Name: Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a aplicar luz infravermelha próxima de forma transcraniana em camundongos para avaliar a função mitocondrial no epitélio vestibular sensorial. Este método não invasivo demonstra potencial neuroprotetor no envelhecimento celular.

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Os autores gostariam de agradecer Dr. Paul Witting e Ms. Genevieve Fong por sua assistência com extração de mRNA e PCR, eo Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation para o apoio.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Sydney animal. 1. Animais NOTA: 1 e 8-9 meses de idade camundongos (C57 / BL6) foram obtidos a partir do Centro de Recursos Animal (Perth, Austrália). Os ratinhos foram alojados no mecanismo Bosch Roedor na Universidade de Sydney. <ol><li> Casa ratos em gaiolas-padrão do mouse em um ciclo claro / escuro de 12/12 horas de luz com acesso a comida e água ad libitum. </li><li> Camundongos Divida em cada faixa etária em infravermelho próximo (NIR), tratados, ou sham grupos tratados (controle) para comparação. </li></ol> 2. Infravermelho Próximo (NIR) Irradiação e Tratamento Sham <ol><li> Raspar a pele na região da cabeça e pescoço do mouse com um barbeador elétrico, tanto quanto possível para evitar a rebrota rápida de cabelo antes da realização do regime de tratamento. A fim de manter o status de livre de patógenos dos ratos, use 70% de etanolpara limpar instrumentos entre animais para maquiagem e desinfetante F10 veterinário entre animais de gaiolas separadas. Faça isto 2-3 dias antes do início do tratamento para que os animais não estão sobre-tratadas. </li><li> Conter rato com a extremidade proximal da cauda e permitir que ele relaxe na palma de uma mão ou de bancada, de modo a minimizar o stress, que pode levar a resultados falsos. </li><li> Segure o NIR (670 nm) LED (light emitting diode) dispositivo de 1-2 cm de distância da área exposta (raspada) e ligar o aparelho durante 90 segundos (Figura 1A). NOTA: A mudança de temperatura como resultado de exposição de 90 segundos foi medida como &lt;0,2 ° C em 100 ml de água. </li><li> Repita os passos de 2,2-2,3 para o grupo de tratamento simulado de animais, mas deixar o aparelho desligado (Figura 1B). </li><li> Repita os passos de 2,2-2,3 para o grupo de tratamento Nir-bloqueado de animais, mas cubra o aparelho com papel alumínio. </li><li> Repita os passos 2,2-2,5 diariamente às approximate 24 intervalos de RH durante 5 dias consecutivos. </li><li> Extraia o epitélio vestibular sensorial (3 cristas e uma mácula utricular) de ambas as orelhas no quinto dia pós-tratamento (ver secção 3 abaixo). </li></ol> 3. Extracção de tecido 20 <ol><li> Preparar 300 ml de um fluido cerebrospinal artificial (ACSF) à base de glicerol que consistem em (em mM): 26 de NaHCO3, 11 de glucose, 250 glicerol, 2,5 de KCl, 1,2 de NaH 2 PO 4, 1,2 de MgCl2, 2,5 e CaCl 2. Antes da adição de CaCl2, gás a solução com carbogénio (95% O 2 e 5% CO 2) para estabelecer um pH de 7,4 e evitar a precipitação do cálcio (turvação). Arrefeça a solução num congelador a -80 ° C durante 45 minutos de modo que uma pasta de gelo é formada. </li><li> Prepare o tampão de lise isolamento do RNA em microtubos parafuso superior marcados (pára o popping de tampas quando as alterações de pressão tubo entre congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido), de acordocom as instruções do fabricante ou práticas de laboratório habituais. Já nitrogênio líquido pronto em um frasco de Dewar de alumínio. NOTA: Use roupas de proteção e eyeware ao manusear nitrogênio líquido. Certifique-se de que o nitrogênio líquido é usado em um quarto bem ventilado como o volume da sua forma de gás é aproximadamente 700 vezes maior do que a sua forma líquida e pode causar asfixia. </li><li> Profundamente anestesiar os ratos com cetamina (400 mg / kg) através de uma injecção intra-peritoneal. Permitir que o reflexo posterior de membros para desaparecer completamente como indicação de que os ratos são totalmente anestesiado. </li><li> Decapitar ratos com tesoura de aço inoxidável afiadas e fazer uma incisão ao longo da pele sagital do crânio usando uma lâmina de barbear (arredondado # 22). Neste momento e em toda as etapas 3,5-3,9, manter a calota craniana, cérebro e aparelho vestibular subjacente o mais fresco possível pela aplicação regular de ACSF gelada sobre o tecido. </li><li> Usando o braço pontas de tesouras padrão standard fazer uma small incisão no crânio no Lambda e cortar ao longo da sutura sagital. </li><li> Deslize suavemente um braço de um fórceps rasas debaixo do osso parietal mantendo a lâmina tão próximo quanto possível da superfície inferior do osso sem arrastar o cérebro. Seguros e afastar o osso parietal lateral e posterior do osso occipital até que o cérebro está exposto. </li><li> Use uma pequena espátula de aço inoxidável e levante o cérebro de distância do anterior e fossa craniana média para expor o nervo vestibular (CN VIII). Transecto o nervo para evitar tensão desnecessária sobre os axônios aferentes primários que inervam diretamente as células ciliadas vestibulares. </li><li> Remover o cérebro in toto após transecção do CN VIII. </li><li> Observe o labirinto ósseo contendo a cóclea e os órgãos vestibulares periféricas da fossa craniana média. Faça duas pequenas incisões ao lado de cada labirinto ósseo e extirpar toda a estrutura, mantendo o canal semicircular anterior e puxando mais tardealiado. </li><li> Mergulhar imediatamente labirintos excisadas em um prato de dissecação contendo solução ACSF gelado (como descrito no passo 3.1), enquanto que irriga continuamente com carbogéneo. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, mantenha pressionado o labirinto pela cóclea e fixá-lo ao fundo do prato com uma pinça. <ol><li> Use uma pinça reta fina para riscar uma pequena abertura no osso acima do canal semicircular (SSC) ampulla anterior. </li><li> Gentilmente ampliar esta abertura, alcançando imediatamente abaixo do osso e sacudindo para fora ampulífuga. Tenha cuidado aqui para não empurrar pinça na abertura e danificar o labirinto membranoso frágil abaixo. Continuar dessa maneira até que o utrículo, anterior e ampolas laterais estão todos expostos. Se possível remover a ampola posterior também. </li></ol></li><li> Usando uma pinça fina, levantar delicadamente o utrículo e ampolas de distância do labirinto ósseo até que estejam completamente isolada. Sempre que possível, mantê-lospor seus canais semicirculares associados para evitar danos ao epitélio sensorial. Em alguns casos, a parte proximal da conduta membranoso semicircular pode ter de ser cortado com tesoura de íris para libertar as ampolas a partir do osso. </li><li> Firmemente compreender os órgãos vestibulares entre a ponta de uma pinça e lugar para o tampão de lise preparado anteriormente na etapa 3.2. Agite suavemente a pinça em torno do tampão para garantir órgãos vestibulares têm destacado a pinça. Confira este for o caso, trazendo a pinça, ao microscópio estereoscópico. <ol><li> Parafuso na tampa de microtúbulos e congelar a amostra em nitrogênio líquido imediatamente. </li></ol></li></ol> 4. Extracção de ARN e RT-PCR <ol><li> Siga métodos padrão de RNA mensageiro (mRNA) extracção de acordo com as instruções do fabricante ou protocolos de laboratório preferenciais. NOTA: Um kit comercial que utilizou ARN de suporte para ajudar a isolar pequenos rendimentos de ARNm foi utilizada nesteprotocolo. Volumes de eluição inferiores podem ser utilizados para aumentar as concentrações finais de ARNm. NOTA: Negativo controles &quot;não enzima&quot; (CNE) e controles &quot;nenhum modelo de DNA&quot; (NTC) também deve ser concluído para garantir a validade dos efeitos observados. </li><li> Aplicar os métodos padrão de transcrição reversa do ARNm de ADN complementar (ADNc) e amplificação de genes alvo 21-23. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os resultados representativos descritos aqui mostram que a entrega breve transcraniana de luz NIR (90 seg / dia durante 5 dias) é suficiente para elevar os níveis de expressão de antioxidantes em ratos mais velhos quando comparados com os ratos tratados por simulação. Enquanto calor emitido poderia representar uma fonte de mitocondrial e / ou ativação neuronal, como relatado para vestibular rato aferentes 24 - nossa medição do calor emitido pelo NIR LED dispositivo foi &lt;0,2 ° C durante 90 segundos, e, como...

