Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a extensão da arborização dendrítica no hipocampo de um modelo de camundongo. Isso é conseguido por meio de dois métodos diferentes. No primeiro método, os dendritos são traçados manualmente em tempo real em toda a espessura de cada seção.

Após o traçado, toda a árvore dendrítica pode ser reconstruída e analisada. Usando a análise do diagrama de leque de vários diagramas de leque derivados de diferentes mouses pode ser usada como um meio objetivo de comparação. O segundo método é visualizar a arborização dendrítica com imagens de profundidade de campo estendidas.

Finalmente, um método panorâmico é usado para unir várias imagens de alta ampliação para produzir uma imagem composta de alta resolução para avaliação qualitativa e quantitativa de dendritos em toda a região de interesse E demonstrando este procedimento será GI mobi. A pesquisa da AMI flui do meu laboratório. A principal vantagem dessas técnicas sobre os metais existentes é a facilidade de uso e a velocidade de aquisição e coleta de dados.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, como avaliação da dendrização em regiões cerebrais afetadas e avaliação dos efeitos de diferentes terapias nos dendritos. Neste procedimento, um dia após o cérebro do camundongo ter sido fixado em aldeído paraforme a 4%, coloque-o em solução de sacarose para desidratação por 48 horas a quatro graus Celsius. Remova os cérebros da sacarose e coloque-os diretamente em blocos de cobre colocados sobre gelo seco.

Preencha o bloco com OCT e marque a orientação do cérebro usando o bulbo olfatório como ponto de referência. Corte seções de 70 mícrons de espessura a 20 graus Celsius negativos usando um criostato e coloque-as em solução crioprotetora e mantenha a 20 graus Celsius negativos até o uso. Incubar as seções em peróxido de hidrogênio em metanol por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido de aquecê-las a 37 graus Celsius em TBS por meia hora.

Incube as seções com 0,3% de Triton e soro de cavalo normal por 45 minutos em temperatura ambiente antes da coloração com o anticorpo DCX no dia seguinte. Lavar as secções três vezes consecutivas em TBS e incubar as secções com um cavalo antigo biotinilado durante duas horas à temperatura ambiente. Lave as seções três vezes consecutivas em TBS por 10 minutos cada e incube-as com uma luz B, C por 1,5 horas.

À temperatura ambiente, adicione peróxido de hidrogênio à solução DAB e incube as seções imediatamente nesta solução por cinco minutos e termine a reação lavando-as três vezes com TBS gelada seguida de uma. Lave em TT BS à temperatura ambiente. Desidratar as seções usando uma série de soluções de etanol.

Cinco minutos cada, claro e xileno, e depois lama de cobertura usando DPX. Depois que as seções estiverem completamente secas, limpe o excesso de DPX nas superfícies das lâminas com uma lâmina afiada e coloque-as no estágio de varredura do microscópio, uma de cada vez. O sistema de visualização é composto por um microscópio equipado com um joystick de platina de varredura e uma câmera colorida de 12 bits.

Em seguida, inicie o programa neuro lucita e abra um novo arquivo de dados. Coloque um ponto de referência na tela clicando em qualquer lugar com o ponteiro do mouse para ativar todos os ícones do painel de ferramentas da janela do programa. Em seguida, clique no ícone livre do joystick na barra de ferramentas e use o joystick para localizar o giro dentado do hipocampo.

Na primeira seção da guia de ferramentas da janela do programa, selecione gerenciador de seção serial. Clique no ícone da nova seção no canto inferior esquerdo da janela para abrir a janela de configuração da seção serial. Depois, selecione a janela de configuração da seção serial e insira o número total de seções que contêm regiões do hipocampo.

Em seguida, selecione o intervalo de avaliação e insira a espessura da seção. Comece a traçar a região do giro dentado clicando no ícone de desenho de contorno à mão livre na barra de ferramentas. Em seguida, delineie a camada de células granulares dentadas.

Selecione 100 x no menu de ampliação. Em seguida, adicione uma gota de óleo de imersão na seção e mude a objetiva para 100 x. Localize os corpos celulares dos grânulos dentados e dendritos sob este objetivo.

