Name: Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprenda um método de manuseio seguro para ratos cotton que reduz o estresse durante a captura. Esta técnica utiliza tubo de enriquecimento e cesto de aço para transferência, melhorando o bem-estar animal em pesquisas pré-clínicas.

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Breanne Cuddington é bolsista da Canadian Breast Cancer Foundation. Este trabalho foi patrocinado por subsídios operacionais da Cancer Research Society e do Canadian Cancer Society Research Institute (anteriormente Canadian Breast Cancer Research Alliance). Agradecemos a Ann Tollefson (Escola de Medicina da Universidade de Saint Louis) pelas células LCRT e à Dra. Kathleen Delaney e Marion Corrick pela assistência técnica com alojamento e sedação de ratos de algodão.

NOTA: Os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso Conselho de Ética de Pesquisa animal institucional da Universidade McMaster, de acordo com a Canadian Council on orientações de cuidados Animal. Os experimentos foram realizados nas instalações de McMaster University animal Central. 1. A cultura LCRT Cells <ol><li> Cultura de células LCRT em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Manter as células em frascos T-150 de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. Células de passagem quando eles formam uma monocamada confluente a 90% (a cada 2-3 dias, a Figura 1). </li><li> 1x fosfato de pré-aquecer solução salina tamponada (PBS), 1x tripsina e meio num banho de água a 37 C ° durante 10 min antes da divisão das células. </li><li> Aspirar o meio do balão e lavar as células com 5 ml de PBS 1x. </li><li> Depois de enxaguar, aspirar PBS e incubaras células com 2 ml de 1x tripsina até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. </li><li> Manter as células em um frasco T-150 semeando 1 ml de suspensão de células para 24 ml de meio (para um total de 25 ml por T-150) e um balão de rocha suavemente de lado a lado. Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2 até separação seguinte. </li></ol> 2. Avaliação de replicação do vírus e citotoxicidade nas células LCRT <ol><li> Replicação do vírus NOTA: as construções de vírus que expressam um marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), sob o controlo de promotores virais endógenos facilitar a visualização da infecção pelo vírus e espalhado utilizando leitores de placas de fluorescência. <ol><li> Células LCRT semeado em placas de cultura, deixando um poço para contagem. Semear as células de modo a que eles vão ser de 80-90% de confluência no dia seguinte. Usar uma concentração de 10 5 cells / ml (100 ul por poço) para produzir o desejado confluência um dia mais tarde em placas de 96 poços de fundo plano. </li><li> No dia seguinte, pré-aquecer 1x PBS, 1x tripsina, meio completo e isento de soro em um banho de água a 37 C ° durante 10 min antes de se iniciar o experimento. </li><li> Aspirar o meio da contagem das células bem e lavar com 5 ml de PBS 1x por balançar-o sobre a superfície do poço. </li><li> Após lavagem, as células aspirado PBS e incubar com 2 ml de tripsina 1x até células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em um volume apropriado de meio completo para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes da inoculação do hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Determinar o volume de caldo de vírus necessária para a infecção na desejada multiplicidade de infecção (MOI). Necessário Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células plaqueadas * MOI(Ufp / célula) Volume de estoque de vírus required = necessária UFP / virus estoque título (ufc / ml) </li><li> Prepare inoculo de vírus em meio isento de soro em tubos. Misture bem em vórtice ou pipeta antes de adicionar inóculo para as células. </li><li> Infectar as células durante 1 hora a 37 ° C, após o que se aplica uma sobreposição de manutenção de DMEM + FBS a 1%. </li><li> Placas de digitalização um e dois dias após a infecção (pi) para visualizar fluorescência da GFP. </li></ol></li><li> Virus Cytotoxicity NOTA: Realize o ensaio resazurina citotoxicidade sob condições de pouca luz como o composto é fotossensível. A forma das cavidades contendo só deve ser incluído para corrigir para a fluorescência de fundo. <ol><li> Prepara-se uma solução a 5% (v / v) de resazurina em PBS 1x. Misture a solução por pipetagem. </li><li> Aspirar o meio das células e aplicar a solução de 5% de resazurina. Incluir um médio bem contendo apenas para corrigir a fluorescência de fundo. </li><li> Incubar as células durante 30 min a 37 ° C, depoisque ler a fluorescência utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação 530 nm, emissão 595 nm). </li><li> Analisar dados em relação aos controles não infectados corrigindo para fluorescência de fundo. </li></ol></li></ol> 3. Habitação e Manuseio <ol><li> Habitação e Diet <ol><li> Ratos Casa de algodão individualmente para diminuir no combate em gaiolas de ratos de policarbonato contendo cama de roedores (1/8 &quot;cama sabugo de milho), uma seção de tubo de PVC não mais de 8 polegadas e nestlets como enriquecimento (Figura 2). </li><li> Use um cesto de aço securable para sentar overtop da gaiola e conter alimentos de roedores e uma garrafa de água. NOTA: Esta configuração permitirá gaiola para captura segura e fácil de os animais, com a colocação do tubo de enriquecimento contra a extremidade da gaiola ser da maior importância. </li></ol></li><li> Manipulação <ol><li> Lidar com ratos de algodão na parte da manhã, antes de rodadas por técnicos das instalações dos animais para evitar emocionante-los