Name: Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a avaliar o impacto da fumaça de cigarro em modelos de tecido 3D brônquico e nasal usando interface ar-líquido. Este método mede frequência de batimento ciliar e integridade tecidual para toxicologia respiratória.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Maurice Smith e Marja Talikka para a sua revisão do manuscrito.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Este estudo foi financiado pela Philip Morris International.

Aqui, nós têm demonstrado a aplicabilidade de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas humanas para avaliar o impacto da exposição repetida CS. Como uma alternativa para testes em animais, foram desenvolvidas uma série de sistemas de exposição para as avaliações toxicológicas de exposição ao aerossol in vitro (eg., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estes módulos de exposição também pode ser utilizado para uma avaliação toxicológica dos poluentes transportados pelo ar, partículas em suspensão, nanopartículas, etc. Neste estudo, foi utilizado o sistema Vitrocell que pode acomodar até 48 amostras diferentes simultaneamente, permitindo experiências de maior escala e menor variabilidade entre tratamentos. Para cada exposição ao aerossol in vitro, o risco de contaminação da cultura de tecido continua a ser um grande risco cuja atenuação exige uma manipulação cuidadosa das culturas de tecido durante todo o experimento. Medindo a deposição de partículas em tempo real sobre o microbalança de e durante oXposure experimento permite monitorar se as doses CS geradas a partir do sistema de exposição estão em conformidade com as expectativas. Para garantir a precisão da deposição de partículas medida, estabelecendo-se a medição on-line corretamente antes da exposição é critial, por exemplo, a criação de escala a 0. Além disso, por causa da diferença entre as áreas da microbalança (cm 2) e o inserção de cultura de tecido (0,33 cm 2), foi ajustado o cálculo final para a área da inserção de cultura: apenas 33% da deposição na microbalança reflectir a deposição efectiva na lâmina de cultura. Medição da TEER verificar funcionalidade barreira tight-junção e avaliar rompimento da camada epitelial é um procedimento relativamente fácil de implementar, o que nós informamos aqui. No entanto, porque os modelos de tecido brônquico e nasal contém células caliciformes intercaladas produtoras de muco, lavagem apical precisa ser realizada antes dos meas TEERmedi-. A lavagem apical é crítica, pois a presença da camada de muco e a variabilidade da sua espessura pode enviesar a medição de TEER, ou seja, interferindo com o impacto da exposição CS. Esta noção está de acordo com o que foi relatado por Hilgendorf e colegas, em que a permeabilidade de células Caco-2 foi afectada pela co-cultura com a linha de células caliciformes produtoras de muco HT29 23. O muco precisa ser lavado antes da medição TEER, porque lavagem apical à direita antes da exposição pode interferir com as respostas teciduais para CS. Por conseguinte, a medição é realizada três dias antes da exposição, e não antes da exposição à direita. Nós mostramos que a atividade CYP1A1 / CYP1B1 pode ser medida a partir dos modelos de cultura organotypic seguintes exposição CS embora a atividade foi apenas modestamente aumentou CS. Este sinal fraco pode ser amplificado por um mais longo de incubação do substrato de CYP1A1 / 1B1 (ie., Luciferina-CEE), por exemplo, para24 horas (dados não mostrados). Uma das limitações da medição da actividade CYP no presente trabalho é a ausência de normalização ao nível da proteína CYP ou para a contagem de células, o que pode ser tomado em conta para futuros estudos para assegurar que a alteração na actividade da enzima não é influenciada pela alteração do nível ou da proteína ou a contagem de células. Nós relataram que a exposição CS inibiu o batimento ciliar, tanto na modelos de tecido dos brônquios e nasal. Observações semelhantes foram feitas em diversos mamíferos e não mamíferos modelos 12. Para ciliar batendo medição, assegurando que os tecidos são tratados e tratados de um modo semelhante é crítico, por exemplo, se a mudança meio é realizada, deverá ser aplicado para todas as amostras. Sutto e colegas relataram que afetou o pH ciliar mamíferos batendo frequência 24. Assim, quando se comparam batendo frequências entre as células tratadas com diferentes misturas / compunds, pHDeve ser considerado ajuste para minimizar a variabilidade da medição da batimentos ciliares. Além disso, a temperatura na qual a medição é conduzida também é crítico que a frequência de batimento ciliar gotas com a diminuição da temperatura. Para minimizar a variabilidade devido a essas mudanças, uma incubadora fase de topo, equipados com a temperatura, CO2, e para controlo de humidade foi usada neste estudo. Apesar disso, observou-se que o batimento ciliar freqüências nos tecidos bronquiais após a exposição CS foram altamente variável (ie., Aumentar em um insert e diminuir na outra inserção), sugerindo que o batimento ciliar é certo altamente perturbado após a exposição. Em contraste, observou-se a ausência de frequências de batimento ciliar mensuráveis ​​no tecido nasal após exposição CS, sugerindo que a resposta do tecido nasal é mais sensível e mais consistente. Isto está de acordo com uma publicação anterior mostrando que o tecido nasal tem uma menor capacidade de desintoxicar comoem comparação com o brônquio 25. Finalmente, mostrou-se que a expressão do gene a partir do perfil de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas expostos a CS poderiam demonstrar um impacto de CS no metabolismo xenobiótico. Curiosamente, a alteração observada no metabolismo xenobiótico no brônquica organotípicas e nasal em modelos in vitro expostos a CS assemelhar-se à situação in vivo em fumadores como discutido em maior detalhe numa publicação anterior 15. Para análises de expressão de genes, utilizando o instrumento robotizado faz uma análise de alto rendimento possível. Além disso, a manipulação robótica automática aumenta ainda mais a consistência ea precisão dos resultados de expressão gênica. No entanto, a recolha rápida das amostras de tecido foi fundamental para evitar a degradação de RNA durante a extracção de ARN. O processamento de RNA e abordagens transcriptómico descritos aqui também podem ser aplicados a amostras de tecido in vivo.

