Um procedimento cirúrgico para ressecção do mouse Rib: Um Modelo de Grande Escala Repair longo osso
21 de janeiro de 2015
O objetivo geral deste procedimento é ressecar com sucesso uma porção de osso da costela de um camundongo. O procedimento foi desenvolvido como um modelo para estudar o reparo de ossos longos em larga escala.
O objetivo deste procedimento é criar uma ressecção em larga escala na porção óssea de uma costela como modelo para reparo esquelético. Isso é realizado primeiramente criando e abrindo uma incisão através da pele no lado lateral do animal. O segundo passo é expor o osso da costela que será removido.
Em seguida, uma porção do osso do arco costal é removida, seja junto com o invólucro de tecido conjuntivo circundante ou com o periósteo, seja deixando o periósteo para trás. O passo final é fechar as incisões e permitir que o animal se recupere. Em última análise, este modelo de reparação óssea pode ser utilizado para demonstrar os eventos celulares e moleculares que ocorrem durante a reparação esquelética em larga escala.
Em um mamífero, a demonstração visual deste método é fundamental, pois manipular os instrumentos cirúrgicos exige precisão e uma cirurgia bem-sucedida depende do conhecimento sobre a localização dos diferentes tecidos. A demonstração do procedimento será realizada por Marissa Roar e Nikita Tripper, ambos estudantes de pós-graduação no meu laboratório. Após preparar a área cirúrgica e os instrumentos e suprimentos estéreis necessários, induza anestesia colocando um camundongo adulto em uma câmara de indução com 4% de isoflurano.
Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, aplique pomada nos olhos do animal e confirme a profundidade da anestesia. Ao realizar um aperto no dedo do pé, não deve haver nenhuma reação ao estímulo. Posicione o camundongo sobre ou próximo a uma almofada aquecida no suporte de um microscópio estereoscópico, com o cone nasal da mangueira de manutenção da anestesia posicionado sobre o nariz do camundongo.
Certifique-se de que o camundongo está em posição lateral. Ajuste o isoflurano para dois a 3% para manutenção e observe a frequência respiratória. Em seguida, injete buprenorfina por via subcutânea usando uma agulha de 25 graus.
Para a dor pós-cirúrgica preventiva, a perna pode apresentar espasmos, o que é uma resposta normal. Primeiro, selecione a costela desejada palpando a partir da costela mais rostral, que é contada como número um. Neste vídeo, uma porção da décima costela será removida.
Raspe a área sobre a costela e, em seguida, limpe com iodopovidina, seguido de isopropanol três vezes. Após fazer uma incisão de dois centímetros através das camadas de pele, músculo e gordura acima da costela a ser ressecada, posicione as três camadas em um afastador para expor a área cirúrgica, minimizando ao mesmo tempo o tamanho da incisão. Em seguida, use um bisturi de cinco milímetros para cortar os músculos intercostais acima da costela em um local cinco milímetros proximal à articulação chocos, onde a costela não é tão fortemente curvada. Depois, separe cuidadosamente o músculo do osso com pinça de ponta fina.
A seguir, para criar uma ressecção mantendo o periósteo no animal, corte o periósteo ao longo do comprimento da costela. Em seguida, use pinças de ponta fina para separar cuidadosamente o periósteo delicado lateralmente do osso subjacente. Se necessário, meça a ressecção com um micrômetro no microscópio ou com um paquímetro tipo régua.
Em seguida, utilize uma tesoura microfina para fazer uma seção transversal através do osso. Em uma das extremidades, levante cuidadosamente o osso do periósteo e corte a outra extremidade imediatamente. Coloque a costela removida em paraformaldeído 4% para análise futura.
Se ocorrer sangramento em decorrência do corte do osso, aplique pressão na extremidade cortada com um cotonete durante quatro a cinco segundos para interromper o sangramento. Para fechar a incisão, suturar os músculos intercostais sobre a parte superior da bainha periostal remanescente com três ou quatro suturas contínuas 9-0. Posicione as suturas diretamente acima das extremidades cortadas da costela para servirem como indicadores do local da cirurgia.
