Transformada de Fourier de alta definição infravermelho (FT-IR) espectroscópica por imagem das secções de tecidos humanos para a melhoria da Patologia

A imagem espectroscópica de infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) é uma abordagem rápida e sem rótulos para obter conjuntos de dados bioquímicos de células e tecidos. Aqui, demonstramos como obter imagens FT-IR de alta definição de seções de tecido para melhorar o diagnóstico da doença.

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens infravermelhas de alta definição de amostras de tecido. Isso é feito primeiro seccionando amostras de tecido em lâminas compatíveis com infravermelho. O segundo passo é configurar um aparelho de imagem de alta definição instalando as objetivas apropriadas.

Em seguida, o fundo do substrato é coletado e a amostra de tecido é escaneada. A etapa final é usar o software apropriado para processamento e visualização de dados. Em última análise, a imagem infravermelha de alta definição é usada para visualizar e obter informações bioquímicas de tecidos biológicos de maneira não perturbadora.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia de luz, é que a bioquímica inerente do tecido pode ser estudada sem o uso de corantes ou sondas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave para a patologia de campo, como prever a recorrência da nefropatia diabética e classificar a progressão da doença hepática por meio da osteogênese automotiva HEPA. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico e prognóstico da doença, uma vez que fornece grandes quantidades de informações bioquímicas não disponíveis na histopatologia tradicional.

Embora este método possa ser usado para diagnóstico. Ele também pode ser usado para rastrear as mudanças no processo de cicatrização de feridas e identificar as principais características do tecido, como células-tronco no trato gastrointestinal e no cérebro. Primeira seção de bloco de tecido embebido em parafina formal e fixa com quatro micrômetros de espessura em uma lâmina compatível com IR usando um micrótomo.

Depois disso. Purgue o microscópio e o espectrômetro FTIR usando ar seco para remover a água atmosférica do sistema. Em seguida, resfrie o detector de matriz de plano focal e o detector interno de telureto de mercúrio e cádmio no microscópio usando nitrogênio líquido, monte a lâmina de amostra no estágio do microscópio para imagens FTIR depois de garantir que a luz visível esteja acesa, concentre-se na amostra usando o programa de captura de amostra.

Em seguida, abra o pacote de software do pacote e clique em coletar. Clique em diagnóstico e selecione um espectrômetro de linha. Em seguida, clique em configuração de imagem para calibrar o sistema.

Na guia óptica, selecione detector como detector de microscópio terrestre à esquerda e, em seguida, selecione transmitância no modo óptico. Clique em configuração, que abrirá a janela de controle do lanceiro para o modo de transmissão no controle do lanceiro. Clique no raw usando o joystick de controle de palco e observe a visualização ao vivo da imagem do Interferograma FTIR se mover para uma área limpa do slide.

Neste ponto, ajuste o tempo de integração para aproximadamente 8.000 contagens e a objetiva do condensador inferior. Para aumentar o número de contagens ao máximo, observe a forma da imagem inferior direita no controle do lanceiro para garantir que ela tenha uma aparência gaussiana e relativamente uniforme. Depois de ajustar o tempo de integração, novamente, mova o palco para encontrar um pedaço de tecido com estrutura, de preferência a borda de um tecido.

Em seguida, aperfeiçoe o foco da imagem. Usando o stage joystick de controle, mova-se para uma área limpa do slide. Pressione o botão calibrar após selecionar.

Ok, duas vezes na guia óptica, selecione detector igual a MCT e detector de microscópio é igual a certo. Em seguida, clique em configuração. Assim que o interferograma FTIR for visualizado na tela, clique em encontrar explosão central e ok.

Na guia óptica, selecione novamente o detector igual ao detector do microscópio terrestre igual à esquerda. Em seguida, selecione configuração. Depois de garantir que a imagem ainda esteja em uma área limpa no controle do lanceiro, clique em calibrar novamente e ok.

Para coletar uma imagem FTIR de fundo, vá para a guia eletrônica e selecione uma resolução espectral apropriada, que normalmente é de quatro ou oito centímetros inversos. Para tecido, vá para a guia de plano de fundo e digite 128 em varreduras para coad. Selecione o botão novo arquivo e coloque o arquivo de fundo na pasta apropriada.