O declínio da performance de equilíbrio e quedas subsequentes são comuns, e, infelizmente, muitas vezes definem características de envelhecimento natural 1. O impacto desse declínio pode ser tanto física e social, e reduz significativamente a qualidade de vida das pessoas mais velhas. Em resposta, terapias físicas e reabilitação têm sido o foco da investigação sobre as quedas, mas não têm sido associadas com redução consistente na prevalência de quedas repetidas. Ao mesmo tempo, o trabalho investiga as mudanças no sistema vestibular periférico ou central (o sistema responsável por manter o equilíbrio) é escassa, e potenciais estratégias terapêuticas dirigidas a esses sistemas e as causas subjacentes de desequilíbrio limitado. Trabalhos recentes sobre doenças neurodegenerativas associadas com a idade relacionada com a idade, incluindo degeneração macular 2-4, modelos da doença de Alzheimer, 5-8 e 9-12 doença de Parkinson têm mostrado efeitos neuroprotectores de simple aplicação não invasiva do infravermelho próximo (NIR) luz. Além disso, no sistema vestibular, NIR foi usada para aumentar a actividade dos neurónios aferentes primários vestibulares in vitro 13. Embora o mecanismo de NIR luz não é bem compreendido, a maioria dos estudos que usam NIR sugeriram que estimula NIR mitocôndrias complexo IV (citocromo c oxidase) 14-17 para facilitar o metabolismo celular. No epitélio sensorial vestibular da placa subcuticular do tipo células ciliadas I é denso em mitocôndrias 18 e, como tal, pode representar um local de ação para o tratamento terapêutico NIR. Aqui, uma breve regime de tratamento, não-invasivo de transcraniana aplicado NIR que podem ser utilizadas para medir o metabolismo celular (e implicitamente, a função mitocondrial) no rato epitélio sensorial vestibular é descrito. Também é discutida a preparação de um epitélio sensorial vestibular e é mostrado que o NIR aumenta a expressão de um ubiquitonos anti-oxidante (superóxido dismutase 1) no epitélio sensorial - anteriormente mostrado ser importante para a sobrevivência de células do cabelo cóclea 19.