Remova o afastador e, em seguida, feche com pontos contínuos de náilon 9-0 o músculo e a gordura sobrejacentes. Suture cada camada separadamente em camundongos com camadas particularmente espessas de músculo ou gordura. Feche a pele com quatro a cinco pontos 7-0 e, em seguida, fixe a incisão com adesivo tecidual.
Pinçando as bordas juntas com pinças grandes. Reduza lentamente a concentração de isoflurano para 1% por alguns minutos e, em seguida, desligue o isoflurano. Coloque o camundongo sob uma lâmpada de aquecimento e mantenha-o até que a consciência seja recuperada.
Após a recuperação da consciência e durante todo o período de cicatrização, o camundongo deve se movimentar e ambular normalmente, não apresentando sinais de desconforto. Assim que a incisão estiver seca, acomode o camundongo em uma gaiola limpa com livre acesso a alimento e água. Fêmeas podem ser mantidas em grupo, mas machos devem ser acomodados separadamente para evitar brigas, e deve-se fornecer manejo da dor pós-operatória, incluindo a administração de buprenorfina na forma oral de genina a 0,5 miligramas por quilograma a cada 12 horas durante 48 horas.
A administração oral não exige a contenção do animal, o que poderia causar dor na região torácica. Esta imagem mostra uma ressecção de 4,5 milímetros de uma costela coletada imediatamente após a cirurgia. Nenhum fragmento ósseo é deixado para trás.
A amostra foi corada com vermelho de zarin e clareada em glicerol 80%. A seta indica a localização das extremidades cortadas. Esta é a porção da costela removida da caixa torácica na imagem anterior, sem o periósteo aderido.
A seção histológica corada com hematina e eosina mostrada aqui ilustra que há um mínimo de periósteo aderido ao osso, conforme indicado pela seta amarela à esquerda, e nenhum periósteo à direita. O asterisco amarelo indica a cavidade da medula óssea. Esta imagem mostra um fragmento de costela removido com o periósteo ainda aderido, e esta seção histológica mostra o periósteo intacto sobrepondo o osso, conforme indicado pelo colchete amarelo.
O asterisco amarelo indica novamente a cavidade da medula óssea. Esta imagem mostra uma preparação esquelética após dois meses de cicatrização seguinte à ressecção com o periósteo intacto dentro do camundongo, podendo-se observar a reparação completa da região. Esta seção histológica da preparação esquelética recém-mostrada demonstra a restauração das paredes do osso lamelar e da cavidade da medula óssea.
Esta imagem mostra uma preparação esquelética após três meses de cicatrização. Após a remoção de uma porção da costela e do periósteo circundante, houve apenas uma reparação mínima na extremidade cortada, mostrada à esquerda do painel. A seta amarela aponta para a articulação chocos.
Esta seção histológica do preparado esquelético previamente mostrado revela tecido de granulação, células adiposas e musculares preenchendo o local da ressecção. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de uma hora, caso seja executada corretamente seguindo este procedimento. Outros métodos, como criar uma ressecção na porção cartilaginosa da costela, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como, por exemplo, como ocorre a reparação em larga escala do tecido cartilaginoso?
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar uma ressecção na porção óssea da costela para estudar a reparação esquelética.I.
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Visão Geral
Este procedimento tem como objetivo criar uma ressecção em larga escala na costela de um camundongo, servindo como modelo para o estudo da reparação esquelética. O método envolve incisão, exposição da costela e remoção do osso, seguidos pelo fechamento da incisão.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Reparação óssea
- Modelagem esquelética
- Cirurgia em animais
Contexto
- Compreender os mecanismos de reparação esquelética é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos.
- Este modelo permite aos pesquisadores observar eventos celulares e moleculares durante a cicatrização óssea.