antesum procedimento. </li><li> Durante todos os procedimentos, usar luvas de couro grosso para proteção. </li><li> Como os animais permanecem principalmente nos tubos de enriquecimento, utilizá-los para transferir os ratos a uma nova gaiola durante a limpeza de rotina. Como alternativa, abrir a gaiola um pouco para permitir que o manipulador para chegar ao seu lado dentro, o animal pode ser contido por scruffing a pele um pouco acima dos ombros e empurrando para baixo. Cuidados prática para não usar força excessiva quando o animal pode morder a língua. </li><li> Seja paciente e use uma mão firme como os animais têm uma forte resposta de fuga ou luta e vai tentar evitar a captura por correr e saltar para fora da gaiola. É importante ressaltar que não lidar com os animais pelo rabo como degloving irá ocorrer. </li><li> Armadilha os animais em seus enriquecimentos câmaras de ar sobre manipulação directa. Isso diminui drasticamente os ferimentos e escapar. </li></ol></li></ol> 4. Capturar e Anestesia <ol><li> Captura <ol><li> Usar luvas de couro grosso para proteçãoião positivo durante todos os procedimentos. </li><li> Utilizar um grande recipiente de plástico transparente com furos para o ar e uma tampa, uma câmara de indução anestésica suficientemente grande para se encaixar no recipiente e um cone de nariz montado no tubo de saída de gás (Figura 3). </li><li> Trabalhar em pares para tornar o processo mais eficiente e para diminuir o tempo de exposição dos animais ao isoflurano, um anestésico por inalação. Certifique-se de um pesquisador é responsável pela abertura e recolocar a tampa de aço sobre a gaiola e a tampa da câmara de indução (manipulador # 1) e seu associado é responsável pela captura do animal no tubo e transporte para a câmara de indução (manipulador # 2). </li><li> Coloque a gaiola sobre uma superfície plana e remover a tampa exterior. Levantar o tabuleiro de alimentação de aço ligeiramente e manobrar-se lentamente o tubo de enriquecimento por isso é paralelo com os lados da caixa e contra as costas. Se necessário, utilizar um objecto para manobrar o tubo de enriquecimento sem abrir a gaiola para evitar que o animal se agita (manusearr # 1). </li><li> Se o animal torna-se agitado e deixa o tubo, dá tempo suficiente para que o animal relaxar e, mais uma vez se estabelecer no tubo (manipulador # 1). </li><li> Lentamente e deliberadamente levantar a aresta da tampa de aço do tubo de enriquecimento, mantendo a outra extremidade em contacto com a gaiola. Faça um espaço grande o suficiente para o recipiente de plástico (manipulador # 2). </li><li> Em um movimento rápido e suave, empurre o recipiente de plástico overtop do tubo de enriquecimento. Manter o recipiente de contacto com o lado da gaiola, prendendo o animal no tubo. Realize os passos 4.1.6 e 4.1.7, o mais rapidamente possível (manipulador # 2). </li><li> Retire a bandeja de alimentação de aço e dar a tampa do recipiente de plástico para manipulador # 2 (manipulador # 1). Deslize a tampa de plástico entre o lado da gaiola e do recipiente, sendo conscientes de apêndices do animal preso no processo. Não selar o recipiente, pois isso fará com que o próximo passo mais difícil (manipulador # 2). </li></ol></li><li> AnesthesIA <ol><li> Certifique-se o recipiente permanece fechado e transportar o animal à câmara de indução. Rapidamente colocar o animal na câmara e remover a tampa do recipiente com um movimento fluido (manipulador # 2). Abra e substitua imediatamente a tampa da câmara de indução (manipulador # 1). </li><li> Ligue o fluxo de isoflurano para a câmara de indução (5 L / min) e monitorizar o animal quanto a sinais de letargia, altura em que deslizam rapidamente o animal a partir do tubo e o recipiente, tanto a remoção da câmara de indução para facilitar a circulação do gás. </li><li> Quando o rato é completamente anestesiados, movê-la para a superfície de trabalho e colocar o nariz e boca para o cone de nariz (Figura 3). O rato é totalmente anestesiado quando ele não responde a uma pitada toe forte. </li><li> Coloque vet vaselina pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secura e escoriações. Este é um passo essencial como ratos do algodão têm olhos grandes que podem ser propenso a infecção se ocorrer lesão. </li> &lt;li&gt; monitorizar cuidadosamente e manter uma taxa de respiração constante e garantir que o nariz do animal permanece no cone do nariz ao longo do procedimento de montagem. Ajustar o caudal de isoflurano apropriadamente. A quantidade de isoflurano necessária para anestesiar cada animal irá variar. </li><li> Pós-procedimento, devolver o animal para sua gaiola e garantir que ele recupere a mobilidade total e decúbito esternal. </li></ol></li></ol> 5. Preparação de Células LCRT para a Formação de Tumores subcutânea NOTA: Um balão T-150 de LCRT (90% de confluência) rende aproximadamente 2 x 10 7 células. Baseie o número de T-150 frascos necessários sobre o número total de células necessárias. Semente frascos adicionais para assegurar o número total de células necessárias é obtido e para acomodar células perdidas durante a preparação e os necessários para injecções extras. Mantenha as células no gelo sempre que possível para prolongar a viabilidade celular. <ol><li> Para colher as células, o meio aspirado a partir de um frascod células Lavar com 5 ml de 1x PBS. </li><li> Aspirar PBS e incubar as células com 2 ml de 1x tripsina até que as células dissociar-se do frasco (~ 2 min). </li><li> Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. Continuar a colheita de células de frascos adicionais. </li><li> Piscina todos suspensões