Depois de clicar em segundo plano e aguardar a conclusão da verificação, confirme onde salvar o arquivo. Clique em uma região no plano de fundo, imagem FTIR e verifique o espectro. Neste ponto, clique em configuração e, no controle do lancer, use a visualização IR ao vivo.

Para encontrar a área de interesse, vá para a guia eletrônica e digite o número de varreduras a serem coad. Em seguida, clique em digitalizar Para preparar o microscópio FTIR para análise de alta definição, aparafuse a objetiva de alta ampliação no lugar da objetiva de 15 x. Neste ponto, abra o software de processamento e análise de imagens e carregue o arquivo de dados IR.

Aplique um algoritmo de correção de linha de base aos dados de infravermelho selecionando ferramentas espectrais, role para baixo e clique em espectros absorventes. Quando o menu pop-up for exibido, selecione correção de linha de base. Execute a normalização espectral selecionando espectros normalizados nas opções do menu de espectros absorventes.

Em seguida, observe uma lista de todas as frequências IR coletadas na imagem. Clique nas frequências que correspondem a biomoléculas específicas para observar uma imagem do tecido na frequência selecionada para criar imagens que permitirão a visualização de diferentes componentes biomoleculares. Clique nas ferramentas espectrais e selecione as taxas de altura de pico.

Digitalize a seção de tecido corado adjacente correspondente usando um sistema de imager de lâminas inteiro separado que captura imagens de campo claro junto com a imagem IR. Traga a imagem digital do tecido corado com o programa de imagem visível. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na imagem em uma região de interesse e selecione o perfil Z para fornecer as informações espectrais no pixel selecionado.

Para marcar pixels específicos na imagem, clique com o botão direito do mouse na imagem e selecione a ferramenta ROI. Crie as classes que devem ser rotuladas, por exemplo, classes de cápsula de Meum e Bowman. Em seguida, selecione o ponto do tipo ROI depois disso, selecione a classe para selecionar os pixels e desenhe os pixels apropriados na imagem IR.

Derive os espectros médios para cada uma das classes usando a ferramenta de ROI médio. Finalmente, compare os espectros derivados plotando. No software gráfico, a imagem FT IR permite a derivação de imagens IR de tecido que podem fornecer diferentes contrastes dependendo da frequência IR.

Cada pixel é composto por todo o espectro com diferentes picos correspondentes a diferentes biomoléculas que podem fornecer informações sobre as propriedades bioquímicas dos tipos de células ou estados de doença. A instrumentação FTIR evoluiu da medição em um modo de mapeamento de ponto único usando aberturas opacas para o modo de imagem usando objetivas de granulação CASA usando uma objetiva de iluminação, acoplada a uma objetiva de coleta no modo de transmissão, ou uma única objetiva que ilumina e coleta no modo de reflexão. Os avanços na resolução espacial para imagens de tecidos têm sido de importância crítica, pois os tipos de células e estruturas de tecidos agora podem ser identificados.

Nesse caso, as unidades funcionais dos glomérulos renais foram observadas em um núcleo de tecido hepático. É possível visualizar hepatócitos e regiões de fibrose infiltrante que dividem duas áreas distintas de displasia e cirrose não displásica. O aumento da resolução espacial permite o isolamento de características estruturais específicas que podem ser quimicamente modificadas pela doença antes que as alterações histológicas sejam aparentes.

Alterações bioquímicas nas estruturas glomerulares renais, como cápsula de Bowman, meum, membrana basal glomerular e membrana basal tubular, podem ser identificadas por meio de imagens FTIR. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de desaguardar totalmente os slides antes de digitalizar após este procedimento. Outros métodos, como a análise imunoquímica tradicional, podem ser realizados na mesma seção de tecido para correlacionar as assinaturas bioquímicas e a morfologia do tecido.

Nosso primeiro desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imagem de tecidos explorarem o status biomolecular de pequenos tipos de células e estruturas dentro dos tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão básica de como obter imagens FTR de alta definição de amostras de tecido e realizar análises espectrais básicas. Não se esqueça de que trabalhar com nitrogênio líquido pode ser extremamente perigoso e precauções de segurança, como luvas crioseguras e óculos de segurança, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.