Em seguida, concentre-se em um neurônio selecionado e clique no ícone de rastreamento de neurônios. Na barra de ferramentas, trace a circunferência do corpo da célula granular dentada. Quando terminar de traçar, clique com o botão direito do mouse para selecionar finalizar corpo da célula.

Agora comece a traçar os dendritos manualmente e as direções X, Y e Z, e siga cada ramificação usando o joystick e o botão do motor Z Em um nó de bifurcação ou trifurcação, selecione a respectiva opção. No menu suspenso, rastreie cada uma das ramificações que surgem desses nós no final de cada ramificação. Clique com o botão direito e selecione o final no menu suspenso.

Usando os ícones das teclas de seta na janela do software. Selecione aleatoriamente outra célula granular dentada e repita o procedimento de rastreamento conforme demonstrado. Salve todo o traçado.

Agora inicie o neuro lucita explorer para análise de neurônios. Abra o primeiro arquivo de dados NRX do primeiro mouse do grupo experimental. Anexe o arquivo NRX do segundo mouse do grupo experimental e continue até que todos os arquivos NRX desse grupo sejam anexados.

Na guia de análise, selecione leque no diagrama para abrir o leque na janela de análise, marque os dendritos e clique em exibir os links e padrões de ramificação dos dendritos para este grupo de camundongos. Neste procedimento, conecte o microscópio a uma câmera digital. Coloque uma seção no estágio de varredura conectado ao microscópio e mude para uma objetiva de 10 x.

Em seguida, mova o palco para a área de interesse. Inicie um programa de captura de vídeo e pressione o botão de gravação. Assim que o botão de gravação for pressionado, use o botão de foco macro para mover da parte superior para a inferior da seção por um total de quatro segundos Antes de salvar o arquivo de vídeo resultante, agora use o freeware Image J para converter os arquivos de vídeo a VI em um formato não compactado.

Inicie um programa de análise de imagem e abra um arquivo VI. Vá para o menu do processo e clique em profundidade de campo estendida. Selecione o arquivo de vídeo correspondente nas opções de saída.

Selecione gerar imagem composta de melhor foco nas opções de análise de foco. Selecione as opções de iluminação normalizada e contraste local máximo. Em seguida, clique em criar para gerar uma imagem resultante, que representa todos os pixels focados em todo o eixo Z.

Depois, salve a imagem resultante. Nesta etapa, coloque uma seção no estágio de varredura conectado ao microscópio. Mova o palco para a área de interesse.

Em seguida, inicie o programa de aquisição de imagens usando uma objetiva de 10x, adquira e salve imagens de alta resolução da região de interesse, certificando-se de ter pelo menos 10% de sobreposição entre as imagens. Em seguida, execute o editor de composição de imagens para costurar as imagens posteriormente. Vá para o menu de arquivos e clique em novo panorama.

Selecione a pasta na qual as imagens estão armazenadas. Em seguida, selecione as imagens que pertencem à mesma região e pressione OK. Pressione o botão exportar para disco e salve a imagem.

Esta imagem representa uma imagem de resolução extremamente alta da área de interesse que poderia ser usada para análise. Esta figura mostra a visualização da arborização dendrítica com e sem métodos EDFI. O método tradicional de encontrar o melhor plano de foco foi comparado com EDFI e valores significativamente mais altos de área dendrítica.

Utilizando o método EDFI foram encontrados. A quantificação do comprimento e volume ocupados pelos dendritos em diferentes ordens de ramificação é mostrada aqui. O comprimento e o volume máximos foram alcançados na ordem um.

Aqui está um histograma do comprimento dendrítico das células granulares dentadas. A maioria dos segmentos dendríticos de DCX coram DDRs tinha 13 a 26 de comprimento. Esta linha pontilhada vermelha representa a distribuição normal dos dados apresentados Seguindo este procedimento.

Outros métodos clássicos como o neuro Lucid podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre o volume e a área ocupada pelos dendritos. Esta técnica que mostramos aqui ajudará tremendamente os pesquisadores no campo da neurobiologia não apenas a avaliar a ação de estruturas neuronais, mas também a avaliar pequenas estruturas não neuronais, como a microglia, em seções cerebrais espessas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a extensão das projeções neuronais em um período de tempo relativamente curto.