de células em um tubo cônico, cerca de 4 T-150s por tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o meio e ressuspender o sedimento de células no volume apropriado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes de carregar o hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Calcula-se o número total de células: Número total de células colhidas = contagem de células (células / ml) x volume de ressuspensão (ml) </li><li> Determinaro volume de suspensão de células necessário para todas as injecções. Faça 2-3 doses extras por experimento. Um total de 5 x 10 5 células LCRT injectados subcutaneamente irá formar tumores palpáveis ​​dentro de 3-4 dias. Número total de células necessárias = 5 x 10 x 5 células número total de doses Suspensão de células volume requerido (ml) = (número total de células necessárias * soma dos volumes de injecção) / (número total de células colhidas) </li><li> Pipete o volume pretendido de suspensão de células para um tubo cónico contendo PBS e homogeneizar. Alíquotas individuais injecções (100 ul) em tubos Eppendorf. Manter tubos em gelo durante o procedimento de injeção. </li></ol> 6. Injeções Observação: executar procedimentos com dois pesquisadores, um para executar as injeções, enquanto os outros monitores taxa de respiração do animal e condição geral e sob anestesia. Use seringas de insulina (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) para todas as injeções e uma nova agulha paracada animal. <ol><li> As injecções subcutâneas <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Raspar o local da injecção usando cortadores. Pele de rato Cotton é grosso e requer um aparador afiada para obter uma superfície lisa para injectáveis. Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com as células por elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo do êmbolo de pressão até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Levantar a pele no local da injecção (referido como pele de acampamento) e inserir a agulha de bisel virado para cima. Certifique-se de que a agulha se move livremente sob a pele para evitar a injeção intramuscular. </li><li> Expelir o conteúdo da seringa lentamente e uniformemente. Retirar lado bisel da agulha para baixo. </li></ol></li><li> Injeções intratumoral <ol><li> Captura de umd anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com o inóculo do vírus através da elaboração lenta e progressivamente, mantendo a agulha na posição vertical. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Inserir a agulha lado bisel para cima para dentro do tumor e expelir o conteúdo da seringa de maneira uniforme e lentamente, enquanto move a agulha num padrão de tipo ventilador, retirar parcialmente a agulha antes de cada movimento para evitar laceração do tumor. Retirar lado bisel da agulha para baixo. NOTA: Os tumores LCRT subcutâneas são, atingindo aproximadamente 100 mm3 em 5-7 dias de rápido crescimento. Para além disso, centros necróticos e hemorrágicos frequentemente se formam na superfície do tumor no prazo de vários dias e requerem cAmonitorização REFUL (Figura 4). </li></ol></li><li> As injecções intraperitoneais <ol><li> Capturar e anestesiar o animal (secção 4). </li><li> Limpe o local da injecção com 70% de etanol usando cotonetes e deixe-o evaporar completamente antes de prosseguir. </li><li> Seringas de carga (29 G x 1/2 &#39;, 0,3 ml) com a droga através da elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha. </li><li> Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen. Puxe o êmbolo para garantir que o sangue ou fezes não são aspirados, isso indica a colocação incorreta da agulha. Se isso ocorrer, retire a agulha e preparar uma nova seringa. Quando a agulha é colocada corretamente, expulsar conteúdo da seringa de forma uniforme e lentamente. </li></ol></li></ol> 7. Tumor Excisão e Necropsia <ol><li> Reunir e limpar alferramentas l com etanol 70% antes da eutanásia do animal. </li><li> Eutanásia o animal pelo método desejado, inalação de CO 2 (2 L / min, durante 5-10 min) é recomendado. Examine o animal para qualquer anormalidade na condição. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal numa prancha de dissecação e limpar o animal com etanol a 70%. </li><li> Use uma pinça para levantar a pele na parte inferior do abdômen. Cortar através da pele e do músculo utilizando tesouras e fazer uma incisão média a todo o comprimento do animal (ânus para o queixo). </li><li> Cortar a caixa torácica, fazendo dois cortes, uma lateralmente para cima o lado da caixa torácica e um em frente ao esterno para expor o coração e os pulmões. Examine os lobos do pulmão por quaisquer metástases 27,29. </li><li> Examine todos os órgãos de anormalidades e registrar quaisquer mudanças na cor, tamanho e consistência. Se necessário, os órgãos incisão com um bisturi para examinar os tecidos internos. Especificamente, examinar o fígado, rins, baço e do trato gastrointestinal. </li><li> Inspecione os linfonodos para metástases e alargamento 27,29. </li><li> Para recolher o tumor, fazer incisões flanco acima e abaixo do tumor de tal modo que a pele pode ser puxada para fora do corpo, com uma pinça. Enquanto segura firmemente a pele com pinças, usar um bisturi para remover cuidadosamente o tumor por corte entre o tumor e derme (Figura 5). </li><li> Colocar imediatamente o tumor em um recipiente rotulado de 10% de formalina tamponada neutra. </li><li> Dependendo do tamanho do tumor, permitir 1-2 dias (≤ 2 mm, pequenos) ou 5-6 dias (&gt; 2 mm, grande) para a fixação, antes de se prepararem secções para análise histológica (Figura 6). </li></ol>

