Name: Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia de novos tratamentos para patologias intestinais usando endoscopia em camundongos vivos. Este método permite monitoramento longitudinal individual da resposta terapêutica.

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Gostaríamos de agradecer à CSL Ltd. por apoiar a compra do equipamento de endoscopia. A pesquisa no laboratório de ME é apoiada pelo Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer, e os laboratórios de TP e ME são apoiados pelo Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado de Victoria e pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália. ME é um pesquisador sênior do NHMRC.

O Institute of Medical Research comissão ética animal Walter e Eliza Salão aprovado cada um dos procedimentos descritos nestes protocolos. 1. Preparação de Experimental Ratos <ol><li> Componha coortes experimentais de pelo menos 4 sexo do 6-8 semanas de idade camundongos C57BL / 6 (M. musculus) que são criados e mantidos no mesmo patógeno específico livre (SPF) facilidade animal / quarto e fornecidos com alimentos e água autoclavada. A utilização de ratinhos fêmea irá permitir a co-habitação de ratos a partir de diferentes linhas, número de caixa de limite, e reduzir a variação gaiola para gaiola. </li><li> Certifique-se de que os ratos são pelo menos 6 semanas da idade para permitir procedimentos de endoscopia usando a 3,0 milímetros de diâmetro endoscopia bainha. </li><li> Use ratinhos do mesmo fundo genético, e sempre que possível, a partir de gaiolas armazenados na mesma prateleira para reduzir as variações associadas com a microflora intestinal. Variações na microflora entre instalações para animais deve ser tomado em consideração when determinar os ratos e genótipos de controlo adequadas para cada experimento 22. </li><li> Mark camundongos por recortes de ouvido / dedo do pé, tatuagens, ou similares para permitir a fácil identificação. </li><li> Pese ratinhos no dia 0, para determinar pesos de base experimental. </li><li> Realizar endoscopia (ver Seção 5) de ratos no dia 0 para gravar fenótipos colônicas basais. </li></ol> 2. Julgamento pré-clínicos em um dano epitelial e aguda Colite Modelo <ol><li> Prepara-se uma solução do agente terapêutico a ser testado. Para terapêutica entregues por sonda oral (po), preparar soluções para um volume máximo de 100 mL. Para terapêutica entregues por (ip) injecção intraperitoneal, preparar soluções para um volume máximo de 200 mL. NOTA: repetida ip ou po administração da droga por períodos prolongados de tempo pode resultar em alteração de comportamento mouse. Alternar o local da injecção ip para evitar desconforto prolongado. Para a administração po, fornecer os camundongos com autocsementes de girassol laved como um &#39;mimo&#39; para minimizar a associação negativa com o procedimento gavage. </li><li> No Dia 1, administrar o agente terapêutico de interesse (preparado no passo 2.1) e veículos de controlo apropriados. No exemplo fornecido (Figura 6A), 5 ug de humano recombinante (rh) iInterleukin (IL) -11 proteína foi dissolvido em 200 ul de tampão fosfato salino (PBS) e administrado ip </li><li> Determine o tempo e frequência das administrações, que será dependente da perfil farmacocinético estabelecido para o reagente terapêutico que está sendo testado. A Figura 1 delineia o tratamento profilático com injecções ip duas vezes ao dia ao longo do curso do experimento. </li><li> Monitorar, incluindo a consistência das fezes e da presença de sangue, e pesar cada rato diariamente. Nos dias de tratamento, a pesagem deve coincidir com a administração do fármaco terapêutico para minimizar o stress aos ratinhos por manuseamento repetido. </li&gt; <li> No Dia 3, preparar 2,5% (2,5 g / 100 ml) solução de DSS na água potável rotineiramente fornecida aos ratinhos pela instalação para animais. Cerca de 5 ml / rato / dia de solução DSS é necessário para o experimento. O consumo da água DSS podem alterar-se a temperatura ambiente da instalação para animais flutua. NOTA: DSS é um agente irritante e devem ser tratados de acordo com as instruções FDSM. </li><li> Fornecer DSS fresco para o ad libitum camundongos em garrafas de água potável para 5 dias contínuos. Na noite do dia 5, fornecer