Name: Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Aprenda a criar ensaios bioreporter com Burkholderia sartisoli para avaliar a biodisponibilidade de fluoreno em sistemas não saturados. Este método permite monitorar a degradação de contaminantes orgânicos em tempo real.

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O financiamento da Fundação Ambiental Alemã (DBU) é reconhecido. Os autores agradecem a Ute Kuhlicke pela ajuda técnica com a análise do CLSM e a Birgit Würz, Rita Remer e Jana Reichenbach pela ajuda experimental qualificada. Os autores gostariam de agradecer particularmente ao Prof. Jan Roelof van der Meer e ao Dr. Robin Tecon pela discussão frutífera e pelo fornecimento da cepa do biorepórter. Contribui para o programa de pesquisa 'Chemicals in the Environment' (CITE) da Associação Helmholtz.

1. Preparação de pratos, slides e incubação Chambers <ol><li> Prepare o seguinte material para cada microcosmo: um grande plástico Petri fundo prato (d = 10 cm), um modificado (veja o passo 1.2) plástico pequeno Petri fundo prato (d = 5 cm) com tampas e uma contagem de slides de câmara com três cavidades. </li><li> Pegue o número desejado de Petri partes inferiores prato (d = 5 cm). Retire parte da borda com uma serra para caber exatamente um slide (26 mm comprimento da aresta). Para esterilizar o sistema, embeber fundo do prato de Petri e tampas em etanol a 70% O / N e secá-las para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo de luz ultravioleta. Armazenar as placas de Petri em um recipiente de plástico hermeticamente fechado, o qual também tinha sido exposta à luz UV durante 2 h. </li><li> Limpar o número desejado de lâminas com etanol a 70% e ar-secá-las. Enrole slides em folha de alumínio e colocá-los em uma mufla durante 5 horas a 450 ° C, para remover eventuais contaminações. </li&gt; <li> Prepare câmaras de incubação de vidro com tampas. Limpe com 70% de etanol e expor câmaras abertas à luz UV por pelo menos 2 horas em uma câmara de fluxo. NOTA: dessecadores grandes (diâmetro de cerca de 30 cm) com tampas podem ser utilizadas para esta finalidade; cada secador pode abrigar até dez configurações microcosmo. </li></ol> 2. Preparação de Mídia e Cultura <ol><li> Para executar 20 microcosmos paralelas, obter 100 ml de meio de triptona de levedura modificada (MTY) 14, cerca de 150 ml de meio mínimo 16 21C (MM), 5 ml de meio mínimo de agar (MMA; 0,5%, w / v), três placas de agar de dextrose de batata (PDA; 1,5%, w / v) para P. ultimum, quatro placas em branco, uma placa de PDA contendo 2 mg L-1 de ciclo-heximida, quatro placas de agarose (3%, w / v) contendo 0,3 g ml -1 de carvão activado e 40 mg de FLU, em porções de 2 mg. </li><li> Prepare MTY contendo 50 mg L-1 de canamicina (canamicina é required para manter o plasmídeo repórter eGFP) e MM contendo 10 mM de acetato de cultivo bacteriano. Use MM sem acetato para preparar 0,5% MMA para a imobilização de bactérias nos microcosmos e despeje placas (a cada 20 ml) de 1,5% PDA para o cultivo de Pythium ultimum e microcosmo setups. </li><li> Inocular algumas hifas de P. ultimum em três placas de PDA fresco e incuba-se no escuro a 25 ° C durante cerca de 72 horas. Em seguida, garantir que as placas são cobertas completamente por micélio fresco e macio. </li><li> Inicie duas culturas de B. sartisoli RP037-MCHE em 50 ml de MTY de um estoque de glicerol. Incubar a 30 ° C com 230 rpm movimento frasco rotativo S / N. </li><li> Cultura Medir a densidade óptica (DO) a 578 nm e centrifugar a 1000 xg durante 10 min (para B. sartisoli RP037-MCHE, o OD 578 esperado é de cerca de 1,0 