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</ol>

Os autores reconhecem que não há conflitos de interesse financeiros relacionados a esta pesquisa.

Os ratos de algodão são altamente excitáveis e têm uma forte resposta de vôo. Portanto, cuidados especiais devem ser tomados para minimizar qualquer estresse indevido no animal. A configuração da gaiola descrita permitirá a captura segura e fácil dos animais, sendo a colocação do tubo de enriquecimento de extrema importância. Ao montar gaiolas, certifique-se de que os tubos de enriquecimento atendam aos requisitos de tamanho e forma e sejam colocados na orientação adequada na gaiola. Também é importante garantir que todo...

Vírus Oncolíticos (OV) replicar selectivamente em células tumorais, explorando as diferenças bioquímicas entre células normais e tumorais 1,2. Existem dois tipos de VOs: aqueles que não necessitam de uma mutação para alcançar oncólise selectiva, referido como ocorrendo naturalmente vírus do tipo selvagem e as que devem ser modificadas para alcançar oncólise selectiva. A recolha de mutações dentro de um determinado tipo de tumor que determina a natureza da vantagem de crescimento selectivo sobre as células normais de um OV 2. A segurança e benefício de utilizar VOs foi demonstrada em ensaios clínicos 3-7. Apesar dos avanços no campo da virotherapy oncolytic existem lacunas entre os resultados pré-clínicos e clínicos, o que sugere que os melhores modelos são necessários para avaliar a eficácia antitumoral de VOs. Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) é um membro da família Herpesviridae, e Alphaherpesviridae subfamília. BHV-1 initiates bovina complexo de doença respiratória em bovinos, manifestando-se em uma ampla variedade de sintomas semelhante a um resfriado 8,9. BHV-1 liga-se receptores de ligação de entrada e utilizados pelo HSV-1, tais como o sulfato de heparano e Nectin-1 10. No entanto, se liga CD155 no lugar de Nectin-2 10. BHV-1 tem uma gama de hospedeiros muito estreito de tal modo que ele não é capaz de entrar e iniciar a replicação em células de murinos normais e transformadas 3,4,10 eficientemente. Isso faz com que a utilização de modelos murinos convencionais problemático. A capacidade oncolitica do BHV-1 tem sido demonstrada in vitro 11,12. BHV-1 tem sido mostrado para iniciar a replicação e matar células de tumor humano a partir de uma variedade de origens histológicos, incluindo células de cancro da mama e cancro da mama iniciar células 11,12. No entanto, a capacidade antitumoral do BHV-1 deve ser avaliada in vivo no contexto de um hospedeiro imunocompetente. Adenovirus humano (Ad), para os quaishá 57 sorotipos identificados, mais comumente causa doenças respiratórias em humanos. Vectores Ad Oncolíticos foram avaliados quanto à sua eficácia antitumoral com vários avançar para ensaios clínicos 13-15. Apesar dos dados pré-clínicos promissores, os resultados clínicos têm ficado aquém das expectativas. Modelos de xenoenxerto de tumor humano são tipicamente usadas para estudar a eficácia antitumoral de vectores Ad, embora eles exibem atenua as respostas imunes ao vírus 16,17. Além disso, os modelos de murino singeneicas são não-permissiva para infecção ad, tornando a avaliação de respostas imunitárias do hospedeiro, utilizando estes modelos impraticáveis ​​17,18. O sistema imunitário do hospedeiro tem sido identificada como o mecanismo pelo qual mais influente VOs provocar a morte das células tumorais 19. Respostas antitumorais entre tornados tolerantes e antigénio associado a um tumor não tornados tolerantes modelos (TAA) diferem entre si e podem ter grande impacto no sucesso da terapia OV. O HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 em 1814 20) 20,21 provocou regressão do tumor em 80% dos murganhos portadores de tumor em um modelo de cancro mamário antigénio Polioma Médio T murinas 22. No entanto, em HER-2 modelos / neu, a eficácia antitumoral do KM100 variou entre 20% a regressão completa em camundongos singï¿½icos e estase tumor em transgênico, os ratos HER2-tolerantes. Juntos, esses dados destacam a importância de se avaliar plenamente VOs utilizando modelos animais que melhor recapitulam a paisagem imunológico humano para entender completamente o que caracteriza determinar o sucesso terapêutico. O rato de algodão (Sigmodon hispidus), indígena do Norte e América do Sul, é mais comumente usado como um modelo de infecção pelo vírus sincicial respiratório (como revistas em 5). Ratos do algodão, também são utilizados em-BHV-1 anti pesquisa de vacinação uma vez que recapitulam a