Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

O objetivo geral deste procedimento é identificar os parceiros de interação proteica de uma proteína de interesse usando o ensaio de COMPLEMENTAÇÃO de fragmentos de proteína DI hidrofolato redutase, ou D-H-F-R-P-C-A. Isso é feito primeiro condensando a coleção DH FFR F três ou elogios em matrizes de colônias de alta densidade. Em seguida, a cepa de isca é feita com a variedade de elogios em meio rico.

Na etapa final, os diplóides resultantes desses acasalamentos são selecionados. Em última análise, a reconstituição do DHFR é quantificada medindo o tamanho das colônias em meio PCA seletivo, que fornece um sinal proporcional à quantidade de complexo de presas de isca reconstituído nas células. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças como o câncer, como é pela religação de redes de interação de proteínas.

Que as mutações podem levar a essas doenças. Na manhã do procedimento, esterilize a plataforma robótica mergulhando primeiro as ferramentas PIN cinco vezes por 10 segundos na estação de banho-maria para remover quaisquer aglomerados de células residuais. Em seguida, mergulhe a ferramenta PIN duas vezes para frente e para trás na estação de escova e duas vezes na estação de alimentação por 20 segundos cada imersão para remover qualquer uma das células restantes enquanto as ferramentas PIN estão sendo limpas.

Ligue a lâmpada UV por cinco minutos para esterilizar um robô. Gabinete e, após a última lavagem, seque as ferramentas PIN na estação de secagem de ar por 25 segundos. Condense a coleção A-D-H-F-R em 16 matrizes de 384 cepas aqui.

Uma matriz 384 pode ser subdividida em quatro quadrantes igualmente espaçados, cada um consistindo em 96 posições em um layout de matriz dois por dois para um total de quatro quadrantes. Para fazer isso para cada matriz 384, imprima quatro placas de glicerol nos quatro quadrantes de uma bandeja omni contendo YPD mais 250 microgramas por mililitro. A higromicina B, usando a ferramenta de 96 pinos para fazer isso, insira 4 placas de 96 poços contendo o controle negativo LDH FFR F três entre as 60 placas de glicerol da coleção DHFR três para ter um conjunto final de 64 placas que preenchem exatamente quatro matrizes de 1.536

Em seguida, insira 4 placas de 96 poços contendo o LDH FFR F três controle negativo entre as outras 60 placas para ter um conjunto final de 64 placas que preenchem exatamente 4 15 36 matrizes antes de adicionar células às placas de origem, molhe os pinos esterilizados em 35 mililitros de água estéril em uma bandeja omni na estação úmida. Incube as matrizes a 37 graus Celsius por dois dias e, em seguida, condense a coleção em quatro matrizes de 1.536 cepas. Imprima quatro matrizes de 384 cepas em cada uma das quatro placas de destino.

Usando a ferramenta de 384 pinos. Esterilizar a ferramenta PIN entre cada ciclo de replicação, conforme demonstrado após mais dois dias de incubação. Padronize o tamanho da colônia replicando as quatro matrizes no meio YPD selecionado com uma ferramenta de 1.536 pinos e incube as placas por mais 48 horas.

Para alto rendimento. D-H-F-R-P-C-A primeiro inocular uma cultura da cepa de isca em 20 mililitros de YPD líquido mais ricina CIO em um tubo de 50 mililitros e incubar as células por dois dias a 30 graus Celsius com agitação a 250 RPM. Quando a cultura atingiu a saturação.

Coloque cinco mililitros da suspensão celular em uma bandeja YPD mais mosquito omni e deixe as células absorverem na superfície após cinco a 10 minutos, remova o excesso de líquido e incube a cultura a 30 graus Celsius após dois dias. Use a ferramenta de 1.536 pinos para imprimir a tensão da isca em placas de 12 YPD usando cada gramado de célula no máximo quatro vezes. Em seguida, usando a ferramenta de 1.536 pinos, novamente, imprima a matriz apropriada para a coleção DHFR F três em cima das células de isca.

Deixe as cepas acasalarem durante mais dois dias de incubação e, em seguida, selecione as células diplóides imprimindo as colônias em bandejas omni contendo YPD mais hidromicina B e nortina. Incube os diplóides por mais dois dias a 30 graus Celsius e, em seguida, repita a seleção como demonstrado apenas um dia após o início da incubação. Despeje os pratos com meios contendo metotrexato no dia seguinte.

Use a ferramenta de 1.536 pinos para imprimir células diplóides no meio metotrexato e incube as placas por mais quatro dias em sacos plásticos para evitar que as culturas sequem. No terceiro dia de incubação. Despeje um segundo lote de bandejas omni contendo meio MTX como demonstrado no dia seguinte, acenda a luz do robô e use uma plataforma robótica para obter imagens das placas para diminuir o crescimento de fundo das cepas de PCA e aumentar a resolução quantitativa, replique as células no segundo lote de mídia MTX para realizar uma segunda rodada de seleção de MTX como acabamos de demonstrar.

Finalmente, após adquirir imagens do segundo conjunto de placas, analise as matrizes de colônias com o software apropriado, coletando as informações de tamanho da colônia para cada posição de cada matriz. O limite definido com o LDH FFR F três controles pode ser usado como um limite empírico para determinar os acertos de alta confiança. Os interagentes físicos conhecidos da isca podem então ser recuperados de bancos de dados como o Biogrid e sobrepostos aos dados.

Por exemplo, aqui, cinco dos oito acertos de alta confiança foram relatados anteriormente como interagentes NUP 82, entre os quais outros NUP um 16 e NUP 1 59 foram determinados como parte do subcomplexo NUP 82. Os dados também indicam que a proteína de membrana aproximada PEX 30 pode representar um novo interativo físico de Nup 82, conforme confirmado usando D-H-F-R-P-C-A em um baixo rendimento de dois dos outros parceiros de interação detectados. O novo 20 e o novo 85 foram determinados como não fazendo parte do novo subcomplexo 82, ilustrando a capacidade do D-H-F-R-P-C-A de detectar as interações dentro e entre subcomplexos de complexos maiores.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a mídia Freshly Report para evitar qualquer solução de problemas com as etapas de impressão e incluir os controles necessários para garantir que a mídia PCA final permita o crescimento apenas de células que demonstram a complementação DHFR.