<table><tbody><tr><td>Quantum WARP 10</td><td>Quantum Devices</td><td>2070N030-A</td><td></td></tr><tr><td>Microtúbulos com tampa de rosca</td><td>Quality Scientific Plastics</td><td>520-GRD-Q</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Parnell, Alexandria Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de padrão padrão padrão</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas de aço carbono #22</td><td>Livingstone</td><td>SBLDCL 22</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 SF fórceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II RNA Micro Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-52075</td><td></td></tr></tbody></table>

infravermelho próximo (nir) luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse vestibular sensorial epithelium

Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium

Estratégias para atenuar o declínio na função equilíbrio com o aumento da idade são predominantemente focado em terapias físicas, incluindo tarefas de equilíbrio e exercícios. No entanto, estas abordagens não abordam as causas subjacentes do declínio do equilíbrio. Usando ratos, o impacto da luz de infravermelho próximo (NIR) sobre o metabolismo de células do epitélio sensitivo vestibular foi avaliada. Os dados coletados mostram que essa intervenção simples e segura pode proteger essas células vulneráveis ​​dos efeitos deletérios do envelhecimento natural. ARNm foi extraído a partir do epitélio sensitivo vestibular periférico isolado (ampulares crista, e mácula utricular) e posteriormente transcrita para uma biblioteca de ADNc. Esta biblioteca foi então sondadas para a expressão de antioxidante ubíqua (SOD-1). A expressão do gene antioxidante foi então usado para quantificar o metabolismo celular. Usando entrega transcraniana de Nir em jovens (4 semanas) e mais velhos (8-9 meses), ratos, e um regime de tratamento breve (90 seg / dia para 5 days), este trabalho sugere NIR sozinho pode ser suficiente para melhorar a função mitocondrial no epitélio sensitivo vestibular. Uma vez que existem atualmente não há métodos disponíveis, acessíveis e não-invasivos de terapia para melhorar a função das células ciliadas vestibular, a aplicação de radiação NIR externa fornece uma estratégia potencial para neutralizar o impacto do envelhecimento sobre o metabolismo celular inthe epitélio sensorial vestibular.

Para comparar o impacto do tratamento NIR em jovens (4 semanas) e mais velhos (8-9 meses), camundongos medimos a expressão de antioxidante superóxido dismutase 1 (SOD-1) em jovens (n ​​= 16) e mais velhos (n = 20) os ratos que foram tratados Nir, tratamento simulado, ou NIR-bloqueados. A Figura 2 mostra um aumento significativo na normalizada SOD-1 expressão β-actina de mais de 2 vezes em jovens tratados com NIR animais jovens em comparação com os animais tratados de forma simulada (p &lt;0,01) e animai...