patologia associada à doença respiratória bovina complexo 6,23. Além disso, o BHV-1 infecção de ratazanas do algodãoé imunogénica, induzindo mucosa sustentada e respostas imunitárias sistémicas 6,23-25. As linhas de células foram derivadas de fibrossarcoma espontânea e osteosarcomas da glândula mamária (LCRT) e osso (CCRT e VCRT), respectivamente 26. Ratos de algodão têm sido usados ​​para avaliar a eficácia in vivo de vectores Ad oncolíticos como eles são susceptíveis à infecção por Ad e exibem uma patologia semelhante à dos humanos 27-29. A utilização de modelos imunocomprometidos para a avaliação pré-clínica de VOs não são apenas menos indicativo de respostas clínicas para a terapia, mas eles não conseguem ter em conta o papel do sistema imunológico no viroterapia oncolítico 30,31. Portanto, o singeneicos e modelos de ratos tornados tolerantes algodão-tumorais de carcinoma da mama e osteossarcoma são modelos relevantes em que para avaliar a eficácia pré-clínica de VOs, tais como o BHV-1 e Ad que não pode ser estudado usando modelos murinos convencionais.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s médio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Pode usar qualquer marca&nbsp;</td></tr><tr><td>1X Solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Pode preparar em laboratório, filtrar para esterilizar</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>100x Antibiótico-Antimicótico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>de soro fetal bovino</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Pode usar qualquer</td></tr><tr><td>marca T-150cm2</td> frasco <td>de cultura de tecidos Fisher Scientific</td><td>14-826-80</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>1X TypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 12 poços, fundo plano</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td>Pode usar qualquer marca, deve ser tratado com cultura de tecidos</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Pode usar um reagente alternativo para determinação da viabilidade celular</td></tr><tr><td>8640 Teklad 22/5 Dieta para roedores</td><td>Harlan&nbsp;</td><td>8640</td><td></td></tr><tr><td>1/8" espiga de milho cama para roedores</td><td>Harlan</td><td>7092</td><td></td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Ancare-Feito</td><td></td> <td>de fibra de algodão virgem descascado, sem poeira e autoclavável</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Pode usar qualquer marca, deve ser estéril</td></tr><tr><td>Isoflurano USP, 99,9%, anestésico inalatório</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>Pode preparar em laboratório</td></tr><tr><td>10% Formalina Tamponada Neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>NAPCO NapFlow 1200 Classe II A/B3 Biossegurança Microbiological Safety Cabinet (capuz de cultura de células)</td> Modelo <td>NAPCO</td><td>usado não disponível atualmente</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific Precision Banho de Água Aquecido</td><td>Fisher Modelo científico</td><td>usado não disponível no momento&nbsp;</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Reichert Bright-line Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Typhoon Trio BioAnalyzer&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Modelo usado não disponível no momento&nbsp;</td><td>Pode usar qualquer leitor de placa de fluorescência</td></tr><tr><td>Tecan Safire2 Leitor de Microplacas Multi-detecção</td><td>Modelo Tecan</td><td>usado não disponível no momento&nbsp;</td><td>Pode usar qualquer leitor de placa de fluorescência</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada Allegra 6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Pode usar qualquer</td></tr><tr><td>marca Máquina de anestesia de mesa</td><td>Modelo</td><td>usado não disponível no momento&nbsp;</td><td>Pode usar qualquer marca, deve ser portátil</td></tr><tr><td>Mini Cortadores de Amendoim Wahl</td><td>Wahl</td><td></td><td>Pode usar qualquer marca de pequenos cortadores</td></tr><tr><td>Seringas de insulina 29 G x 1/2', 0.3 mL</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Pode usar qualquer marca. As seringas de insulina são recomendadas, pois facilitam as injeções através do rato' s pele dura.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>MedPro</td><td>018-425</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação de ponta afiada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Pinça de tecido de dissecação</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr></tbody></table>