e as células estão em fase exponencial). Elimine o sobrenadante e re-suspender as célulasem uma quantidade apropriada de MM para atingir uma OD 578 de 0,4. Inocular 20 ml de MM contendo 50 mg L-1 canamicina com 400 ul das células ressuspensas. Incubar a 30 ° C com 230 rpm movimento frasco rotativo S / N. </li><li> Medir OD 578 da cultura em MM (por B. sartisoli RP037-MCHE, o OD 578 esperado é de cerca de 0,2 e as células estão em fase exponencial precoce). Cultura Centrifugar a 2.000 x g durante 10 minutos e re-suspender as células em uma quantidade apropriada de MM para atingir uma DO de 0,4. Misturar 50 ul da suspensão celular com 500 ul de quente, MMA líquido em tubos de 2 ml e armazenar a 50 ° C, até utilização. Use 150 ul de células no MMA para cada microcosmo. </li><li> Verter em placas de gel de agarose que contém carvão activado. Derreter de agarose (3%; w / v) em água duplamente destilada. Misture bem com carvão ativado (0,3 g ml -1) e despeje a mistura em pratos de plástico de Petri(D = 10 cm). </li></ol> 3. Microcosmo Montagem NOTA:. A configuração completa microcosmo está representado esquematicamente na Figura 1 Por favor, consulte a Figura 1 para todas as seguintes etapas individuais. Os passos seguintes são descrevendo a preparação de uma amostra (SAM) com vetores de transporte de micélio e três configurações de controle diferentes (Con Air, CON NEG, CON POS). Um resumo de todos os setups diferentes podem ser encontrados na Tabela 1. <ol><li> Tome número desejado de pratos e slides de Petri e expô-los à luz UV sob uma câmara de fluxo para 30 min. </li><li> Coloque a placa de Petri pequena dentro da grande e encaixar o slide com a abertura da pequena placa de Petri. Pegue uma amostra da suspensão de células quente no MMA e adicionar 150 mL na cavidade meio de um slide. Repita este passo até as cavidades médias de todos os slides sãopreenchido com o MMA. Esperar 5 min para o MMA para solidificar. </li><li> Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares de uma placa de PDA em branco. Coloque um adesivo de uma distância de 2 mm junto ao MMA dentro da pequena placa de Petri. Adicionar esta para promover o crescimento micelial na configuração (PDA 3 na Figura 1). </li><li> Corte remendos PDA curvas como barreiras mecânicas. Use uma parte do fundo pequena placa de Petri limpo e esterilizado e pressioná-lo em uma placa de PDA. Usar uma espátula para cortar outro anel menor a uma distância de 0,5 cm no agar que resulta em um anel de PDA. <ol><li> Corte um pedaço, que se encaixa exatamente na abertura da pequena placa de Petri na configuração do microcosmo e colocá-lo dentro do fosso na parte superior do slide. Assegure-se que a distância entre o MMA e a barreira PDA circular é de cerca de 2 mm. Feche a tampa da pequena placa de Petri pressionando-o suavemente na barreira PDA. </li><li> Repita os passos 3.4 e 3.4.1 com uma placa PDA contendo 2 g L -1de cicloheximida. NOTA: Esta é a configuração de controle para o transporte a bordo (CON AIR) para as células Bioreporter, desde mycelia são inibidos pela cicloheximida e não crescer demais MMA. </li></ol></li><li> Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares de uma placa de PDA em branco. Use outro 0,5 centímetros cortiça broca para cortar a metade do primeiro patch. Inserir o PDA-anel pequeno resultante a uma distância de 1 mm junto à barreira PDA (PDA 1 na Figura 1). </li><li> Adicionar 2 mg de FLU para o buraco de PDA 1. Use de 1 cm de cortiça broca para cortar manchas circulares de placas de PDA cobertas de P. ultimum e colocar um adesivo (PDA 2 na Figura 1) para