Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium
14 de março de 2015
A disfunção mitocondrial é uma característica da senescência celular. Este trabalho usa não-invasivo do infravermelho próximo (NIR) de tratamento para melhorar a função mitocondrial no rato epitélio sensorial vestibular de envelhecimento.
O objetivo geral do experimento a seguir é investigar o potencial impacto neuroprotetor da luz infravermelha próxima no epitélio sensorial vestibular de camundongos. Isso é conseguido por uma aplicação transcraniana simples e de curto prazo de luz infravermelha próxima aos camundongos em vários estágios de desenvolvimento. Em um segundo momento, os labirintos ósseos dos animais tratados são dissecados, permitindo o isolamento do epitélio sensorial vestibular.
Em seguida, a expressão do gene antioxidante de interesse é medida por R-T-P-C-R para avaliar o impacto do tratamento no desempenho mitocondrial. Finalmente, a densitometria é realizada para avaliar o efeito do tratamento breve com luz infravermelha próxima na expressão de genes antioxidantes específicos em camundongos. A principal vantagem desta técnica de tratamento no infravermelho próximo é que ela é simples e não invasiva, permitindo uma análise fisiológica, molecular e comportamental posterior ao tratamento.
As implicações desta técnica estendem-se à potencial neuroproteção do sistema vestibular periférico durante o envelhecimento normal, ou à melhoria do desempenho equilibrado após doença vestibular ou déficit. Dois a três dias antes de iniciar o experimento, raspe o pelo nas regiões da cabeça e pescoço de cada camundongo o mais próximo possível para evitar o crescimento dos pelos do animal antes da conclusão do regime de tratamento. Para manter o status de livre de patógenos dos animais, limpe os instrumentos com etanol a 70% entre cada barbear.
Então, no dia do tratamento para cada animal interno, pegue o rato na extremidade proximal da cauda e deixe-o relaxar na palma de uma mão para minimizar o estresse para os animais tratados com infravermelho próximo. Para cada animal, segure um dispositivo LED de 670 nanômetros, a um a dois centímetros de distância da área raspada, e ligue o dispositivo por 90 segundos. Para o grupo simulado, repita o procedimento de tratamento da mesma forma, mas com o dispositivo desligado para o grupo bloqueado no infravermelho próximo, trate os animais da mesma forma que o grupo tratado com infravermelho próximo, mas com o dispositivo coberto com papel alumínio.
Depois de repetir os tratamentos para cada grupo em intervalos de 24 horas por cinco dias consecutivos, congele o líquido cefalorraquidiano cerebral artificial à base de glicerol recém-preparado, ou A CSF, em um freezer de 80 graus Celsius negativos por 45 minutos até que uma pasta de gelo se forme. Próximo. Para cada camundongo, use uma lâmina de barbear arredondada número 22 para fazer uma incisão ao longo da pele sagital do crânio, mantendo o cérebro da abóbada craniana e o aparelho vestibular subjacente o mais frio possível com aplicações regulares de LCR A gelado sobre o tecido. Em seguida, use o braço pontiagudo de uma tesoura de padrão padrão para fazer uma pequena incisão no crânio em Lambda e corte ao longo da sutura sagital.
Em seguida, deslize suavemente um braço de uma URS rasa abaixo do osso parietal e, em seguida, prenda e puxe o osso parietal lateralmente e o osso occipital posteriormente até que o cérebro fique exposto. Em seguida, use uma pequena espátula de aço inoxidável para afastar o cérebro da fossa craniana anterior e média. Para expor o nervo coclear vestibular, corte o nervo para evitar tensão desnecessária nos axônios aferentes primários que inervam diretamente as células ciliadas vestibulares.
Em seguida, remova o cérebro in toto e observe o labirinto ósseo contendo a cóclea e os órgãos vestibulares periféricos na fossa craniana média. Agora faça duas pequenas incisões ao lado de cada labirinto ósseo e segure e puxe o canal semicircular anterior lateralmente para extirpar toda a estrutura. Em seguida, mergulhar imediatamente o labirinto excisado numa cápsula de dissecação contendo a solução gelada de A CSF, perfundindo continuamente com carbogénico.
A parte mais complicada deste procedimento é obter quantidades consistentes de tecido viável para cada animal, recomendamos praticar observação cuidadosa e iluminação específica do tecido. Em seguida, sob um microscópio estéreo, segure o labirinto pela cóclea e use uma pinça para prender o tecido ao fundo do prato usando uma pinça reta e fina. Raspe uma pequena abertura no osso acima da ula do canal semicircular anterior.
Em seguida, alcance imediatamente abaixo do osso e mova para fora, afastando-se do ULA para ampliar suavemente a abertura. Continue desta forma até que o utrículo e a pula anterior e lateral estejam todos expostos. Em seguida, use uma pinça fina para levantar suavemente o utrículo e afastá-lo do labirinto ósseo até que estejam completamente separados.
Finalmente, segure com segurança os órgãos vestibulares entre a ponta da pinça e coloque-os em lise recém-preparada. Tampão em um microtubo com tampa de rosca, gire suavemente a pinça no tampão para separar os órgãos vestibulares. Então, depois de confirmar que a pinça está livre de tecido sob o microscópio estereoscópico, aperte a tampa do microtúbulo e congele imediatamente a amostra em nitrogênio líquido para comparar o impacto do tratamento com infravermelho próximo entre camundongos jovens e mais velhos.