A disfunção mitocondrial é uma característica da senescência celular. Este trabalho usa não-invasivo do infravermelho próximo (NIR) de tratamento para melhorar a função mitocondrial no rato epitélio sensorial vestibular de envelhecimento.

Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium

Strategies for attenuating decline in balance function with increasing age are predominantly focused on physical therapies including balance tasks and ...

O objetivo geral do seguinte experimento é investigar o potencial efeito neuroprotetor da luz infravermelha no epitélio sensorial vestibular de camundongos. Isso é alcançado por meio de uma aplicação transcraniana simples e de curto prazo de luz infravermelha nos camundongos em diversos estágios de desenvolvimento. Como segundo passo, os labirintos ósseos dos animais tratados são dissecados, permitindo o isolamento do epitélio sensorial vestibular.Em seguida, a expressão do gene antioxidante de interesse é medida por R-T-P-C-R para avaliar o impacto do tratamento no desempenho mitocondrial. Por fim, realiza-se a densitometria para avaliar o efeito do tratamento breve com luz infravermelha próxima na expressão de genes antioxidantes específicos em camundongos. A principal vantagem dessa técnica de tratamento com infravermelho próximo é ser simples e não invasiva, permitindo análises fisiológicas, moleculares e comportamentais adicionais após o tratamento.As implicações dessa técnica estendem-se à possível neuroproteção do sistema vestibular periférico durante o envelhecimento normal, ou à melhoria do desempenho do equilíbrio após doença ou déficit vestibular. Dois a três dias antes

near-infrared-nir-light-increases-expression-marker-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente...

A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Fonte: Zhang, L., et al. A luz infravermelha próxima (NIr) aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no epitélio sensorial vestibular do camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o processo de aplicação de luz NIr ao couro cabeludo de um camundongo raspado para ativar os neurônios vestibulares e estimular a produção de superóxido dismutase-1 (SOD-1), apoiando a função neuronal. O procedimento destaca a terapia NIr como uma estratégia neuroprotetora.

Modulando a sinalização neuronal sensorial em um modelo de camundongo usando luz infravermelha próxima

Este vídeo ilustra um método, usando um scanner T clínica 3, por MR com contraste de imagem da projeção visual ingênuo do mouse, para estudos in vivo repetitivos e longitudinais de degeneração do nervo óptico associados com lesão por esmagamento do nervo óptico aguda e degeneração do nervo óptico crônica em camundongos knock-out (KO p50).

Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

A luz de xenônio não coerente foi passada através de interferência de banda estreita e filtros de densidade neutra para fornecer luz de comprimento de onda e intensidade variados para células cultivadas. Este protocolo foi usado para avaliar os efeitos da terapia com luz vermelha / infravermelha próxima na produção de espécies reativas in vitro: nenhum efeito foi observado usando os parâmetros testados.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo In Vitro

Décadas de terapia é uma inovadora modalidade não-invasiva para o tratamento de uma ampla variedade de desordens neurológicas e psiquiátricas e também pode melhorar a função cerebral saudável. Este protocolo inclui um guia passo a passo para executar décadas de cérebro em ratos pela entrega de luz transcraniana, que pode ser adaptada para uso em outros roedores de laboratório.

Um protocolo para a terapia de décadas transcraniana em ratos

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.

Uma sonda de fluorescência NIR-II brilhante para imagens vasculares e tumorais

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Aqui nós descrevemos um método de coleta de dados e análise de dados para funcional espectroscopia no infravermelho próximo (fNIRS), um romance não-invasivo sistema de imagens do cérebro usada em neurociência cognitiva, particularmente no estudo do desenvolvimento do cérebro da criança. Este método fornece um padrão universal de aquisição de dados e análise vital para a interpretação de dados e descoberta científica.

Explorando Funções Cognitivas em Bebés, Crianças e Adultos com Espectroscopia no Infravermelho Próximo

Este procedimento mostra como usar o sistema de Gene Pulser eletroporação MXcell rapidamente e facilmente identificar as melhores condições de eletroporação de fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) ou outras células primárias. Considerações para solução de problemas também são discutidos no vídeo associado.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Aprenda a aplicar luz infravermelha próxima de forma transcraniana em camundongos para avaliar a função mitocondrial no epitélio vestibular sensorial. Este método não invasivo demonstra potencial neuroprotetor no envelhecimento celular.

Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium (Vídeo) | JoVE Journal

Infravermelho Próximo (NIR) Luz aumenta a expressão de um marcador da função mitocondrial no mouse Vestibular Sensorial Epithelium

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