baixo sobre a parte inferior do anel de PDA de modo que o tapete micelar está voltado para os cristais de FLU. <ol><li> Repita o passo anterior, sem adição de cristais gripe. NOTA: Esta é a configuração de controle negativo (CON NEG) para determinar fundofluorescência de células Bioreporter. </li></ol></li><li> Use uma rolha broca um centímetro para perfurar para fora manchas circulares do agar contendo carvão ativado. Coloque quatro sistemas em cada configuração microcosmo para diminuir ainda mais a concentração FLU gasoso (Figura 1). </li><li> Prepare um controlo positivo (CON POS). Adicione alguns cristais gripe para 200 mL de suspensão de células MMA e colocá-lo em uma cavidade de um slide de vazio. </li><li> Coloque uma placa de Petri (d = 10 cm), com um pouco de pó de carvão activado na parte inferior da câmara de incubação para minimizar a concentração de GRIPE gasoso na câmara. Além disso, coloque 4-5 50 ml copos com água estéril no fundo, para manter a umidade alta na câmara. <ol><li> Transferir configurações microcosmos em câmaras de incubação e incubar a 25 ° C durante 96 h. Colocar as amostras aleatoriamente nas diferentes câmaras de crescimento para excluir efeitos de localização. NOTA: Este tempo de incubação aplonas para o P. oomiceto ultimum. Poderia ser diferente para outros organismos. </li></ol></li></ol> 4. Confocal Laser Scanning Microscopy <ol><li> O ideal é usar uma configuração CLSM com microscópio vertical. NOTA: Pode ser equipado com lasers convencionais 488, 561 e 633 linhas nm para excitação ou com uma fonte de laser branco tunable oferta por exemplo,. </li><li> Utilize as seguintes definições para a coleta de imagens: Excitação: 490 nm (eGFP) e 585 nm (mCherry) na intensidade do laser apropriado (excitação simultânea); gamas de emissão: 500-550 nm (eGFP) e 605-650 nm (mCherry); lente objetiva: 63X NA 0,9 immersible água (devido à sua longa distância de trabalho); tamanho do passo para Z-stacks: 0,5 m. </li><li> Abrir configuração microcosmos e usar um bisturi para remover PDA 1, 2, 3 e a barreira PDA. Coloque uma lamela de vidro no topo do MMA e pressione-o suavemente para remover as bolhas de ar. Mount slides no palco microscópio. Adicionar uma gotícula de água na parte superior do poe tampa de deslizamento e usar as configurações mCherry para encontrar células Bioreporter na amostra. </li><li> Obter uma visão geral da amostra e otimizar a relação sinal-ruído, utilizando um brilho-over-under tabela de pesquisa para o vermelho (mCherry) e verde (eGFP) canal. Escolha uma posição aleatória na amostra para analisar Bioreporter fluorescência. NOTA: hifas pode mostrar autofluorescência na gama de emissão Bioreporter (por exemplo, a autofluorescência verde) 17. Certifique-se de selecionar áreas sem hifas se este for o caso. </li><li> Defina e registre-z pilhas para cada posição no verde (eGFP) eo (mCherry) canal vermelho. Evitar o branqueamento da amostra por exposição prolongada à luz ou luz laser de epifluorescência. <ol><li> Repita o passo anterior para dez aleatórios, posições distribuídas uniformemente. </li></ol></li><li> Repita todas as etapas usando as mesmas configurações para todas as amostras da pista de testes (SAM), CON AIR, CON NEG e CON POS. </li></ol&gt; Análise 5. Imagem NOTA: Para analisar vermelho (mCherry) e verde (eGFP) fluorescência na z-stacks gravadas, entre outras opções a ImageJ software livre 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) pode ser utilizado. <ol><li> Certifique-se de instalar o plugin logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/). </li><li> Abrir arquivo em