos quânticos ou lectinas marcadas com fluorescência. Durante a imagem, mantenha o mouse a 37 graus Celsius em um ambiente controlado No estágio do microscópio, as etapas mais críticas para uma preparação bem-sucedida são garantir que a medula espinhal esteja limpa, sem sangramento e que não haja nenhum artefato respiratório visível.
Periodicamente, durante a imagem, verifique o nível de anestesia monitorando a respiração do animal, que deve estar entre 60 e 100 respirações por minuto. Corrija a anestesia ajustando os níveis de flúor ISO. Após a imagem, retorne o animal ao local da cirurgia, remova os grampos espinhais e puxe o acrílico da pele.
O camundongo pode então ser fechado para imagens posteriores no final da cirurgia inicial ou ser sacrificado cinco dias após a lesão. Os locais de inserção do fórceps ainda são visíveis, mas a lesão começou a aumentar de tamanho devido à lesão secundária causada pela inflamação. Os axônios na extremidade da lesão se retraíram do local inicial da lesão.
Ao mesmo tempo, um grande influxo de células positivas CX três C one, microglia ou macrófagos, pode ser visto infiltrando-se dentro e ao redor da lesão por esmagamento para discernir o comportamento dessas células dentro do microambiente da lesão, um modelo de quimera de radiação foi usado primeiro. As células progenitoras da medula óssea de um camundongo CX três CR e um GFP positivo foram substituídas por células doadoras não fluorescentes, de modo que apenas a micróglia residente do SNC positiva para GFP seria visível. Em segundo lugar, as células progenitoras da medula óssea em um camundongo não fluorescente foram substituídas por células da medula de um camundongo CX três CR e uma GFP positiva para visualizar as células derivadas da medula óssea.
Antes da lesão, as únicas células positivas para GFP derivadas da medula óssea detectadas eram em grande parte paravasculares, que foram relatadas como sendo continuamente substituídas da medula óssea após a lesão por esmagamento. CX três células C uma GFP positivas estão aumentadas ao longo do interior dos vasos sanguíneos ao redor da lesão. Além disso, o centro da lesão foi preenchido com macrófagos infiltrantes CX três CR e GFP positivos.
Usando essa técnica, diferentes animais transgênicos podem ser usados para rotular outras populações de células fluorescentes para identificar suas interações tanto na medula espinhal quanto em outros modelos de doenças.
Visão Geral
Este estudo utiliza a imagem intravital de dois fótons para explorar as interações entre diversos tipos celulares na medula espinhal dentro de um modelo animal vivo. Especificamente, foca-se na dinâmica de micróglias e monócitos no contexto de uma lesão traumática da medula espinhal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imagem in vivo
Contexto
- A imagem de dois fótons permite a observação em tempo real de interações celulares.
- Camundongos quiméricos de medula óssea são utilizados para diferenciar células residentes de células derivadas da medula óssea.
- Lesões traumáticas da medula espinhal fornecem um modelo para estudar respostas celulares em um ambiente complexo.
- Este método oferece vantagens em relação às técnicas tradicionais ao preservar a arquitetura natural do tecido.
Objetivo do Estudo
- Observar o movimento e a interação de micróglias e monócitos em uma medula espinhal lesionada.
- Avaliar o comportamento celular em um organismo vivo após lesão.
- Ampliar a compreensão da dinâmica celular nas respostas neuroinflamatórias.
Métodos Utilizados
- Criação de camundongos quiméricos de medula óssea com células marcadas fluorescentemente.
- Indução de lesão por esmagamento na coluna dorsal na medula espinhal.
- Imagem multiphoton para capturar interações e movimentos celulares.
- Monitoramento e imagem pós-operatórios em condições controladas.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida das interações entre micróglias e monócitos em tempo real.
- Mostrou o movimento celular dentro do local da lesão.
- Destacou as vantagens da imagem in vivo em comparação com métodos tradicionais.
- Forneceram informações sobre as respostas celulares após lesão medular.
Conclusões
- A microscopia de dois fótons é uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica celular in vivo.
- O estudo aprofunda o entendimento dos processos neuroinflamatórios em lesões da medula espinhal.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes achados para explorar intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa abordagem de imagem intravital permite a visualização em tempo real da dinâmica das células imunes na lesão medular traumática, fornecendo insights mecanicistas sobre os processos neuroinflamatórios. Ao distinguir micróglias de macrófagos in vivo, o método apoia a validação de alvos e a redução de riscos de estratégias imunomoduladoras em modelos pré-clínicos de doenças do SNC. A técnica aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta ao capturar interações celulares dentro de um microambiente de lesão fisiologicamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os padrões de infiltração e interação de micróglias e macrófagos após lesão por esmagamento da coluna dorsal.
- Valor Operacional: Utiliza modelos quiméricos de medula óssea para isolar micróglias residentes do SNC de macrófagos derivados da medula óssea, possibilitando a investigação específica de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao visualizar respostas celulares em um sistema vivo, diminuindo a dependência de sistemas de cultura artificiais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera dados quantitativos e com resolução temporal sobre o movimento celular e a interação no local da lesão.
- Valor Operacional: Estabelece uma plataforma de imagem reprodutível para o acompanhamento longitudinal da dinâmica das células imunes após lesão.
- Prontidão do Ensaio: Permite a visualização padronizada de populações celulares positivas para CX3CR1 como biomarcador de ativação inflamatória.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a progressão da lesão secundária e a infiltração de células inflamatórias relevantes para a patologia humana da medula espinhal.
- Valor Operacional: Facilita sessões de imagem longitudinal para avaliar o impacto terapêutico sobre a dinâmica celular ao longo de dias a semanas.
- Continuidade Translacional: Conecta o engajamento de alvos na fase de descoberta com a avaliação de eficácia pré-clínica por meio de leituras fenotípicas consistentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta da neuroinflamação, apoiando a validação precoce de alvos por meio de triagem fenotípica e permitindo acompanhamento mecanicista em modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o envolvimento de células imunes na lesão da medula espinhal por meio da observação direta do comportamento de micróglias e macrófagos.
- Triagem: Fornece dados quantitativos de imagem, como velocidade celular, densidade de infiltração e frequência de interações, para triagem de compostos.
- Análise: Oferece conjuntos de dados espaço-temporais que permitem comparação estatística de fenótipos celulares entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se a estratégias de biomarcadores ao acompanhar a dinâmica de células positivas para CX3CR1 como indicador da resposta neuroinflamatória.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem intravital reutilizável, aplicável a diversos modelos de doenças do SNC além da lesão medular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao revelar insights mecanicistas sobre interações neuroimunes in situ.
- Valor Operacional: Promove a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de preparação cirúrgica, estabilização e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao reduzir a incerteza biológica sobre os mecanismos de ação de imunomoduladores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapias direcionadas ao SNC com base no engajamento validado do alvo em sistemas relevantes para a doença.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia de camundongos, microscopia de dois fótons e geração de quimeras de medula óssea.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo lasers sintonizáveis, estabilizadores da medula espinhal e estágios de imagem com controle de temperatura.
- Necessita coordenação interdisciplinar entre equipes cirúrgicas, de imagem e de cuidados com animais para o preparo consistente das lesões.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo a outros contextos de lesão neuronal ou doenças neurodegenerativas.
- É limitado pelas janelas de sobrevida pós-operatória e pelos desafios técnicos em manter a estabilidade da medula espinhal durante a imagem longitudinal.