manuseio do rato cotton em estudos para a avaliação pré-clínica de vírus oncolíticos

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Os vírus oncolíticos são uma nova terapia anticancerígena com a capacidade de atingir as células tumorais, deixando as células saudáveis intactas. Para que essa estratégia seja bem-sucedida, estudos recentes mostraram que o envolvimento do sistema imunológico do hospedeiro é essencial. Portanto, a viroterapia oncolítica deve ser avaliada no contexto de um modelo imunocompetente. Além disso, o estudo de terapias antitumorais em modelos animais tolerados pode recapitular melhor os resultados observados em ensaios clínicos. Os ratos de algodão, comumente usados para estudar vírus respiratórios, são um modelo atraente para estudar a viroterapia oncolítica, pois os modelos singênicos de carcinoma mamário e osteossarcoma estão bem estabelecidos. No entanto, há uma falta de informações publicadas sobre o procedimento de manuseio adequado para esses roedores altamente excitáveis. A abordagem de manuseio e captura descrita minimiza o estresse animal para facilitar a experimentação. Essa técnica depende da capacidade do pesquisador de manter a calma durante o manuseio e realizar os procedimentos em tempo hábil. Finalmente, descrevemos como preparar células tumorais mamárias de rato de algodão para a formação consistente de tumores subcutâneos e como realizar injeções intratumorais e intraperitoneais. Esses métodos podem ser aplicados a uma ampla gama de estudos que promovem o desenvolvimento do rato do algodão como um modelo pré-clínico relevante para estudar a terapia antitumoral.