ImageJ. Selecione &quot;canais Dividido&quot; e perto do canal verde. Use a macro &#39;área mCherry&#39; fornecido como arquivo suplementar código para quantificação da área de fluorescência vermelha no z-stack. Ajustar as definições preferidas no macro (indicado em negrito). <ol><li> A saída é uma tabela com os pixels medidos acima do limite (e acima do tamanho mínimo definido) na pilha z. NOTA: A soma de todos os valores é o número total de pixels vermelhos (área) na pilha. </li></ol></li><li> Abrir arquivo em ImageJ. Selecione &quot;canais Dividido&quot; e perto canal vermelho. Use a macro<html> 216; eGFP int &#39;fornecido como arquivo de código complementar para quantificar a intensidade de fluorescência verde na pilha z. Ajustar as definições preferidas no macro (indicado em negrito). <ol><li> A saída é uma tabela com as intensidades médias e área de todos os objetos verdes acima do limite (e acima do tamanho mínimo definido) em z-stack. Para calcular a intensidade total de pixels verdes na pilha, multiplique cada intensidade pela área correspondente dizer. </li></ol></li><li> Calcula-se a indução eGFP relativa (eGFP rel): <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) Observação: Uma vez que é expresso constitutivamente mCherry, o valor resultante de eGFP rel é uma medida relativa para a quantidade de eGFP expressa por uma certa quantidade de células. Por favor, consulte a Tabela 3 para obter mais informações sobre o cálculo do eGFP rel. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Quantificação Chemical NOTA: configurações microcosmos também pode ser usado para realizar a quantificação de quantidades química GRIPE translocados com ou sem um dissipador de contaminante abiótico. <ol><li> Enrole 15 ml frascos de vidro, 1 ml frascos GC / MS e inserções em folha de alumínio. Encha evaporação pratos com Na 2 SO 4; colocar tudo em forno de mufla durante 5 h a 450 ° C para remover possíveis contaminações. Guarde o Na 2 SO 4 dentro de um secador ativado. </li><li> Cortar PDMS fibras de vidro revestidas de 0,5 cm de comprimento. Lave fibras agitando quatro vezes 2 horas em metanol fresco. Repita as etapas de lavagem mais quatro vezes com água ultrapura e armazenar fibras limpas em água ultrapura num frasco de vidro selado. </li><li> Prepare a 1,5 L de tolueno / acetona (3: 1, v / v) contendo 10 mg L -1 fenantreno-10 d. </li><li> Siga as etapas 1, 2 e 3 do protocolo. Prepare microcosmos sem bioucélulas eporter estudar transporte FLU (SAM (-) e CON AIR (-)) e com células Bioreporter (SAM) para verificar a degradação FLU. <ol><li> Opcionais (sem células Bioreporter): Coloque três PDMS revestidas de fibras de vidro (geralmente utilizados para experiências SPME) como pia contaminante artificial e quantificável dentro MMA do SAM (-) usando uma pinça fina. </li><li> Retire as fibras de vidro usando uma pinça fina e transferir cada um em um GC / MS frasco com insert. </li><li> Adicionar 200 mL de tolueno e agitar verticalmente S / N e analisar através de GC / MS. Use as configurações definidas no Quadro 2. </li></ol></li><li> Transferir MMA a partir da cavidade do meio para um frasco de vidro de 15 ml e adicionar cerca de três espátulas de Na 2 SO 4. Misture bem com uma espátula e adicione 10 ml de solvente. Vortex da mistura e agitar horizontalmente O / N no escuro. <ol><li> Transferir 1001; l de amostra em GC / MS frasco com insert. Adicionar 10 ul de acenaftileno-d 08 (10 mg L-1) e analisar através de GC / MS usando o mesmo programa como descrito em 6.4.3. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesse financeiro conflitante.

