Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em Escherichia coli

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas de membrana expressas em SIA coli para análises estruturais e funcionais. Primeiramente, as bactérias são colhidas, deitadas e analisadas pela página SDS para visualização das proteínas GFP corretamente dobradas por fluorescência de Ingel. Na segunda etapa, a produção da e coli determinada para expressar as proteínas de membrana de interesse é aumentada e uma fração total da membrana é preparada a partir das células após a indução da expressão da proteína.

Finalmente, a fração total da membrana é solubilizada em quatro detergentes diferentes e a monodispersidade do detergente. Solubilizado. As proteínas GFP são analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho. Em última análise, as proteínas podem ser monitoradas por fluorescência e os perfis elucianos plotados para avaliar a monodispersidade de agregação e GFP livre nas amostras.

A produção de proteínas de membrana recombinantes para estudos estruturais e funcionais permanece tecnicamente desafiadora devido à sua baixa solubilidade e herda instabilidade uma vez extraídas em detergentes. A experiência mostrou que a triagem de múltiplas variantes de proteínas de membrana, como ortólogos de diferentes espécies, pode melhorar a taxa de sucesso da expressão de proteínas de membrana. Fusão com proteínas fluorescentes verdes usadas para relatar dobras autênticas.

A primeira etapa em nosso protocolo baseado em GFP para a triagem de expressão de proteínas de membrana e E coli usa fluorescência ingel de lisados de detergente de células inteiras para identificar as construções de proteínas de membrana para análise posterior com base no nível de expressão na tela, O comportamento de seleção de proteínas de membrana e detergentes diferentes é então avaliado usando detecção de fluorescência acoplada à cromatografia de exclusão de tamanho. Isso fornece informações sobre a monodispersidade dos complexos de proteínas em detergente. Para analisar a expressão bacteriana induzida por IPTG, comece transferindo um mililitro de IPTG tratado com duplicata de colina e coline de cultura noturna de 24 blocos de poços profundos para 96 blocos de poços profundos, sele os blocos e, em seguida, gire as células por 10 minutos a 6.000 vezes G à temperatura ambiente.

Em seguida, inverta o bloco para decantar a mídia batendo suavemente em uma toalha de papel para drenar o líquido restante. Feche a placa novamente e armazene as células a menos 80 graus Celsius após pelo menos 20 minutos. Descongele os pellets por 20 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, use uma pipeta multicanal para ressuspender completamente as células em 200 microlitros de tampão de lise.

Trate as células com 20 microlitros de solução DLPI estava agitando a 1000 RPM e quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 25 microlitros de 10% doda multiside a cada poço e incube as células por mais 60 minutos com agitação. Após a centrífuga de tratamento DDM, o poço profundo bloqueia e transfere 10 microlitros do lisado limpo para uma placa de microtitulação e adiciona 10 microlitros de tampão de carregamento de gel de página SDS.

Agora carregue o gel com 10 microlitros da solução tampão lisada por poço e execute o gel em tensão constante entre 100 a 120 volts em uma câmara fria por duas a 2,5 horas quando o diafragma atingir o fundo. Coloque o gel em um gerador de imagens com um filtro de luz azul para detectar as proteínas de fusão para aumentar a escala das culturas de células. Depois de transformar um Eloqua de e coli competente, escolha uma colônia em 10 mililitros de caldo poderoso para crescer durante a noite a 37 graus Celsius.

Na manhã seguinte, dilua cinco mililitros da cultura durante a noite em 500 mililitros de caldo e continue a cultivar as culturas com agitação a 250 RPM e 37 graus Celsius. Quando o OD a 595 nanômetros for de aproximadamente 0,5, induza a expressão adicionando IPTG a uma concentração final de um milimolar e, em seguida, coloque a cultura de volta no agitador durante a noite, desta vez a 20 graus Celsius. Na manhã seguinte, colha as células por centrifugação e armazene os pellets a 80 graus Celsius negativos.

Para preparar as membranas celulares. Suspenda novamente os pellets de terceira temperatura ambiente em cinco mililitros de PBS por grama de pellet de célula, aumentando o volume conforme necessário até que a viscosidade se reduza a uma consistência líquida. Em seguida, adicione cloreto de magnésio a uma concentração final de um milimolar DNAs a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e um comprimido inibidor de protease pré-embalado por 20 gramas de pellet celular nas células.

Em seguida, abra as células usando um disruptor de células resfriado a uma pressão de 30 KPSI e, em seguida, jogue as células intactas e detritos por 15 minutos a 30.000 vezes G e quatro graus Celsius. Transferir o supinato para um tubo de ultracentrifugação e recolher a fracção total da membrana centrifugando o supinato durante uma hora a 200 000 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, use o homogeneizador de células para ressuspender o pellet de membrana em 10 mililitros de PBS gelado para solubilizar as membranas para cada detergente a ser usado.

Alíquota de 900 microlitros da suspensão de membrana em tubo policentrifi de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 100 microlitros de cada detergente recém-preparado aos tubos apropriados de 1,5 mililitro e incube as misturas a quatro graus Celsius com vegetação suave. Após uma hora, coloque o detergente e as frações solúveis em pellets com uma ultracentrífuga de bancada, garantindo que os tubos estejam pelo menos meio cheios e retenham o agente supino para cromatografia fluorescente de exclusão de tamanho detectado ou análise FEC.

Em seguida, uma coluna de exclusão de tamanho do equador com uma ampla faixa de fracionamento com buffer de fluxo contínuo a uma taxa de 0,3 mililitros por minuto. Em seguida, injetar 100 microlitros de uma amostra de membrana solubilizada na coluna com a mesma vazão e monitorar o perfil eluciano usando óptica de fluorescência. Finalmente, importe os dados de volume eluciano e intensidade de fluorescência para um programa de planilha para exibição gráfica e analise o material de membrana solubilizado restante por fluorescência ingel.

Como demonstrado anteriormente, a referida família de proteínas é essencial para a divisão celular bacteriana. Nessas imagens, um representante na visualização de fluorescência em gel de 24 OUTTA 47 disse que as construções são mostradas. A intensidade das bandas dá uma indicação do nível de expressão.

Por exemplo, a proteína de fusão na cena quatro da pista é bem expressa em ambas as cepas. No entanto, as bandas adicionais de peso molecular mais baixo sugerem que a proteína está parcialmente degradada em muitas pistas. Existe uma banda que corresponde em tamanho apenas ao GFP.

Por exemplo, G quatro e H quatro são completamente decompostos em GFP livre na cepa C 41 DE três P lies S. Enquanto no LEMO 21 DE três, há alguma proteína intacta nesses gráficos. A análise de duas construções que tiveram bom desempenho na triagem primária por exclusão de tamanho detectada por fluorescência demonstra como as proteínas se comportam de maneira diferente dependendo de qual dos quatro detergentes foi testado.

Por exemplo, essa proteína deu apenas um pico simétrico com agregação de cama em Dool Multiside, tornando-o o detergente de escolha para purificação subsequente. Por outro lado, a outra proteína de fusão exibiu um perfil semelhante em todos os detergentes testados. Este protocolo pode ser prontamente expandido para incluir, por exemplo, diferentes cepas de e coli cultivadas sob diferentes condições de expressão e impedimentos adicionais em telas primárias e secundárias.

Em resumo, o principal objetivo deste protocolo é permitir que um grande número de proteínas de membrana seja rastreado em termos de expressão e detergente, a fim de identificar candidatos para análise posterior.