Os pulmões são direta e constantemente expostos ao ar inalado que pode conter diversos tóxicos, como poluentes e constituintes da fumaça do cigarro (CS). Estudar o impacto da exposição a esses tóxicos nos tecidos respiratórios é mais informativo quando feito de maneira semelhante à exposição in vivo. Em comparação com as culturas de células imersas 2D clássicas (por exemplo, células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE)), os modelos de tecido organotípico 3D recapitulam melhor os aspectos morfológicos, fisiológicos e moleculares do epitélio das vias aéreas humanas in vivo1,2: os modelos de tecido 3D contêm a diversidade dos tipos de células observados in vivo, incluindo células epiteliais diferenciadas, células ciliadas e não ciliadas, células caliciformes e células basais. Eles têm junções estreitas funcionais e exibem um fenótipo mucociliar 1-3. Além disso, as culturas podem ser cultivadas em membrana porosa permeável, em interface ar-líquido, permitindo exposição direta ao aerossol no lado apical (enquanto o lado basolateral é imerso em meio de cultura) 3-5. Dvorak e colegas relataram que os perfis de expressão gênica de modelos de tecido brônquico eram semelhantes aos obtidos a partir de escovações brônquicas humanas 3. Além disso, Mathis e colegas mostraram que as respostas desses modelos teciduais à EC foram semelhantes às diferenças observadas entre células epiteliais brônquicas obtidas de fumantes e células obtidas de não fumantes 6. Finalmente, como os modelos de tecido brônquico podem ser cultivados por vários meses 4,5, eles podem ser usados para examinar os efeitos da exposição a longo prazo dos itens de teste. 
As avaliações de citotoxicidade são parâmetros comuns medidos após insultos químicos ou para avaliar a toxicidade de compostos ou misturas específicas. Por exemplo, a integridade da membrana pode ser medida por um ensaio luminescente e permite a medição de um efeito citotóxico dependente da dose na cultura de células 7. No entanto, para avaliar os efeitos fisiopatológicos dos compostos em concentrações subtóxicas, outros parâmetros devem ser medidos. Por exemplo, a integridade do tecido determinada usando o ensaio de resistência elétrica transepitelial (TEER) garante a funcionalidade das junções apertadas e monitora a ruptura da camada epitelial 8,9. A frequência de batimentos ciliares também permite a medição dos efeitos relacionados ao EC nos tecidos respiratórios. Uma frequência normal de batimentos para os cílios que revestem o trato respiratório superior e inferior é importante para proteger contra infecções das vias aéreas 10. Cada uma das células epiteliais colunares ciliadas do epitélio respiratório tem 200-300 cílios batendo em uma determinada frequência para eliminar agentes infecciosos ou material particulado inalado preso no muco liberado pelas células caliciformes intercaladas 11. A CS contém substâncias químicas que podem inibir o batimento ciliar 12, levando a uma proteção reduzida do trato respiratório. Este trabalho mostra que o batimento ciliar pode ser medido em modelos de tecidos organotípicos. Essa abordagem permite avaliar se as células epiteliais exibem sua função normal na cultura de tecidos organotípicos. O CS também ativa as respostas do metabolismo xenobiótico no trato respiratório para metabolizar os constituintes da fumaça do tabaco 13. A atividade das enzimas do metabolismo xenobiótico de fase I, CYP1A1 e CYP1B1, dos modelos de tecido pode ser medida. Além disso, como relatado anteriormente, a expressão gênica global pode ser medida nos modelos de tecido brônquico organotípico 6,14,15. Uma abordagem de dados transcriptômicos e biologia de sistemas baseada em rede é aproveitada para avaliar o impacto do CS no metabolismo xenobiótico 15. 
As metodologias usadas para expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D ao CS convencional usando um sistema de exposição in vitro e para medir as respostas teciduais a essa exposição em comparação com a exposição ao ar fresco (controle) são detalhadas aqui.

