Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

O objetivo do experimento a seguir é ser capaz de obter imagens de macromoléculas em seu estado hidratado congelado com o microscópio eletrônico de transmissão. Isso é conseguido mergulhando rapidamente a grade com a amostra no criogênio para obter uma amostra vitrificada fina. Como segunda etapa, a amostra é exposta ao feixe de elétrons, que formará uma imagem de projeção das macromoléculas.

Em seguida, as imagens são processadas no computador para obter a reconstrução 3D da macro molécula. Os resultados mostram uma estrutura 3D altamente detalhada da macromolécula, sua confirmação e a localização 3D de seus parceiros moleculares. Existe uma vantagem principal desta técnica, de outros métodos de preparação de amostras para eletromicroscopia.

Na criogenia, a imagem é formada diretamente pelos elétrons dentro da macromolécula. Isso reflete mais fielmente, sua estrutura quase nativa. Uma demonstração visual desse método é crítica.

A preparação da grade criogênica e é transferida para o microscópio eletrônico é difícil de aprender devido à complicação adicional ao trabalhar em temperaturas criogênicas, O ciclo de aquecimento é usado no início da sequência de bombeamento e após uma sessão de crio EM. Para iniciar este procedimento, insira o suporte criogênico em uma das portas de bombeamento da estação de bombeamento. Inicie a opção de ciclo de aquecimento.

No controlador de estágio frio, abra a válvula borboleta V dois e, quando o vácuo na estação de bombeamento turbo se estabilizar e ler 10 elevado a menos três volta, ou melhor, abra a válvula borboleta V um. Uma vez que a temperatura no suporte esteja estável acima da temperatura ambiente e o ciclo de aquecimento esteja completo. Baixa V um e interrompe o ciclo.

Em seguida, inicie a opção de ciclo de luz ze e selecione o tempo necessário para atingir um bom vácuo na faixa de um a dois vezes 10 elevado a menos quatro tor. Quando o vácuo atingir 10 elevado a menos três para a faixa, abra a válvula de evacuação DU B três e a válvula no suporte criogênico. Quando o ciclo estiver completo, as válvulas subiram na ordem oposta em que foram abertas.

Usando uma pinça, deixe um pedaço de MICA para expor duas novas superfícies. Coloque as novas superfícies de mica expostas voltadas para cima em um pedaço de papel branco em uma placa de Petri. Depois de colocar a placa de Petri no frasco de um evaporador de carbono, execute a sequência de bombeamento até que o vácuo esteja abaixo de 10 a menos seis para cobrir a mica com uma fina camada de carbono.

Em seguida, transfira o carbono fino para a grade. Que um pedaço de mica revestida de 0,5 por um centímetro e flutue o carbono na superfície plana da água deionizada filtrada. Usando a pinça, coloque o lado sagrado de carbono da grade em contato com a superfície superior da camada de carbono flutuante e pegue-o.

Coloque a grade com o lado de carbono voltado para cima em uma lâmina de vidro de 7,5 por 2,5 centímetros coberta com filme de energia. Em seguida, coloque a lâmina de vidro na câmara do equipamento de descarga luminescente e feche a câmara. Bombeie a redoma e brilhe.

Descarregue por 20 segundos a 25 miliamperes e sete vezes 10 elevado a menos dois milibares. Neste ponto, ligue o aparelho de congelamento por imersão. Puxe o recipiente Ethan para baixo enchendo o reservatório com nitrogênio líquido.

Assim que o nitrogênio líquido parar de ferver, coloque a ponta do tubo proveniente do tanque Ethan na câmara interna e abra a válvula muito lentamente. Liquefaça o etano na câmara interna e encha-o a um milímetro do topo. Ligue a umidade.

Em seguida, carregue uma grade em uma pinça e carregue de três a cinco microlitros de amostra na superfície de carbono da grade sagrada. Depois de esperar que a amostra seja absorvida pela grade, execute o blotting Para obter um blush de camada líquida fina, congele a grade mergulhando-a no etano líquido. Remova cuidadosamente o conjunto da grade da pinça do etano líquido e transfira-o para a câmara externa contendo nitrogênio líquido.

Em seguida, transfira a grade para uma pequena caixa de grade imersa no nitrogênio líquido. Neste ponto, insira o suporte criogênico na estação de trabalho de transferência criogênica. Encha o fazedor do suporte criogênico e o recipiente da estação de trabalho com nitrogênio líquido.

Transfira rapidamente a caixa de grade criogênica contendo a grade hidratada congelada para o nitrogênio líquido na estação de trabalho. Depois de abrir a caixa da grelha criogênica, pegue a grelha hidratada congelada e coloque-a no slot do porta-amostras. Em seguida, coloque o anel do clipe no topo da grade e pressione-o suavemente com a extremidade romba da ferramenta do anel do clipe e até que esteja firmemente encaixado no lugar.

Em seguida, feche o obturador criogênico. Complete o anti-contaminado TEM com nitrogênio líquido. Incline novamente o microscópio stage para menos 60 graus.

Em seguida, inicie o ciclo da câmara de ar PrepU no microscópio. Assim que a sequência da câmara de ar da bomba terminar, insira o suporte do coro na câmara de ar e conecte o frio stage cabo de controle ao suporte para monitorar a temperatura. Depois que a luz vermelha se apagar, gire o suporte para a posição de zero grau para sua inserção na coluna de alto vácuo do T EM.

Retraia o obturador criogênico e abra as válvulas da coluna. Ative o programa de baixa dose no modo de pesquisa. Centralize o palco e defina a altura central usando o wobbler alfa para balançar o palco mais ou menos 15 graus, selecione um orifício adequado e coloque-o no centro do campo com o controlador de palco XY.

Mude para o modo de foco e foque a imagem. Em seguida, sob foco, a imagem entre 0,5 e 4,5 mícrons. Mude para o modo de exposição e grave a imagem.

Por fim, retorne ao modo de pesquisa para selecionar o próximo furo e repita a sequência. Imagens microscópicas obtidas pelos métodos de coloração negativa e crio EM para quatro espécimes representativos com diferentes características estruturais são comparadas aqui: os capsídeos de vírus adeno-associados corados negativamente revelam partículas semelhantes a vírus e o crio EM mostra que eles estão vazios. As imagens do vírus do mosaico do tabaco mostram hastes helicoidais com o canal central preenchido com mancha na coloração negativa e vazio nas imagens criogênicas EM.

O KLH se reúne em barris característicos mostrando seis estrias em imagens de coloração negativa e crio-EM. Vistas laterais retangulares e circulares e em vistas revelam um vazio em uma estrutura por crio EM no receptor de odo. Características intrincadas da superfície, como uma cruz central e uma depressão central, manifestam-se como acúmulo de manchas por coloração negativa e como regiões de menor densidade por crioem.

Exemplos típicos de artefatos criogênicos EM são gelo cristalino, contaminação por gelo, astigmatismo e estruturas semelhantes a teias. A análise de partícula única e a reconstrução 3D do receptor de ine hidratado congelado revelam sua estrutura simétrica quádrupla. O domínio citoplasmático forma um prisma quadrado e contém vários domínios gulares reprodutíveis formando uma estrutura semelhante a um andaime.

Com resolução de 10 angstrom, é possível visualizar alfa HELOCs 3D. O mapeamento de diferenças pode revelar a posição de ligantes importantes. As mudanças de confirmação fornecem uma visão dinâmica da macro molécula.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras criogênicas EM de alta qualidade. O Cryo EM, combinado com o processamento de imagens, permitiu aos pesquisadores explorar a estrutura, a organização da subunidade e a dinâmica conformacional de máquinas macromoleculares.