- A ressecção de costela fornece insights sobre processos de reparação óssea em larga escala.
- Modelos animais são essenciais para estudos in vivo da regeneração óssea.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo para estudar a reparação de ossos longos em larga escala.
- Investigar os processos biológicos envolvidos na reparação esquelética.
- Fornecer uma estrutura para pesquisas futuras sobre cicatrização óssea.
Métodos Utilizados
- Incisão feita na face lateral do camundongo.
- Exposição do osso da costela destinado à remoção.
- Ressecção da costela junto com o periósteo ou sem ele.
- Fechamento das incisões para permitir a recuperação.
Principais Resultados
- O procedimento demonstra com sucesso a ressecção de costela.
- Fornece um modelo confiável para o estudo da reparação esquelética.
- Facilita a observação dos processos de cicatrização in vivo.
- Contribui para a compreensão dos mecanismos de regeneração óssea.
Conclusões
- Este modelo é eficaz para o estudo da reparação óssea em larga escala.
- Permite a análise de eventos celulares e moleculares durante a cicatrização.
- Estudos futuros podem se basear nesta metodologia para obter maiores insights.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A reparação em larga escala de ossos permanece um desafio crítico na pesquisa translacional do sistema músculo-esquelético, com modelos pré-clínicos limitados que recapitulam dinâmicas robustas de cicatrização. O modelo de ressecção de costela em camundongo oferece um sistema reprodutível e acessível para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à regeneração de ossos longos. Este modelo permite que equipes de biofármacos avaliem processos de reparo e contribuições do periósteo, auxiliando na validação de alvos e na redução de riscos em programas iniciais de reparação óssea.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação mecanicista de vias de reparação óssea dependentes e independentes do periósteo.
- Apóia a validação funcional de alvos candidatos envolvidos na regeneração esquelética.
- Facilita a desmistificação biológica ao distinguir os contribuintes celulares para a cicatrização óssea.
- Oferece uma plataforma para estudos comparativos da eficácia de reparação em diferentes intervenções genéticas ou farmacológicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um sistema padronizado e reproduzível in vivo para avaliação dos resultados da reparação óssea.
- Permite a avaliação quantitativa da reparação por meio de pontos finais histológicos e de imagem.
- Apóia o desenvolvimento de ensaios para medir as contribuições do periósteo e da medula à regeneração.
- Permite a triagem de compostos ou biológicos quanto à atividade pró-regenerativa em um ambiente controlado.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças de lesão e reparo esquelético em larga escala.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de estratégias de cicatrização óssea.
- Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos com eficácia demonstrada in vivo.
- Apoia a identificação de biomarcadores para estudos translacionais em regeneração óssea.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico para a reparação musculoesquelética, conectando estudos mecanicistas iniciais e a avaliação de candidatos translacionais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre os papéis do periósteo e da medula na regeneração óssea.
- Triagem: Fornece pontos finais reprodutíveis e quantitativos para avaliação da reparação.
- Análises: Permite a medição baseada em histologia e em imagens da cicatrização óssea e da composição tecidual.
- Pesquisa Translacional: Oferece um sistema relevante para doenças, útil para a validação pré-clínica de estratégias regenerativas.
- Reutilização Empresarial: Atua como uma plataforma reutilizável para diversas investigações sobre reparo ósseo em diferentes programas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos mecanismos de reparação óssea e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação da reparação óssea in vivo com uma metodologia escalável e acessível.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção de ativos para regeneração óssea ao fornecer dados pré-clínicos robustos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com eficácia comprovada de reparação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência cirúrgica em modelos de animais pequenos e manipulação precisa de tecidos.
- Necessita acesso a infraestrutura de análise histológica, de imagem e quantitativa.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos cirúrgicos e analíticos para reprodutibilidade.
- Adaptável a estudos de mecanismos de reparo dependentes e independentes do periósteo.
- Limitado à pesquisa pré-clínica; a extrapolação translacional requer validação adicional.