<table><tbody><tr><td>MucilAr-fibroblastos humanos-brônquios</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Genebra, Suíça</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Meio de Cultura</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Genebra, Suíça</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Alemanha</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F cigarro de referência</td><td>Universidade de Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>máquina de fumar carrossel de 30 portas SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera e software CiliaMetrix</td><td>La Haute &Eacute; cole de Gestion (HESGE), Genebra, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Leica DMIL&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz LED</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de pauzinho STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Reagente de Detecção de Luciferina&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento MagNA Lyser&nbsp;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Alto rendimento 3' Kit IVT Express</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação do impacto da exposição repetida de organotípicas 3d brônquica e cultura nasal tissue models para whole fumo do cigarro

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

A fumaça do cigarro (CS) tem um grande impacto na biologia pulmonar e pode resultar no desenvolvimento de doenças pulmonares, como doença pulmonar obstrutiva crônica ou câncer de pulmão. Para entender os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da doença, seria importante examinar o impacto da exposição ao CS diretamente nos tecidos pulmonares. No entanto, essa abordagem é difícil de implementar em estudos epidemiológicos porque a amostragem de tecido pulmonar é complexa e invasiva. Alternativamente, os modelos de cultura de tecidos podem facilitar a avaliação dos impactos da exposição no tecido pulmonar. Culturas de células 2D submersas, como culturas de células epiteliais brônquicas humanas normais (NHBE), têm sido tradicionalmente usadas para esse fim. No entanto, não podem ser expostos diretamente ao fumo de forma semelhante à situação de exposição in vivo. Modelos de cultura de tecidos 3D desenvolvidos recentemente refletem melhor a situação in vivo porque podem ser cultivados na interface ar-líquido (ALI). Seus lados basais estão imersos no meio de cultura; enquanto seus lados apicais estão expostos ao ar. Além disso, culturas de tecidos organotípicos que contêm diferentes tipos de células, representam melhor a fisiologia do tecido in vivo. Neste trabalho, é demonstrada a utilização de um sistema de exposição in vitro para expor modelos de tecido brônquico e nasal organotípicos humanos à SC convencional. A frequência de batimentos ciliares e a atividade do citocromo P450s (CYP) 1A1/1B1 foram medidas para avaliar os impactos funcionais do CS nos tecidos. Além disso, para examinar as alterações induzidas por CS em nível molecular, perfis de expressão gênica foram gerados a partir dos tecidos após a exposição. Um ligeiro aumento na atividade do CYP1A1 / 1B1 foi observado em tecidos expostos ao CS em comparação com tecidos expostos ao ar. Uma abordagem de biologia de sistemas baseada em rede e transcriptômica foi suficientemente robusta para demonstrar alterações induzidas por CS do metabolismo xenobiótico que eram semelhantes às observadas nas células epiteliais brônquicas e nasais obtidas de fumantes.