água potável normal, além de pelotas de alimentos purê e um suplemento de proteína fornecida em pequenas placas de Petri (100 g pelotas de alimentos / 10 g shake de proteína / 10 ml de água). Isso evita a desidratação e ajuda com a minimização de perda de peso grave. </li><li> Eutanásia camundongos por CO 2 intoxicação e coletar tecidos para posterior análise histológica, na manhã do dia 8, ou quando os ratos experimentar a perda de peso ≥15% por mais de três consecutive dias, o que ocorrer primeiro. NOTA: Ajustar a dose DSS entre 1-4% (w / v) dependendo da microflora da instalação para animais e o lote de DSS. Realizar, testes em lotes de rotina para determinar a dosagem apropriada DSS e contornar variação de lote para lote. A dosagem apropriada deve ser baseada na perda de peso (não superior a 15% do peso original) e histopatologia confirmou colite. </li></ol> 3. Teste pré-clínica numa colite crónica ou cancro do Modelo-colite associada <ol><li> Para o modelo de colite crônica começam a partir do passo 3.7. </li><li> Para o modelo de cancro associado a colite (CAC), no dia 1, cada rato com injectar 10 mg / kg (w / w) Azoximetano (AOM, 250 ul, ip). NOTA: OMA é uma substância cancerígena e devem ser tratados de acordo com as instruções FDSM. </li><li> As soluções de reserva são preparadas como AOM a 10 mg / ml e alíquotas armazenadas a -20 ° C. No dia da injecção, a solução estoque AOM é descongelado e diluído para 1 mg / ml em PBS. Congelamento e descongelamento da solução estoque OMA repetida deve ser evitada. </li><li> A dose AOM pode ser ajustado entre 8-12 mg / kg. São necessários ensaios lote de rotina para estabelecer a dosagem AOM apropriado a fim de contornar a toxicidade para camundongos, devido a variação de lote para lote. </li><li> Durante os dias 07/01 seguinte pesos administração AOM será estável e por esta razão a monitorização do peso pode ser omitido durante Dias 1-7 para evitar manipulação de animais que excretam metabólitos citotóxicos em suas fezes. </li><li> No dia 7 de roupa de cama precisa ser mudado de acordo com procedimentos citotóxicos. Uma vez que a mudança de roupa de cama é completa, os animais já não necessitam de procedimentos de manuseio citotóxicos, como eles não serão mais excretando metabolitos citotóxicos. </li><li> No Dia 8, preparar 2,5% (2,5 g / 100 ml) solução de DSS (tal como descrito no passo 2.5) e fornecer para o ad libitum ratinhos. </li><li> Pesar ratos diariamente durante todo o experimento e monitorar os sinais de doença, incluindo fu babadosr, curvando, fezes com sangue e movimento reduzido. </li><li> No dia 13, remover a solução DSS e fornecer os ratos com água potável normal até o dia 28. Dias 28/08 constituem um &quot;ciclo&quot; do protocolo colite / CAC crônica. </li><li> Nos dias 13-28, quando os ratos recebem água potável normal, fornecer os ratos com pelotas de alimentos purê e um suplemento de proteína fornecida em pequenas placas de Petri (100 g grãos de ração / 10 g de proteína de agitação / 10 ml de água). Isso evita a desidratação e ajuda com a minimização de perda de peso grave. NOTA: Os suplementos de proteína em puré não deve ser fornecida quando os ratos estão recebendo DSS contendo água potável, a fim de garantir a consistência no consumo DSS. </li><li> No dia 20 a realização do segundo exame endoscópico para monitorar a saúde individual do rato (ver item 5). </li><li> No dia 29 de repetir o ciclo DSS (Ciclo 2: 2,5% (w / v) DSS oferecido durante Dias 29-33 e água potável normal durante 34-50 dias). </li><li> No dia 40 realizar o thiEterno endoscopia para monitorar de saúde individual do mouse e determinar carga tumoral (veja seção 5). </li><li> Se não há tumores são visíveis por endoscopia no dia 40, começa um terceiro ciclo DSS nos dias 50-72 (Ciclo 3: 2,5% (w / v) DSS oferecido durante Dias 50-55 e água potável normal durante 56-72 dias). Em geral, os tumores são visíveis por Dia 40 e, por conseguinte, o terceiro ciclo de DSS podem ser omitidos. </li><li> Uma vez que os tumores se tornam visíveis por exame endoscópico, atribua a cada rato um score tumor endoscópica (ver item 5) e atribuir camundongos individuais para coortes com encargos semelhantes tumores basais. </li><li> No dia 42 (ou quando os tumores são