Amostra Estratégias Preparação para Mass Spectrometry imagem da cultura celular 3D Models

O objetivo geral deste procedimento é preparar culturas celulares tridimensionais e analisá-las por imagem de espectrometria de massas. Isso é realizado primeiramente construindo culturas celulares tridimensionais e permitindo que cresçam até o tamanho desejado. O segundo passo é colher e embutir as culturas celulares tridimensionais em gelatina.

Em seguida, os cultivos celulares tridimensionais são cortados a menos 30 graus Celsius, utilizando um criostato, e montados em lâminas condutivas. O passo final consiste em analisar os cortes por meio de um instrumento de IMS-MALDI e realizar a análise das moléculas detectadas. Em última instância, a espectrometria de massas por imagem é utilizada para demonstrar as alterações na distribuição de analitos de diversas classes diferentes de biomoléculas ao longo do cultivo celular tridimensional.

A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como microscopia de massa ou auto-radiografia, é que a imagem por espectrometria de massas permite a detecção e localização de múltiplos analitos, tais como proteínas, lipídios, fármacos e metabólitos, em um único experimento, sem necessidade de marcação com anticorpos. Para demonstrar o procedimento, contaremos com Dorothy Alf Wheatcraft, eu mesmo, um pós-doutorando, e Shin Li, um estudante de pós-graduação do laboratório de Hamman. Antes de iniciar este procedimento, cultive uma linhagem celular apropriada, como a linhagem de carcinoma de cólon HCT 116, em cultura de camada única bidimensional. Em seguida, adicione 0,19 gramas de aros a 10 mililitros de meio padrão em um tubo cônico de 50 mililitros.

Certifique-se da incorporação por meio de mistura suave, depois autóclave o agros em banho-maria por 20 minutos utilizando um pipetador múltiplo. Adicione 50 microlitros da mistura de meio Agros nas 60 cavidades centrais de uma placa de cultura de 96 poços com fundo plano. Como as cavidades nas bordas periféricas da placa apresentam taxas de evaporação ligeiramente mais altas, adicione 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1x em vez do agros nessas bordas.

Após a adição da mistura de aros aos poços internos, deixe a placa de lado para esfriar até aproximadamente 37 graus Celsius antes da adição das células. Neste ponto, adicione 200 microlitros da solução celular apropriada à placa de 96 poços revestida com aros, cubra a placa e coloque-a em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius para o crescimento celular. Após a incubação, troque o meio cuidadosamente aspirando o meio antigo ao redor do pequeno cultivo celular tridimensional no fundo dos aros.

Em seguida, adicione 200 microlitros de meio fresco cuidadosamente sobre o cultivo celular tridimensional. Prepare uma solução de aproximadamente 175 miligramas por mililitro de gelatina em água de alta pureza. Agite a gelatina vigorosamente após a solução tornar-se viscosa e difícil de manipular.

Coloque o tubo em banho-maria a aproximadamente 60 graus Celsius, aquecendo até que a solução fique límpida e fácil de aspirar. Usando uma pipeta serológica de dois mililitros, deposite 0,6 mililitros da solução morna de gelatina nos poços de uma placa de fundo plano com 24 poços. Posicione imediatamente os cultivos celulares tridimensionais lavados diretamente sobre a camada de gelatina, utilizando uma pipeta de dois mililitros diferente para evitar romper a estrutura tridimensional.

Após as culturas celulares serem colocadas sobre a superfície da camada de gelatina, pipete cuidadosamente mais 0,6 mililitros da mistura de gelatina morna sobre elas, de modo a não perturbar sua posição. A seguir, congele. As culturas celulares tridimensionais embutidas em gelatina devem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius.

Uma vez que a placa de 24 poços contendo as culturas celulares tenha sido retirada do congelador, aqueça a base da placa com a mão até que as pinças possam deslizar suavemente ao longo da lateral do poço. Em seguida, mova suavemente as pinças em torno do disco, soltando a gelatina sem descongelar o centro.

Adicione uma gota de água ao suporte do criostato e adira o disco de gelatina ao suporte. Em seguida, coloque no criostato para congelar. Após remover o excesso de gelatina para expor as culturas celulares tridimensionais, corte-as lentamente com um movimento suave em seções de 12 a 16 micrômetros.

Uma vez que os cortes tenham sido descongelados, monte-os em lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e titânio. Após rotular as lâminas, armazene-as em um dessecador para detecção de proteínas intactas. Lave os cortes com acetona fria para remover moléculas pequenas, como lipídios, que poderiam mascarar o sinal.

Prepare a matriz em uma solução de solvente orgânico e água com 0,1% de ácido tricloroacético. Use uma seringa de ponta fina para aplicar 0,5 microlitros da solução da matriz sobre o fragmento de cultura celular tridimensional. Após permitir que a matriz cristalize, seque as lâminas em um dessecador por pelo menos 30 minutos antes da MSI por MALDI.

Na análise neste ponto, encaixe as lâminas em um adaptador feito para segurar com segurança lâminas de 75 milímetros por 25 milímetros, a fim de imaginar os cortes de cultura celular tridimensional. Em seguida, carregue o adaptador de lâmina no instrumento. Após desenvolver os métodos apropriados de aquisição de dados, ajuste a faixa de massa para a aquisição de dados de moléculas pequenas entre 101, 000 razão carga/massa e para proteínas entre 8, 020 e 5, 000 razão carga/massa.

Em seguida, ajuste a frequência da potência do laser, o número de disparos a laser e o tamanho do ponto utilizando a solução de calibração e uma fatia tridimensional de cultura celular sacrificial próxima. Salve este método para uso no software de imagem fornecido pelo fabricante do instrumento. Desenvolva métodos de aquisição de dados proteicos para a faixa de massa escolhida conforme descrito anteriormente.

Em seguida, configure os parâmetros específicos do instrumento de MS utilizando o software de imagem. Após selecionar os parâmetros do instrumento e configurar a posição do método de controle do instrumento, defina onde escanear a cultura celular tridimensional. Em seguida, selecione três pontos de referência apropriados na amostra, movendo o laser para cada um deles.

Por sua vez, obtenha a fotografia óptica a partir do software de controle do laser MALDI TOF utilizando a função de captura de tela. Em seguida, inicie o processo de imageamento pelo software de imageamento e adquira espectros de massa de cada fatia para análise direcionada. Realize a análise manual dos espectros clicando em uma massa no espectro médio.

Por fim, realize análises estatísticas com os conjuntos de dados extraídos em software matemático. A imagem por espectrometria de massas tem o potencial de revelar diversas distribuições moleculares em culturas celulares tridimensionais. Utilizando o método descrito anteriormente, espécies desde pequenas moléculas até grandes proteínas podem ser rastreadas ao longo da cultura.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar, seccionar e analisar culturas celulares tridimensionais por imagem por espectrometria de massas.