Em resultados descritos a seguir, os tecidos eram organotypic células epiteliais humanas primárias isoladas de saudável, não-fumadores, doadores caucasianos e foram reconstituídos usando fibroblastos 15. Os modelos de tecido nasal e bronquial 3D Em brônquica vitro e modelos organotípicas nasais assemelham ao nível celular do epitélio do tracto respiratório humano (Figura 2). Exposição CS Os modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas pode ser repetidamente exposta a corrente principal CS na interface ar-líquido. O procedimento experimental exposição ao fumo utilizados para os resultados ilustrados aqui está representado na Figura 1. Gravação do batimento ciliar O batimento ciliar foi gravado nos tecidos expostos ao ar, como ilustrado nos vídeos. Exposição CS foi associado a uma redução da frequência de batimento ciliar: o pico mais forte observada em torno4 Hz na farsa exposto antes da exposição e não é observado por mais tempo após a exposição ao CS (Figura 3). Esta frequência reduzida faria os cílios batendo menos eficiente para remover o muco e agentes infecciosos 22. Medição da TEER e CYP1A1 atividade / 1B1 TEER foi medida 48 horas após a última exposição a assegurar o tecido ainda está funcional. CYP1A1 / 1B1 actividade também foi medida 48 h após terminada a exposição, como se ilustra na Figura 1. Os valores TEER nos tecidos CS-expostos não foram significativamente diferentes quando comparados com os tecidos expostos ao ar confirmando que não há efeito citotóxico principal de fumo a esta concentração. No 48 h pós-exposição, CYP1A1 / 1B1 actividade dos tecidos foi ligeiramente aumentada, indicando um aumento modesto do mecanismo de defesa do tecido após a exposição (Figura 4). Gene perfis de expressão e sistemas baseados em rede biologia abordagem para estudar o impacto da exposição CS sobre a alteração do metabolismo de xenobióticos Os tecidos foram coletados 48 horas após a exposição pontos de tempo. Posteriormente, a análise de microarray foi conduzido para gerar perfis de expressão gênica do CS- e tecidos expostos ao ar. Impacto da exposição CS sobre o metabolismo de xenobióticos foi investigada através de uma abordagem de biologia de sistemas baseados em rede alavancada a partir dos perfis de expressão genética e como foi dito anteriormente 15. Usando uma abordagem de biologia de sistemas à base de rede mostra que os impactos da exposição CS ao nível da espinha dorsal nós no modelo de rede metabolismo de xenobióticos foram bem correlacionados entre o in vitro e in vivo em conjuntos de dados (Figura 5). Em contraste, a nível de cada indivíduo mudanças de expressão genética, foram observadas correlações pobres entre a in vitro (CS-expostos vs. exposto ao ar) e in vivo (fumantes vs. não-fumantes). Figura 1. procedimento esquemático da exposição repetida de CS para os modelos organotypic tecidos bronquiais Abreviaturas:. CYP, citocromo P450; CS, fumaça de cigarro; TEER, resistência elétrica transepitelial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Figura 2. organotípicas brônquica e modelos de cultura de tecidos epiteliais nasais. Dos desenhos ilustra o brônquica (A) e nasal (B) de cultura de tecidos de inserção na interface ar-líquido. Os modelos in vitro continha células ciliadas mostrados na camada apical das células coradas hematoxilina e eosina (C para brônquico, nasal para D), tal como relatado anteriormente 15. Os modelos foram co-cultivadas com fibroblastos que são importantes<html> para o crescimento e diferenciação de células epiteliais (indicado pelas setas). Coloração de marcadores de linhagem das vias aéreas: p63 (E para brônquica, F para nasal) e MUC5AC (G para brônquica, H para nasal) são mostrados como relatado anteriormente 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Figura 3. O batimento ciliar Frequency. Cilia freqüência de batimento (CBF) foi medido em expostos ao ar e na cultura antes e após a exposição. Diminuição da CBF, após exposição CS (resultados representativos de dois insert são mostrados como replicar 1 (R1) e replicar 2 (R2)). ad / 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Medição da CYP1A1 atividade e TEER / CYP1B1. Pannels esquerda indicam a atividade de CYP1A1 / CYP1B1 no nasal (B) Os modelos de tecido dos brônquios (A) e. Painéis da direita indicam a medição TEER no brônquica (C) e nasal (D) Os modelos de tecido. Meios ± SD são mostrados. Abreviaturas: CS, fumaça de cigarro; CYP, do citocromo P450; TEER, resistência elétrica transepitelial; RLU, unidade luminescense relativa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Figura 5. Foram utilizados sistemas baseados em rede biologia abordagem para a avaliação do impacto da exposição CS no contexto de metabolismo xenobiótico. As alterações dos níveis de expressão dos genes para calcular a activação de nó do eixo principal do modelo de