A configuração microcosmo apresentado mostrou adequado para estudar a biodisponibilidade de substâncias químicas separadas espacialmente para degradar organismos após a absorção e transporte por micélio. Transporte em fase gasosa potencial de compostos voláteis parcialmente é impedido e células Bioreporter bacterianas podem ser visualizados sem elaborada a preparação da amostra e, portanto, com o mínimo de perturbação do sistema sensível. Ao mesmo tempo, a análise química da amostra pode ser facilmente conduzida para pe...

O solo é densamente povoada por uma vasta gama de microorganismos tais como bactérias 1,2. No entanto, as condições deste habitat são desafiadoras, especialmente em termos de disponibilidade de água 3. Bactérias permanentemente precisa procurar condições ótimas em ambientes heterogêneos 4, mas a ausência de filmes contínuos de água está resultando em mobilidade restrita 5 impedindo-os a se espalhar livremente. Além disso, as taxas de difusão dos solutos (por exemplo, nutrientes) são reduzidos sob condições não saturadas 6. Assim, as bactérias e os nutrientes são muitas vezes fisicamente separados e acessibilidade nutriente é limitada 3. Como conseqüência, um vetor de transporte de compostos químicos que não exige uma fase contínua de água pode ajudar a superar essas limitações. De fato, muitos microorganismos como fungos e oomycetes desenvolveram uma forma de crescimento filamentosas que lhes permite crescer através de poros cheios de ar e atingindo assim mobilizing também física nutrientes 7 e 8 carbonáceos substâncias separadas por longas distâncias. Eles podem até atuar como vetores de transporte biológicos que entregam açúcares e outras fontes de energia para as bactérias 9. Absorção e transporte de organismos micélio também foi mostrado para os poluentes orgânicos hidrofóbicos, tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) em Pythium ultimum 10 ou em fungos micorrízicos arbusculares 11. Desde PAH são contaminantes solúveis em água onipresentes e mal 12 no solo, transporte mediado por micélio pode ajudar a aumentar a biodisponibilidade de contaminantes para os potenciais degradadores bacterianas. Considerando que o montante total de transporte de contaminantes pode ser quantificada diretamente por meios químicos 10, biodisponibilidade de contaminantes transportados por micélio de bactérias que degradam e outros organismos não podem ser avaliados facilmente. O protocolo a seguir apresenta um método para avaliar o impacto da mycelia sobre a biodisponibilidade de contaminantes bacterianos para degradadores de forma direta; ele permite que a coleta de informações sobre o impacto espaço-temporal de contaminantes nos ecossistemas microbianos. Nós descrevemos como configurar um sistema de microcosmo insaturada elaborado imitando as interfaces ar-água no solo, ligando uma fonte pontual PAH fisicamente separado com bactérias Bioreporter HAP-degradante através de vectores de transporte de micélio. Como o transporte pelo ar é excluído, o efeito do transporte micelial-baseado em PAH biodisponibilidade para as bactérias podem ser estudados de forma isolada. Em mais detalhe, foram aplicados três anéis HAP fluoreno, o organismo micelial Pythium ultimum e o Bioreporter bactéria Burkholderia sartisoli RP037-MCHE 13 nas configurações descritas microcosmos. A bactéria B. sartisoli RP037-MCHE foi originalmente construído para estudar os fluxos fenantreno para a célula 14 e expressa a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), como resultado do fluxo de PAHa célula, enquanto que a fluorescência vermelha mCherry é expressa constitutivamente. Informações detalhadas sobre a construção repórter é dada pelo Tecon et al. 13 Em testes preliminares, a bactéria não revelaram natação e apenas capacidade swarming muito lento. Era capaz de migrar lentamente em hifas de Pythium ultimum, quando aplicado como uma suspensão densa no topo das hifas. Uma vez que as bactérias foram embebidas em agarose na seguinte protocolo, a migração em hifas não ocorreu. Usando a microscopia confocal por varrimento laser (MCVL), as bactérias Bioreporter pode ser visualizado directamente em microcosmos e expressão de eGFP pode ser quantificada em relação à quantidade de células (proporcional ao sinal de mCherry) com a ajuda do software ImageJ. Isto permite comparar qualitativamente a biodisponibilidade em diferentes cenários (isto é, maior ou menor). FLU foi encontrado para ser biodisponível após o transporte micelial por P. ultimum (isto é,foi maior do que no controlo negativo). Além disso, o protocolo descreve como para quantificar a quantidade total de transporte mediado por micélio através de meios químicos e para verificar a biodisponibilidade de contaminantes usando fibras de vidro revestidas com silicone (fibras de SPME) em microcosmos idênticos. Resultados usando esta configuração microcosmo têm sido publicados e discutidos para a combinação de P. ultimum, fluoreno e B. sartisoli RP037-MCHE 15. Aqui, o foco recai sobre a descrição do método detalhado e a identificação de potenciais armadilhas do protocolo para fornecer esse conhecimento para os potenciais novos pedidos. Outras aplicações podem envolver vários fungos, espécies de bactérias (por exemplo, de locais contaminados), e outros contaminantes (por exemplo, pesticidas) ou contaminante de alimentação (por exemplo, solos envelhecidos).