Devido à natureza extremamente excitável de ratos do algodão, sendo familiarizados com e utilizando processos optimizados para reduzir a tensão dos animais vai facilitar a sua utilização como um modelo animal de pré-clínico. O uso de técnicas de manejo adequadas também vai minimizar os riscos para o pesquisador. Ao usar ratos do algodão é imperativo para manter a calma. Os ratos são altamente excitáveis ​​e tentará escapar de sua gaiola. A utilização de um tubo de enriquecimento e nestlets m...

Os ratos de algodão são extremamente excitáveis e têm uma forte resposta de fuga ou luta. Um método de manejo otimizado para reduzir o estresse dos animais é descrito, o que tornará os ratos de algodão mais acessíveis como um modelo pré-clínico.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o manuseio e captura seguros de ratos de algodão usando um método específico destinado a reduzir o estresse experimentado pelo animal. Isso é feito colocando primeiro um tubo de enriquecimento contra a extremidade de uma gaiola de rato e uma cesta de aço protegível no topo. Na segunda etapa, o equipamento individual de proteção adequado é acionado e o pirralho de algodão pode rastejar para dentro do tubo de enriquecimento.O tubo é então mantido contra a lateral da gaiola e o animal preso é rapidamente transferido para um recipiente de plástico com orifícios de ar para transporte para a câmara de indução anestésica. Na etapa final, um cone de nariz especial especificamente ajustado para o focinho do pirralho de algodão é colocado no animal para facilitar a sedação completa. Em última análise, esse procedimento de captura pode ser usado para manusear com segurança pirralhos de algodão de uma maneira que diminua seu estresse e aumente sua segurança.Ao usar esses roedores altamente excitáveis em estudos pré-clínicos, geralmente os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido às discrepâncias na literatura em relação ao manuseio, alojamento e comportamento do rato de algodão. A demonstração visual deste método é fundamental para complementar os relatos escritos para preparar os pesquisadores para os desafios comportamentais no trabalho com ratos de algodão. Demonstrando o procedimento estarão Brianne Cuttington, uma estudante de pós-graduação, e Meganer, uma pós-doutoranda do meu laboratório Para diminuir a luta, alojou os ratos de algodão individualmente em gaiolas de policarbonato contendo uma cama de espiga de milho de oito polegadas, uma seção de tubo de PVC não mais do que oito polegadas e ninhos para enriquecimento para permitir a captura segura e fácil dos animais.Coloque o tubo de enriquecimento contra o final da gaiola e, em seguida, coloque uma cesta velha e segura sobre o topo da gaiola contendo comida para roedores e uma garrafa de água. Agora reúna um recipiente de plástico grande e transparente com orifícios para ar e uma tampa e câmara de indução anestésica, grande o suficiente para caber no recipiente e um cone nasal encaixado na mangueira de saída de gás. Observe que o pirralho de algodão tem um focinho alongado que requer uma forma diferente para fornecer o gás anestésico, conforme ilustrado nesta imagem de um cone de nariz, projetado para caber adequadamente em um rato de algodão trabalhando em pares.Os pesquisadores devem colocar luvas grossas de couro para proteção durante todas as partes do procedimento. Quando os dois pesquisadores estiverem prontos, coloque a gaiola do animal em uma superfície plana e remova a tampa externa. Então, quando o animal estiver dentro do tubo de enriquecimento, levante a bandeja de alimentação de aço levemente e manobre lentamente o tubo até que fique paralelo às laterais da gaiola e contra as costas.Em seguida, levante lenta e deliberadamente a borda da tampa de aço mais longe do tubo de enriquecimento, mantendo a outra extremidade em contato com a gaiola. Peça ao segundo pesquisador que crie um espaço grande o suficiente para o recipiente de plástico. Em seguida, em um movimento suave e rápido, empurre o plástico e o recipiente para cima do tubo de enriquecimento.Mantenha o contato do recipiente com a lateral da gaiola que prende o animal no tubo. Ao manusear os ratos de algodão, é importante ser paciente e usar uma mão firme, pois os animais têm uma forte resposta de fuga ou luta, e tentará evitar a captura correndo e pulando para fora da gaiola. Se um animal escapar, evite manuseá-lo pela cauda.Como pode ocorrer desenluvamento, remova a bandeja de alimentação de aço e dê a tampa do recipiente de plástico ao outro pesquisador. Em seguida, deslize a tampa de plástico entre a lateral da gaiola e o recipiente. Estar atento aos apêndices do animal preso no processo e fechar, mas não selar o recipiente, certificando-se de que o recipiente permaneça fechado.Transporte o animal para a câmara de indução. Em seguida, peça a um pesquisador que coloque rapidamente o animal na câmara e remova a tampa do recipiente em um movimento fluido, enquanto o outro abre e imediatamente recoloca a tampa da câmara de indução. Finalmente, após a administração da anestesia, retorne o rato à sua gaiola com monitorização até que o animal recupere a mobilidade total e a recomposição esternal.A injeção de células tumorais viáveis é importante para a formação adequada do tumor. Nesta imagem, é mostrada uma monocamada saudável de células LCRT que podem ser preparadas para injeção em pirralhos de algodão. Em contraste, essas células LCRT têm baixa viabilidade e não devem ser usadas para injeções.Os tumores formados a partir de células LCRT crescem rapidamente e, como resultado, os centros necróticos geralmente se formam como tal, a formação de tumores deve ser monitorada cuidadosamente para evitar ulceração. Se ocorrer ulceração, o animal deve ser sacrificado para evitar infecção e possível morte por sepse. Manter a integridade do tecido tumoral após a excisão resultará em uma amostra que é uma representação mais precisa do tumor in vivo.Por exemplo, aqui, uma técnica de excisão pela qual o tumor é cuidadosamente separado do tecido circundante usando um bisturi e uma pinça é mostrada como mostrado nesta imagem final. A estrutura densa e altamente vascularizada do tumor é mantida por essa técnica de excisão, que é importante para a análise de tratamentos que afetam a vasculatura tumoral. Como é o caso de muitos vírus oncolíticos Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a calma e realizar cada etapa lenta e deliberadamente para evitar agitar os ratos de algodão.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como capturar e manusear ratos de algodão com segurança.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