rede do metabolismo xenobiótico (A) </<html> strong&gt; como relatado na publicação anterior 15. A figura à direita ilustra o conceito de quantificação dos nós de backbone, também conhecido como &quot;valor backbone da rede diferencial&quot;, usando a abordagem NPA. As ovais azuis representam a actividade dos nós de esqueleto (isto é., A camada funcional) e as esferas verdes representam a expressão de genes (isto é., A camada de transcrição). Impactos da exposição CS nos tecidos bronquiais organotypic (in vitro, CS-expostos vs. exposto ao ar) foram comparados ao 48 h de pós-exposição aos do tabagismo sobre epitelial brônquica humano coletado por broncoscopia e nasal epitelial por burshing corneto inferior (GSE16008 ) (in vivo, os fumantes contra os não-fumantes) (B). As inserções, a correlação da expressão do gene muda entre o in vitro e em conjuntos de dados in vivo. Abreviaturas: CS, fumaça de cigarro; NPA, perturbação de amplitude rede.&quot;target =&quot; _ ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste protocolo é expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D humanos à fumaça de cigarro convencional (CS) na interface ar-líquido. O impacto do CS nos tecidos é então investigado usando um ensaio de atividade do citocromo P450, uma medição de batimento de cílios e uma abordagem de biologia de sistemas.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o impacto da exposição repetida de modelos organotípicos de cultura de tecidos brônquicos e nasais 3D à fumaça total do cigarro. Isso é feito pela primeira cultura de modelos de cultura de tecidos organotípicos, brônquicos e nasais na interface ar-líquido. O segundo passo é gerar aerossol com uma máquina de fumar e expor as culturas de tecidos de acordo com o desenho experimental em um sistema de exposição.Em seguida, o impacto da exposição é avaliado medindo a frequência de batimentos ciliares e a integridade tecidual da cultura. A etapa final é medir as trocas de transcriptoma induzidas pelo aerossol usando a tecnologia de microarray. Em última análise, uma abordagem de biologia de sistemas baseada em rede usada para mostrar o impacto da fumaça total do cigarro na cultura de tecidos.A principal vantagem dessas técnicas dos métodos existentes em toxicologia respiratória é que as abordagens estão alinhadas com os requisitos da agência reguladora para encontrar alternativas aos testes em animais, elas permitem a avaliação dos efeitos da exposição de curto prazo à fumaça do cigarro em células cultivadas na interface ilíquida, mimetizando as condições que ocorrem no trato respiratório humano. Para iniciar o experimento, adicione 0,7 mililitros de meio de cultura pré-aquecido a cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Em seguida, remova a embalagem de tecido e transfira as inserções de cultura de tecido para a placa de 24 poços recém-preparada.Mantenha a cultura de tecidos em uma incubadora e substitua o meio a cada dois dias durante a troca de meio. Examine os tecidos sob um microscópio óptico para garantir que estejam livres de contaminação e que não haja vazamento de mídia. Três dias antes dos experimentos de exposição, lave o lado apical da cultura de tecidos com 200 microlitros de meios de cultura.Em seguida, pré-aqueça a câmara climática do sistema in vitro e o módulo base de cultivo a 37 graus Celsius. Depois de aquecido, encha o módulo base de cultivo com 17,5 mililitros de mídia por linha. Remova os tecidos da incubadora e transfira as inserções de cultura de tecidos da placa de cultura para o módulo de base de cultivo do sistema de exposição in vitro.Em seguida, cubra o módulo de base de cultivo com uma tampa de vidro. Transfira os tecidos para a câmara climática para exposição à fumaça de cigarro convencional ou cs. Gere fumaça de cigarro usando uma máquina de fumar carrossel calibrada de 30 portas.Fume os cigarros em um padrão, mas com comprimento de aproximadamente 35 milímetros a 55 mililitros. Sopre por mais de dois segundos, duas vezes por minuto e oito segundos de tempo de exaustão da bomba. A fumaça do cigarro convencional gerada é acumulada e liberada no sistema de exposição in vitro.Exponha os tecidos por seis a sete minutos. Depois de transferir os tecidos de volta para uma placa de cultura, coloque-os de volta na incubadora por uma hora. Remova as placas de cultura de tecidos da incubadora e deixe-as sob o capô em temperatura ambiente por 30 minutos para estabilizar o batimento CLIA.Após a estabilização, observe os tecidos sob um microscópio óptico conectado ao software de cliometria. Em seguida, registre a frequência do batimento ciliar, medindo a frequência a cada três segundos por um minuto e 48 horas. Após a exposição, adicione 200 microlitros de meios de cultura ao lado apical dos tecidos epiteliais brônquicos humanos e meça a resistência do tecido inserindo um