<table><tbody><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Versão 2.6.1; ou equivalente CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Series GC e Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>um equivalente GC/MS pode ser usado</td></tr> coluna <tr><td>capilar GC J& W 121-5522 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork Borer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>ou qualquer outra</td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>Alto desempenho, Sensor de alta performance WICOM</td></tr><tr><td></td><td></td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Tampas / septos para frascos com tampa de rosca</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampas para frascos de GC/MS</td><td>WICOM</td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas objetivas</td><td>Menzel</td><td></td><td>fibras de</td></tr><tr><td>vidro revestidas com PDMS</td> comuns <td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13,55&nbsp; &plusmn; &nbsp; 0,02&nbsp; &micro; l&nbsp; m-1</td></tr><tr><td>Petri Placas pequenas / grandes</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Frascos com tampa de rosca 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>outros frascos de vidro podem ser usados Frascos</td></tr><tr><td>com tampa de rosca 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>outros frascos de vidro podem ser usados</td></tr><tr><td>Acenaftileno d08</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Flúor</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L-1</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>P7171</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Meio Mínimo:</forte> 100 ml <forte>Solução 1</forte> + 25 ml <forte>Solução 2</forte> + 5 ml <forte>Solução 3</forte> ad. 1.000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 1</td></tr><tr><td>Ammonium sulfato</td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L-1&nbsp; </td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L-1</td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio x 4&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0,5 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solution 2</td></tr><tr><td>Fosfato dissódico</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55,83 g L-1</td></tr><tr><td>Fosfato monopotássico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L-1</td></tr><tr><td colspan="4">Solução 3 (pH 6.0)</td></tr><tr><td>EDTA MERCK Dissódico</td><td></td><td>1084180250</td><td>0.8 g L-1</td></tr><tr><td>Ferro(II) cloreto x 4&nbsp; H2O</td><td>MERCK</td><td>1038610250</td><td>0,3 g L-1</td></tr><tr><td>Cobalto(II) cloreto x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloreto de manganês(II) x 1&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L-1</td></tr><tr><td>Copper(II) sulfato</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Sodium molibdato x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Tin(II) cloreto x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4473.1</td><td>0.5 mg L-1</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Riedel-de-Haen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>11606</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Brometo de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Iodeto de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Cloreto de bário</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Meio mínimo + agarose 0,2%</td></tr><tr><td>Fenantreno d10</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Batata Dextrose Ágar: 24 g L-1 caldo + bacto-ágar 1,5%; pH 6,8</td></tr><tr><td>Caldo de batata Dextrose</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-ágar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Sódio</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mTY medium: 3 g&nbsp; L-1 extrato de levedura, 5&nbsp; g&nbsp; L-1 bacto triptona e 50 mM NaCl</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ com plug-in</td><td></td><td></td> logi tool <td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html e http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>Pythium ultimum cepa 67-1</td><td></td><td></td><td>Obtido no laboratório do Dr. Christoph Keel; Departamento de Microbiologia Fundamental, Universidade de Lausanne, Suíça</td></tr><tr><td>Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Obtido no laboratório do Prof. Jan Roelof van der Meer; Departamento de Microbiologia Fundamental, Universidade de Lausanne, Suíça</td></tr></tbody></table>

