Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar imunohistoquímica para visualizar proteínas de interesse. Neste exemplo, IBA1 para micróglia e pan neuronal para neurônios. Isso é obtido primeiramente colocando cortes preparados em uma solução bloqueadora para prevenir ligação inespecífica.

Como segundo passo, anticorpos que reconhecem as duas proteínas de interesse diferentes são aplicados sobre as seções durante a noite. Em seguida, as seções são lavadas e incubadas com anticorpos secundários para adicionar marcadores fluorescentes aos anticorpos primários. Os resultados da dupla marcação podem indicar colorações de micróglias dentro de campos de neurônios.

De modo geral, indivíduos que são novos nesta técnica terão dificuldades no início porque existem muitas variáveis a serem ajustadas. Demonstrando esta técnica hoje estará Hazel May, uma aluna de graduação em nosso laboratório. Para começar, fixe e seccione cuidadosamente cérebros de roedores conforme descrito no protocolo textual complementar e, em seguida, armazene-os com cuidado a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários.

Quando estiver pronto para continuar com o protocolo, retire as lâminas do congelador e descongele-as à temperatura ambiente. Após o descongelamento, coloque as lâminas em uma grade e lave-as três vezes em PBS, durante cinco minutos cada. A partir deste ponto, não permita que as seções sequem.

Seque as bordas dos lâminas e faça um contorno repelente a líquidos ao redor da borda do lâmina com uma caneta pap para garantir uma cobertura uniforme do líquido e reduzir os efeitos de borda. Em seguida, bloquee as seções adicionando 300 microlitros de soro em PBS a cada lâmina. O soro deve ser da espécie em que o anticorpo secundário foi produzido.

Neste caso, foi utilizado soro de jumento. Certifique-se de que a solução bloqueadora alcance a borda da lâmina e cubra completamente o tecido. Para evitar coloração irregular, coloque as lâminas em uma câmara úmida para incubação à temperatura ambiente por uma hora.

Durante a incubação, prepare os anticorpos primários diluindo o anticorpo IBA um para 5.000 e o anticorpo pan-neuronal um para 500 em uma mistura contendo 1% de soro de jumento. Em PBS, remova a solução bloqueadora e adicione 300 microlitros da solução de anticorpos, que contém ambos os anticorpos de interesse. Além disso, prepare três lâminas controle.

Adicione 300 microlitros do IVA, uma diluição isolada em um lâmina, 300 microlitros da diluição do anticorpo pan-neuronal isolada em uma segunda lâmina e 300 microlitros de soro de jumento 1% em PBS. Em uma terceira lâmina, coloque todas as lâminas em uma câmara úmida e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as lâminas três vezes em PBS, durante cinco minutos cada.

Prepare a mistura do anticorpo secundário fluorescente diluindo ambos na proporção de um para 250 em soro de jumento a 1% em PBS. Adicione 300 microlitros da mistura em cada lâmina e coloque as lâminas em uma câmara úmida à prova de luz por 60 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas três vezes em PBS, durante cinco minutos cada, e, por fim, enxágue-as em água destilada duas vezes.

Proteja as lâminas da luz durante a lavagem. Em PBS, adicione algumas gotas de um meio de montagem aquoso que ajuda a preservar a intensidade do sinal fluorescente a cada lâmina. Em seguida, cubra, coloque a lamínula e remova as bolhas de ar remanescentes usando um aplicador de algodão para selar o meio de montagem nas lâminas e evitar que os cortes sequem.

Cubra as bordas com esmalte. As lâminas são deixadas para secar na posição horizontal por uma hora em uma caixa protegida da luz antes de serem armazenadas em um recipiente opaco à luz, envolto em papel alumínio, a quatro graus centígrados. Após a secagem do esmalte, leve as lâminas para a sala de microscopia para aquisição de imagens.

Prepare o ambiente desligando as luzes do teto e bloqueando quaisquer outras fontes de luz externa. Ligue o microscópio, a fonte de luz fluorescente e o computador de imagem. Em seguida, coloque uma lâmina na platina do microscópio e coloque-a em foco.

Usando o software fornecido, ajuste a exposição para cada comprimento de onda separadamente. Evite expor o espécime à luz por longos períodos para prevenir o desbotamento fotônico da amostra. Em seguida, adquira imagens em cada canal sem mover a seção ou ajustar o foco.

Combine as imagens usando o software de imagem e salve-as para análises posteriores. Usando o protocolo de coloração descrito acima, imagens fluorescentes como as mostradas aqui podem ser facilmente obtidas: no canal vermelho, as microglias positivas para IBA1 aparecem claramente, e no canal verde, os neurônios positivos para pan neuronal se destacam acima do fundo. As imagens controle para ambas as colorações com anticorpos aparecem.

Rotulagem dupla escura com IBA1 e marcador pan-neuronal mostrada aqui demonstra principalmente micróglias ramificadas com longas projeções neuronais finas evidentes em todas as camadas corticais. Resultados de coloração como os mostrados aqui também são possíveis se a qualidade do tecido for ruim. A má qualidade do tecido é evidenciada pela ausência de corpos celulares bem definidos e por processos microgliais e neuronais fragmentados.

Existe uma falta de nitidez na coloração de micróglias e uma ausência completa de coloração neuronal, tornando a imagem sobreposta sem significado ao tentar esta técnica. É importante cobrir uniformemente as seções e lembrar-se de não deixá-las secar entre os passos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão das técnicas introdutórias de imunohistoquímica.