eletrodo de pauzinho no meio basal e no meio recém-adicionado no lado apical da cultura de tecidos sem tocar no tecido.Após as medições, remova suavemente o meio do lado apical das culturas de tecidos usando uma pipeta de paster conectada a uma bomba de vácuo e retorne os tecidos à incubadora. Para medir a atividade enzimática do citocromo P quatro 50, prepare uma nova placa com substrato de Lúcifer e CEE previamente preparado e transfira as inserções para essa cobertura de placa e incube as inserções de tecido durante a noite. Após a incubação, transfira 50 microlitros de meios de cultura de cada inserção de tecido para uma placa luminométrica branca opaca de 96 poços à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 50 microlitros de reagente de detecção de Lúcifer a cada poço e incube a placa em temperatura ambiente por 20 minutos. Quando a incubação terminar, meça a luminescência com o luminômetro. Colete a placa de inserções de tecido organotípico 3D da incubadora e lave cada inserção na placa três vezes com PBS frio e aspire o PBS com uma pipeta passada entre as lavagens.Após a última lavagem, aspire o PBS e cubra a placa para evitar que o inserto seque. Em seguida, corte a membrana de inserção para cada inserção da placa até que a membrana fique plana na lâmina. Transfira o tecido da lâmina para o tubo de homogeneização e aperte a tampa do tubo.Em seguida, agite, vortex e coloque em gelo seco. Descongele e triture amostras com o instrumento de homogeneização a 6.000 RPM por 45 segundos. Deixe por cinco minutos em temperatura ambiente e, em seguida, adicione 140 microlitros de clorofórmio à amostra e vortex novamente por 15 segundos.Transfira toda a amostra do tubo de homogeneização para um tubo de bloqueio de fase. Coloque-o em um agitador térmico e agite por dois minutos a 1400 RPM em temperatura ambiente. Em seguida, deixe por dois minutos em temperatura ambiente.Quando a agitação estiver completa, gire o tubo por 15 minutos a quatro graus Celsius a 12.000 G. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros. Siga com lavagem, suspensão e purificação por precipitação de RNA. Uma vez extraídos, os RNAs são verificados quanto à qualidade.Para avaliar a quantidade e a integridade, prepare o sistema de manuseio de líquidos e a síntese alvo. Coloque o RNA extraído. As placas e todos os reagentes necessários e desgastes de laboratório no robô.As primeiras concentrações de RNA serão normalizadas. Em seguida, o baralho será alterado para as próximas etapas, desde a amplificação até a rotulagem, purificação e fragmentação. Em seguida, a mistura de hibridização é adicionada a 33 microlitros do RNA A fragmentado e rotulado para desnaturar as amostras e pré-umedecer a matriz com 200 microlitros de pré-hibridização.Misture do kit de lavagem e coloração de hibridização. Em seguida, coloque o chip no forno de hibridização ajustado a 45 graus Celsius e 60 RPM por 10 minutos. Remova o tampão de pré-hibridização e carregue 200 microlitros da amostra.Incube a matriz por 16 horas a 45 graus Celsius e 60 RPM no forno. Aspire o coquetel do chip e encha o microarray com 250 microlitros de tampão de lavagem a. Abra o software e execute o fluidics na barra de menus do software.Selecione o módulo de interesse e os quatro principais 50 programas para cada módulo. Atribua o chip certo a cada módulo digitalizando o código de barras do chip e coloque os chips no sistema fluídico. Por fim, certifique-se de que o scanner esteja quente.Em seguida, carregue o chip no carregador automático do scanner e digitalize o microarray. A frequência de batimentos CELIA ou FSC do tecido nasal foi medida antes e após a exposição ao ar ou fumaça de cigarro ou cesariana. O FSC e o tecido nasal foram mais lentos após a exposição ao ces.Uma menor frequência de batimentos do CLIA reduz a eficiência na remoção de muco e agentes infecciosos. Análises de microarranjos foram conduzidas para estudar os impactos da exposição ao SC em modelos organotípicos, brônquicos e de tecido nasal. 48 horas após a exposição.Este impacto da SC in vitro foi comparado ao impacto do tabagismo no tecido epitelial brônquico humano coletado por broncoscopia e escovação epitelial nasal, respectivamente. A biologia de sistemas baseada em rede mostra uma correlação positiva entre os nós de backbone de conjuntos de dados in vivo e in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que esta é uma área de pesquisa em desenvolvimento.Existem dois componentes principais, de um lado, uma plataforma de exposição a aerossóis bem caracterizada e, do outro lado, um sistema experimental relevante que pode consistir em um modelo tridimensional de cultura de tecidos que melhor imita a arquitetura específica, as pistas bioquímicas e mecânicas, bem como a interação celular do microambiente relevante para o tecido ou órgão-alvo. Sob investigação.