uma abordagem bioreporter celular todo avalie transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas sistemas

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

A biodisponibilidade de contaminantes é um pré-requisito para sua biodegradação efetiva no solo. A concentração média de um contaminante, no entanto, não é uma medida apropriada para sua disponibilidade; A biodisponibilidade depende da interação dinâmica da potencial transferência de massa (fluxo) de um composto para uma célula microbiana e da capacidade desta última de degradar o composto. Em partes do solo sem água saturada, os micélios demonstraram superar as limitações de biodisponibilidade transportando e mobilizando ativamente compostos orgânicos na faixa de centímetros. Enquanto a extensão do transporte baseado em micélios pode ser facilmente quantificada por meios químicos, a verificação da biodisponibilidade do contaminante para as células bacterianas requer um método biológico. Abordando essa restrição, escolhemos o fluoreno PAH (FLU) como um composto modelo e desenvolvemos um microcosmo modelo insaturado de água ligando uma fonte pontual de FLU espacialmente separada e a bactéria biorepórter degradadora de FLU Burkholderia sartisoli RP037-mChe por uma rede micelial de Pythium ultimum. Como o biorepórter expressa eGFP em resposta ao fluxo de PAH para a célula, a exposição e degradação bacteriana da FLU podem ser monitoradas diretamente nos microcosmos por meio de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). O CLSM e as análises de imagem revelaram um aumento significativo da expressão de eGFP na presença de P. ultimum em comparação com controles sem micélio ou FLU, indicando assim a biodisponibilidade da FLU para bactérias após o transporte mediado por micélios. Os resultados do CLSM foram apoiados por análises químicas em microcosmos idênticos. O microcosmo desenvolvido mostrou-se adequado para investigar a biodisponibilidade do contaminante e visualizar concomitantemente as interações bactéria-micelial envolvidas.

Os resultados aqui apresentados já foram publicados anteriormente 15. Por favor, consulte o artigo para discussão mecanicista e ambiental detalhado. Após a gravação de imagem via CLSM, a projeção de intensidade máxima pode ser realizada utilizando o respectivo software microscópio ou ImageJ para ganhar uma primeira impressão visual da amostra e os controles (Figura 2). Mais tarde, os conjuntos de dados podem ser projetadas de forma diferente, a fim de mostrar cara...

Um ensaio de todo Bioreporter celular com Burkholderia sartisoli RP037-MCHE foi desenvolvido para detectar frações de um contaminante orgânico (ou seja, fluoreno) disponível para a degradação bacteriana após o transporte ativo por micélio ponte poros cheios de ar em um sistema modelo insaturada água.

Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um ensaio biorepórter para monitorar diretamente a influência das redes miceliais na biodisponibilidade de contaminantes orgânicos. Isso é feito imobilizando bactérias repórter biológicas que expressam proteína fluorescente verde aprimorada ou EGFP em função da biodisponibilidade do contaminante na broca e aplicando-as em uma lâmina de vidro adequada. Em seguida, a fonte de contaminante é adicionada à configuração dentro de um anel de trado e o organismo micelial é inoculado em um remendo de trado em cima dele.Em seguida, o microcosmo é incubado até que o micélio tenha crescido demais em toda a configuração e o contaminante possa ser trans localizado ao longo da rede. Finalmente, as células biorepórter são visualizadas usando microscopia confocal de varredura a laser. Em última análise, a influência das redes miceliais na biodisponibilidade do flúor é avaliada pela quantificação da expressão de EGFP das células biorepórter usando software de análise de imagem.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a extração química de HAP, é que a biodisponibilidade do contaminante pode ser avaliada diretamente em um sistema

a-whole-cell-bioreporter-approach-to-assess-transport-bioavailability

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

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Uma Abordagem Bioreporter celular todo avalie Transportes e biodisponibilidade de contaminantes orgânicos em água insaturadas Sistemas

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