RNA de interferência (RNAi) possui muitas vantagens sobre knockout do gene e tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta em estudos de genes funcionais. A invenção da tecnologia de RNAi DNA vector baseado fez a longo prazo e knockdown induzível gene possível, e também aumentou a viabilidade de silenciamento do...

DNA Vector baseado em RNA de interferência para estudar a função Gênica em Câncer

O vídeo demonstra a entrega locorregional de vírus oncolíticos por meio de injeção arterial hepática como abordagem terapêutica para carcinoma hepatocelular. Esses vírus se replicam seletivamente em células tumorais, induzindo lise celular e liberando antígenos associados a células tumorais. Esse processo desencadeia a morte celular imunogênica, induzindo uma resposta antitumoral.

Direcionamento de tumores hepáticos com vírus oncolíticos através da artéria hepática

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção de vírus HIV quiméricos no córtex do cérebro de um rato, onde o RNA do vírus se integra ao genoma do hospedeiro, se replica e se espalha para estabelecer uma infecção ativa pelo HIV no modelo experimental.

Estabelecendo uma infecção ativa pelo HIV em um modelo de rato

Este vídeo demonstra o processo de injeção de um vetor viral na substância negra do rato para modelar a doença de Parkinson. Ele descreve as etapas para preparar o rato, microinjetar o vetor viral na substância negra e o procedimento de recuperação.

Uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para modelagem de doenças neurodegenerativas

Este protocolo descreve como silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os ratos estão envolvidos em tarefas de aprendizado e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusivamente-Ativados-por-Designer-Drugs) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que é projetado para distinguir entre diferentes componentes de aprendizagem.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

As viroterapias oncolíticas estão em desenvolvimento como novas terapêuticas para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC).  Aqui descrevemos um método para terapia locorregional do CHC via administração arterial hepática do vírus oncolítico.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Métodos para uma entrega de gene em larga escala do SNC em ratos são cobertos. Neste exemplo, o propósito é imitar uma doença que afeta a todo da medula espinhal. A transdução generalizada pode ser usada para fornecer uma proteína terapêutica ao SNC, desde uma única administração periférica.

Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus Adeno-associado aos ratos e avaliação do sistema nervoso Central transdução

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV), que é fundamental para melhorar nossa compreensão dos reservatórios virais do HIV-1 no cérebro e oferecer um sistema para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e comorbidades associadas (ou seja, abuso de drogas).

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

Aprenda um método de manuseio seguro para ratos cotton que reduz o estresse durante a captura. Esta técnica utiliza tubo de enriquecimento e cesto de aço para transferência, melhorando o bem-estar animal em pesquisas pré-clínicas.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

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