impact-assessment-repeated-exposure-organotypic-3d-bronchial-nasal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Células epiteliais nasais, obtidas através de biópsia superficial raspar de voluntários humanos, são expandidas e transferido para tecido inserções de cultura. Ao atingir a confluência, as células são cultivadas na interface ar-líquido, obtendo-se culturas de células ciliadas e não ciliadas. Culturas de células epiteliais nasais diferenciados fornecem modelos experimentais para o estudo de viáveis ​​da mucosa respiratória.

A cultura de células epiteliais nasais Humano na interface ar líquido

O objetivo deste protocolo é fornecer métodos automatizados para quantificar patologias pulmonares crônicas em um modelo murino de DPOC. O protocolo inclui a exposição de camundongos à fumaça de cigarro (CS), medição da função pulmonar, insuflação dos pulmões e uso de métodos de morfometria para medir o enfisema e a remodelação das pequenas vias aéreas em camundongos.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

Os usuários de cigarro eletrônico (e-cig) estão a aumentar em todo o mundo. Pouco, no entanto, é conhecido sobre os efeitos de saúde induzidos por aerossóis inalados e-cig. Este artigo descreve uma técnica de geração de aerossol e-cig apropriada para exposições de animais e estudos toxicológicos posteriores. Esses protocolos são necessários para estabelecer sistemas de exposição experimentalmente reproduzíveis e padronizada e-cig.

Geração de aerossol de cigarro eletrônico por um dispositivo de máquina-Vaping de terceira geração: aplicativo para estudos toxicológicos

Apresentamos um sistema robusto, transferível e preditivo de exposição in vitro para a triagem e monitoramento de partículas transmitidas pelo ar sobre sua citotoxicidade pulmonar aguda, expondo células pulmonares humanas cultivadas na interface ar-líquido (ALI).

Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

Descrito aqui é um protocolo para estudar como o extrato de fumaça de cigarro afeta a colonização bacteriana em células epiteliais pulmonares.

Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

Este protocolo demonstra o estudo dos efeitos fisiofisiológicos da fumaça do cigarro (SC) com um sistema de exposição de inalação total (WBI) construído internamente. Este sistema pode expor animais a CS sob condições repetíveis controladas para pesquisa de efeitos mediados pela CS em enfisema pulmonar e hematopoiese.

Exposição à fumaça de cigarro em camundongos usando um sistema de inalação de corpo inteiro

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Aqui, descrevemos um modelo in vitro para isolar e diferenciar células epiteliais das vias aéreas murinas, com foco em sua aclimatação ao extrato de fumaça de cigarro crônico (CSE). O modelo pode ser utilizado para caracterizar de forma abrangente o impacto multi-ômico do CSE, o que possivelmente fornece informações sobre as respostas celulares sob exposição crônica à fumaça.

Modelo in vitro para estudo da diferenciação e alterações de multiômicas em células epiteliais das vias aéreas murinas estimuladas com extrato de fumaça de cigarro

Aprenda a avaliar o impacto da fumaça de cigarro em modelos de tecido 3D brônquico e nasal usando interface ar-líquido. Este método mede frequência de batimento ciliar e integridade tecidual para toxicologia respiratória.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

Explorar mais vídeos