Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas de membrana expressas em SIA coli para análises estruturais e funcionais. Primeiro, as bactérias são colhidas, lisadas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) para visualização das proteínas GFP corretamente dobradas por fluorescência em gel. Na segunda etapa, a produção da e coli determinada para expressar as proteínas de membrana de interesse é ampliada e uma fração total de membrana é preparada a partir das células após a indução da expressão proteica.

Por fim, a fração total de membrana é solubilizada em quatro detergentes diferentes e a monodispersão das proteínas GFP solubilizadas por detergente é analisada por cromatografia de exclusão por tamanho. Em última instância, as proteínas podem ser monitoradas por fluorescência e os perfis de eluição plotados para avaliar a agregação, a monodispersão e a presença de GFP livre nas amostras.

A produção de proteínas de membrana recombinantes para estudos estruturais e funcionais permanece tecnicamente desafiadora devido à sua baixa solubilidade e à instabilidade inerente após a extração em detergentes. A experiência mostrou que a triagem de múltiplas variantes de proteínas de membrana, como ortólogos de diferentes espécies, pode melhorar a taxa de sucesso na expressão de proteínas de membrana. A fusão com proteínas verdes fluorescentes é utilizada para indicar dobramento autêntico.

O primeiro passo do nosso protocolo baseado em GFP para triagem da expressão de proteínas de membrana em *E. coli* utiliza a fluorescência em gel de lisados detergentes de células inteiras para identificar as construções de proteínas de membrana para análises posteriores com base no nível de expressão na triagem. O comportamento de proteínas de membrana com diferentes detergentes é então avaliado por meio da detecção de fluorescência acoplada à cromatografia de exclusão por tamanho, o que fornece informações sobre a monodispersão dos complexos proteína-detergente. Para analisar a expressão bacteriana induzida por IPTG, comece transferindo um mililitro de *E. coli* tratada com IPTG em duplicata a partir de culturas mantidas durante a noite para blocos de 24 poços profundos para blocos de 96 poços profundos, sela-se os blocos e, em seguida, centrifuga-se as células por 10 minutos a 6.000 ×g em temperatura ambiente.

Em seguida, inverta o bloco para decantar o meio, batendo suavemente sobre uma toalha de papel para drenar qualquer líquido remanescente. Selle novamente a placa e armazene as células a menos 80 graus Celsius após pelo menos 20 minutos. Descongele os pellets por 20 minutos à temperatura ambiente e, então, use uma pipeta multicanal para ressuspender completamente as células em 200 microlitros de tampão de lise.

Trate as células com 20 microlitros de solução DLPI sob agitação a 1000 RPM e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 25 microlitros de 10% DDM multissídio a cada poço e incube as células por mais 60 minutos com agitação. Após o tratamento com DDM, centrifugue o bloco de poços profundos e, então, transfira 10 microlitros do lisado clarificado para uma placa de microtitulação e adicione 10 microlitros de tampão de carga para gel SDS-PAGE.

Agora, carregue o gel com 10 microlitros da solução tampão de lisado por poço e execute o gel a uma voltagem constante entre 100 e 120 volts em uma câmara fria durante duas a 2,5 horas, até que o diafragma alcance a parte inferior. Coloque o gel em um sistema de imagem com filtro de luz azul para detectar as proteínas de fusão e ampliar os cultivos celulares. Após transformar uma Eloqua de E. coli competente, escolha uma colônia e transfira para 10 mililitros de caldo nutritivo para crescimento durante a noite a 37 graus Celsius.

Na manhã seguinte, dilua cinco mililitros da cultura mantida durante a noite em 500 mililitros de caldo power e continue o crescimento das culturas sob agitação a 250 RPM e 37 graus Celsius. Quando a DO a 595 nanômetros for aproximadamente 0,5, induza a expressão adicionando IPTG até uma concentração final de um milimolar e, em seguida, coloque a cultura novamente no agitador durante a noite, desta vez a 20 graus Celsius. Na manhã seguinte, recolha as células por centrifugação e armazene os pellets a menos 80 graus Celsius.

Para preparar as membranas celulares, re-suspenda os terceiros pellets à temperatura ambiente em cinco mililitros de PBS por grama de pellet celular, aumentando o volume conforme necessário até que a viscosidade diminua para uma consistência fluída. Em seguida, adicione cloreto de magnésio até uma concentração final de um milimolar, DNAs até uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e um comprimido preempacotado de inibidor de protease por 20 gramas de pellet celular às células.

Em seguida, rompa as células utilizando um disruptor celular gelado a uma pressão de 30 KPSI e, então, pelletize as células não rompidas e os detritos por 15 minutos a 30.000 vezes G e quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo de ultracentrifugação e colete a fração total de membrana centrifugando o sobrenadante por uma hora a 200.000 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, utilize o homogeneizador celular para ressuspender o pellet de membrana em 10 mililitros de PBS gelado para solubilizar as membranas para cada detergente a ser utilizado.

Aliquotar 900 microlitros da suspensão de membrana em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicionar 100 microlitros de cada detergente recém-preparado aos tubos de 1,5 mililitro apropriados e incubar as misturas a quatro graus Celsius com agitação suave. Após uma hora, centrifugar as frações detergente e solúvel em ultracentrífuga de bancada, garantindo que os tubos estejam pelo menos pela metade cheios, e recuperar o sobrenadante para cromatografia de exclusão por tamanho com detecção fluorescente ou análise FEC.

Em seguida, utilize uma coluna de exclusão por tamanho com faixa de fracionamento ampla, equilibrada com tampão de fluxo a uma taxa de 0,3 mililitros por minuto. Então, injete 100 microlitros de uma amostra de membrana solubilizada na coluna à mesma taxa de fluxo e monitore o perfil de eluição utilizando óptica de fluorescência. Por fim, importe os dados de volume de eluição e intensidade de fluorescência para um programa de planilha eletrônica para exibição gráfica e analise o material de membrana solubilizado remanescente por meio de fluorescência em gel.

Como demonstrado anteriormente, a referida família de proteínas é essencial para a divisão celular bacteriana. Nestas imagens, é apresentada uma visualização representativa por fluorescência em gel de 24 DENTRE 47 construtos mencionados. A intensidade das bandas fornece uma indicação do nível de expressão.

Por exemplo, a proteína de fusão na cena quatro da fita é bem expressa em ambas as cepas. No entanto, as faixas adicionais de menor peso molecular sugerem que a proteína está parcialmente degradada em muitas fitas. Há uma faixa que corresponde em tamanho à GFP sozinha.

Por exemplo, G quatro e H quatro são completamente degradados até GFP livre na linhagem C 41 DE três P lies S, enquanto na LEMO 21 DE três, há alguma proteína intacta nestes gráficos. A análise de duas construções que apresentaram bom desempenho na triagem primária por exclusão de tamanho com detecção de fluorescência demonstra como as proteínas se comportam de maneira distinta dependendo de qual dos quatro detergentes foi testado.

Por exemplo, esta proteína apresentou apenas um pico simétrico sem agregação em Dool Multiside, tornando-o o detergente de escolha para a purificação subsequente. Em contraste, a outra proteína de fusão exibiu um perfil semelhante em todos os detergentes testados. Este protocolo pode ser facilmente expandido para incluir, por exemplo, diferentes cepas de *E. coli* cultivadas sob diferentes condições de expressão e detergentes adicionais tanto nas telas primárias quanto nas secundárias.

Em resumo, o principal objetivo deste protocolo é permitir a triagem de um grande número de proteínas de membrana em termos de expressão e solubilização com detergentes, a fim de identificar candidatos para análises posteriores.