Mensageiro, o RNA foi transcrito revertido em DNA complementar, então a expressão da superóxido dismutase antioxidante um ou SOD um foi analisada conforme medido por densitometria um aumento significativo na expressão de sod normalizado com beta actina de mais de duas vezes em animais jovens tratados com infravermelho próximo em comparação com animais jovens tratados com simulação e animais jovens bloqueados no infravermelho próximo foi observado. Animais mais velhos tratados com infravermelho próximo também exibiram mais de duas vezes a regulação positiva do sod um quando comparados com animais mais velhos bloqueados no infravermelho próximo. Após este procedimento, experimentos comportamentais, moleculares ou fisiológicos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como: a luz infravermelha próxima aumenta a expressão de outros genes ou proteínas no epitélio sensorial vestibular?
Ou a luz infravermelha próxima melhora o desempenho geral do equilíbrio dos camundongos tratados?
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Visão Geral
Este estudo investiga os efeitos neuroprotetores da luz infravermelha no epitélio sensorial vestibular em camundongos idosos. O tratamento não invasivo tem como objetivo melhorar a função mitocondrial, que muitas vezes está comprometida na senescência celular.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Gerontologia
Antecedentes
- A disfunção mitocondrial é uma característica fundamental do envelhecimento.
- A senescência celular afeta diversos tecidos, incluindo o sistema vestibular.
- A luz infravermelha próxima tem efeitos terapêuticos potenciais sobre a função celular.
- Este estudo concentra-se em um método não invasivo para avaliar esses efeitos.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto neuroprotetor da luz infravermelha próxima.
- Avaliar o desempenho mitocondrial no epitélio sensorial vestibular.
- Medir a expressão de genes antioxidantes após o tratamento.
Métodos Utilizados
- Aplicação transcraniana de luz infravermelha próxima em camundongos.
- Dissecação dos labirintos ósseos para isolar o epitélio sensorial vestibular.
- R-T-P-C-R para medir a expressão gênica de genes antioxidantes.
- Densitometria para avaliar os efeitos do tratamento na expressão gênica.
Resultados Principais
- O tratamento com luz infravermelha próxima melhorou a função mitocondrial.
- Foi observado um aumento na expressão de genes antioxidantes específicos.
- O método mostrou-se simples e não invasivo.
- Potencial para análises fisiológicas e comportamentais adicionais após o tratamento.
Conclusões
- A luz infravermelha próxima mostra potencial como tratamento neuroprotetor.
- A melhoria da função mitocondrial pode atenuar os efeitos do envelhecimento.
- São necessários estudos adicionais para explorar os benefícios de longo prazo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modulação não invasiva da função mitocondrial em epitélios sensoriais aborda uma lacuna crítica na deterioração do equilíbrio relacionada à idade, oferecendo um ponto de entrada mecanicista para intervenções neuroprotetoras. A avaliação quantitativa da expressão gênica de antioxidantes permite confiança preditiva na análise de estratégias de resiliência celular. Essa abordagem orienta decisões de portfólio em estágios iniciais para a preservação de sistemas sensoriais e no combate à neurodegeneração.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função mitocondrial como hipótese terapêutica no envelhecimento de células sensoriais.
- Auxilia na desmistificação biológica ao quantificar a superexpressão de genes antioxidantes após a intervenção.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de desfechos moleculares mensuráveis.
- Oferece confiança preditiva para o avanço de estratégias neuroprotetoras em modelos pré-clínicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para medir alterações na expressão gênica em resposta a estímulos externos.
- Padroniza os resultados da RT-PCR quantitativa e da densitometria para aplicações de triagem posteriores.
- Permite a preparação do ensaio para avaliar intervenções candidatas que visam vias mitocondriais.
- Apóia a comparação confiável entre grupos tratados e controles em modelos de tecidos sensoriais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças de declínio vestibular relacionado à idade, garantindo continuidade translacional.
- Fornece desfechos moleculares que conectam as fases de descoberta e validação pré-clínica.
- Informa o avanço ajustado ao risco de candidatos neuroprotetores direcionados à disfunção mitocondrial.
- Oferece desvio mecanicista de riscos para intervenções voltadas à preservação do sistema sensorial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes quantitativos de hipóteses sobre a modulação mitocondrial em tecidos sensoriais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da análise da expressão gênica de antioxidantes.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas padronizadas adequadas para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece medidas densitométricas e de RT-PCR para comparação estatística robusta entre grupos experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados moleculares a modelos relevantes para doenças no envelhecimento vestibular.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de intervenções direcionadas a mitocôndrias em sistemas sensoriais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa neuroprotetora.
- Valor Operacional: Permite fluxos de trabalho padronizados, escaláveis e reprodutíveis para análise de expressão gênica.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção e a alocação de capital em programas de neurodegeneração em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de estratégias de modulação mitocondrial no envelhecimento sensorial.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de biologia molecular, como RT-PCR e densitometria.
- Necessita de acesso a instrumentação especializada para quantificação da expressão gênica e dissecação de tecidos.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de preparação de amostras e análise.
- Pode exigir adaptação para diferentes sistemas modelo sensoriais ou neurológicos.
- O rendimento e viabilidade consistentes dos tecidos são essenciais para resultados reprodutíveis.
