Método de Isolado Ex Vivo Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo consistente de perfusão pulmonar ex vivo em ratos que produza resultados reprodutíveis. O primeiro passo é canular a traqueia e iniciar a ventilação mecânica. Em seguida, a artéria pulmonar e o átrio esquerdo são canulados.

A etapa final é remover o bloqueio coração-pulmão da cavidade torácica e colocá-lo no circuito de perfusão pulmonar ex vivo. Em última análise, sensores de pressão, transdutores de peso e um analisador de gases sanguíneos são usados para mostrar a condição do pulmão em tempo real, medindo a pressão arterial pulmonar e outros parâmetros. A profusão pulmonar ex vivo é uma tecnologia notável que nos permitiu expandir o pool de doadores para transplante de pulmão.

Prevemos que, por meio dessa tecnologia para servir como uma plataforma para avaliação de órgãos, podemos melhorar a qualidade dos órgãos que estão sendo trazidos para transplante e os resultados gerais do transplante. Aqui no laboratório de cobre, cunhamos a frase armar o órgão, avaliando, remodelando ou reparando e, em seguida, modificando o órgão para melhorar a qualidade e, assim, melhorar os resultados do transplante. Desenvolvemos um modelo robusto e reprodutível de pequenos animais de perfusão pulmonar ex vivo.

Através deste vídeo, demonstraremos as etapas principais e críticas para você desenvolver esse modelo de perfusão pulmonar ex vivo, que pode servir como uma plataforma para pesquisa de perfusão e transplante. Comece configurando o circuito EVLP e circulando o perfuso quente oito por todo o sistema. Defina o banho-maria, o trocador de calor e o tórax artificial para 37 graus Celsius.

Passe um gás de oxigenação desoxi através do PERFUSE oito no filtro de gás para garantir que ele tenha aproximadamente 6% de oxigênio dissolvido para o experimento. Após abrir o programa de aquisição de dados, conecte o transdutor de pressão da artéria pulmonar, traqueal, transdutor de pressão diferencial, fluxo respiratório, transdutor de pressão diferencial, transdutor de peso pulmonar e transdutor de velocidade da bomba à caixa conversora analógica para digital. Por fim, monte a mesa de operação e prepare todas as ferramentas e suprimentos operacionais necessários para o procedimento.

Após verificar a sedação pelo dedo do pé, pinçar, colocar o animal anestesiado em decúbito dorsal na mesa cirúrgica. Comece a gravar dados usando o programa de aquisição de dados. Quando estiver pronto, entre na cavidade abdominal e injete heparina na veia cava inferior.

Seguindo os procedimentos padrão, canule a traqueia e conecte a cânula a um circuito de ventilação. Ligue o ventilador mecânico para começar a ventilar mecanicamente os pulmões. Em seguida, retraia a cavidade torácica para expor os pulmões, tomando cuidado para evitar tocá-los.

Remova o timo e desloque o conteúdo abdominal para um lado para expor a veia cava inferior ou a veia mesentérica. Após a eutanásia, coloque uma sutura de seda atrás da artéria pulmonar e da aorta. Em preparação para proteger a cânula da artéria pulmonar, faça uma incisão de dois a três milímetros na superfície anterior da via de saída do ventrículo direito e insira a cânula na artéria pulmonar principal.

Prenda com sutura de seda, remova os coágulos da vasculatura pulmonar perfundindo aproximadamente 15 mililitros de uma solução eletrolítica positiva com baixo teor de potássio através da artéria pulmonar e saindo pelo ápice do coração. Em seguida, posicione uma sutura de seda atrás do coração e ao redor dos ventrículos. Para dilatar a válvula mitral e facilitar a canulação, insira um pequeno par de pinças cirúrgicas no ápice através da válvula mitral e no átrio esquerdo.

Quando estiver pronto, insira uma cânula no ápice através da válvula mitral e no átrio esquerdo. Prenda a cânula do átrio esquerdo com a sutura de seda. Em seguida, conecte a cânula da artéria pulmonar ao circuito de PPEV.

Certifique-se de que a linha de entrada proveniente do circuito esteja preparada com perfusível oito. Para evitar que o ar entre no coração e nos pulmões, ligue a bomba peristáltica principal e ajuste-a para uma velocidade baixa. Isso permitirá que o perfusivo oito percorra a artéria pulmonar e saia do ventrículo esquerdo para a cavidade torácica.

Monitore a pressão da artéria pulmonar para garantir que ela não aumente indicando um bloqueio ou uma canulação deficiente. Quando estiver pronto, desligue a bomba peristáltica. Conecte a cânula da artéria pulmonar ao circuito de perfusão pulmonar ex vivo.

Não conecte a cânula do átrio esquerdo ao circuito até que o bloqueio coração-pulmão tenha sido removido do corpo. Remova o bloqueio coração-pulmão clampeando o esôfago com um hemostático e cortando abaixo da pinça para que o esôfago possa ser usado para elevar as estruturas cardiopulmonares sem rodeios, dissecar o tecido circundante e cortar a aorta descendente e os vasos auxiliares para liberar o bloqueio coração-pulmão enquanto o eleva através do esôfago. Tranecte a traqueia para liberar o bloqueio coração-pulmão e coloque-o no local designado no circuito EVLP.

Em seguida, conecte a cânula do átrio esquerdo à linha de saída e inicie a bomba peristáltica. Para registrar dados de ventilação e monitorar a pressão rapidamente, remova a linha de ventilação da parte superior do aparelho EVLP e conecte o invólucro aos sensores de pressão. Em seguida, reinsira a linha de ventilação na parte superior do aparelho EVLP.

Certifique-se de que a armadilha de bolhas esteja adequadamente preenchida com perfuse oito. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos pulmões durante os primeiros 15 minutos, altere lentamente as configurações de ventilação e perfusão para os níveis experimentais desejados. Aumente a taxa de fluxo de perfusão para a taxa e pressão desejadas durante esta fase inicial de aumento também.

Recomenda-se programar o ventilador para produzir respirações laterais intermitentes para facilitar o movimento do fluido para fora do espaço pulmonar e retardar o aparecimento do edema. Defina o tempo zero como o tempo em que os parâmetros de ventilação estão em um volume corrente de quatro mililitros por quilograma positivo. Pressão expiratória final em dois centímetros.

Os parâmetros de H2O e perfusão estão em seus níveis esperados e permanecem constantes. Se desejar, pegue Perfuse oito amostras do congelamento instantâneo da porta de amostra em nitrogênio líquido e observe a hora em que as amostras foram coletadas. Quando o experimento estiver concluído, isole todas as peças anatômicas necessárias para a coleta e congele-as rapidamente em nitrogênio líquido ou coloque-as em solução de fixação para estudos posteriores.

O peso pulmonar de ratos Sprague dolly machos não mudou significativamente ao longo de 60 minutos de perfusão pulmonar ex vivo após os primeiros 10 minutos. Também não houve alteração na pressão arterial pulmonar. Da mesma forma, a resistência vascular pulmonar não foi alterada durante toda a duração do estudo.

Após uma hora de ventilação em altos volumes correntes e alto peep, as concentrações de citocinas pró-inflamatórias aumentaram no PERFUSE oito, enquanto as concentrações de citocinas anti-inflamatórias permaneceram inalteradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das principais etapas necessárias para estabelecer um modelo de profusão pulmonar ex Viva de pequenos animais em ratos em seu laboratório.