visíveis), administrar o composto terapêutico ou o controle do veículo relevante (ver secção 2.2). A calendarização das doses será dependente do perfil farmacocinético da terapêutica. Um exemplo de um tratamento de intervenção injectados ip três vezes por semana em ratinhos com tumores estabelecidos é fornecida (Figura 2). </li><li> Execute eexames ndoscopic uma vez por semana durante a duração do tratamento terapêutico para monitorar a carga tumoral. Geralmente, 4 semanas de um tratamento terapêutico é suficiente para observar uma resposta objetiva tratamento. Após a cessação do tratamento, um grupo de ratinhos pode também ser monitorizada por endoscopia de recidiva tumoral. </li><li> Eutanásia camundongos por CO 2 intoxicação e coletar tecidos para análise bioquímica e / ou histológica na manhã do dia 72 ou quando os ratos experimentar a perda de peso ≥15% por mais de três dias consecutivos, o que ocorrer primeiro. </li></ol> 4. Julgamento pré-clínica em uma Cancro colorretal esporádico <ol><li> No dia 1, injetar cada ip rato com 10 mg / kg AOM (veja o passo 3.2). A dose AOM pode ser ajustado entre 8-12 mg / kg. São necessários ensaios lote de rotina para estabelecer a dosagem AOM apropriado a fim de contornar a toxicidade para camundongos, devido a variação de lote para lote. </li><li> Repetir a injecção no primeiro dia de cada semanapara as cinco semanas seguintes (Figura 3). Os ratinhos devem ser tratados de acordo com os procedimentos de segurança citotóxicos para toda a 6 semanas. </li><li> Pesar cada rato no dia da injeção AOM para minimizar o sofrimento para os ratos causados ​​pelo manuseio repetido. NOTA: OMA é uma substância cancerígena e devem ser tratados de acordo com as instruções FDSM. </li><li> Todos os animais devem ser tratados de acordo com os procedimentos de segurança citotóxicos para as 6 semanas de injeções ip OMA necessários para este protocolo. </li><li> Durante a semana 8 realizar exame endoscópico para monitorizar tumores emergentes (ver seção 5). O exame endoscópico deve ser realizada a cada duas semanas até que os tumores se tornam visíveis. De um modo geral, de tipo selvagem C57BL / 6 animais começam a desenvolver tumores de cerca de 40 semanas após a administração inicial de AOM. </li><li> Uma vez que os tumores se tornam visíveis por exame endoscópico, atribuir a cada rato uma pontuação tumor endoscópica (ver item 5) e atribuir camundongos indivíduo a uma coorte com semelhante<html> cargas de tumor antes do início do tratamento terapêutico. </li><li> Durante a semana de 40 (ou quando os tumores são de primeira visível), administrar o composto terapêutico ou o controle do veículo em questão. </li><li> A calendarização das doses será dependente do perfil farmacocinético da terapêutica (ver passo 2.1). Um exemplo de um tratamento de intervenção injectado ip 3 vezes por semana em ratinhos com tumores estabelecidos é fornecida (Figura 3). </li><li> Realizar semanal para o exame endoscópico duração dos períodos de tratamento terapêutico para monitorar a carga tumoral. Geralmente, um de 4 semanas de tratamento terapêutico são suficientes para uma resposta objectiva tratamento. Após a interrupção do tratamento, um grupo de ratos também podem ser monitorados por endoscopia para recidiva tumoral. </li><li> Eutanásia ratinhos por CO 2 intoxicação e colher tecidos para análise bioquímica e / ou histológico do cólon e tumores durante 45 semanas, ou após 4 semanas de terapia. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 5. exames endoscópicos <ol><li> O equipamento de endoscopia deve ser montada de acordo com os procedimentos padrão 16. </li><li> Esterilizar e endoscópio limpar a sonda com etanol a 70% ou um lubrificante anti-bacteriana. </li><li> Os vídeos podem ser gravados utilizando um computador laptop ou desktop e software de mídia padrão, como o iMovie. Um monitor de computador padrão, em vez de um monitor de grau médico, é suficiente para a visualização do cólon durante o procedimento endoscópico (Figura 4). </li><li> Anestesiar grupos de 5-6 ratos em simultâneo numa câmara com 3% de isoflurano em 100% de O 2 a uma taxa de 0,2-0,4 l / min. Uma vez que os ratos são anestesiados, o que é confirmado por aperto do dedo do pé; os níveis de anestésico deve ser alterada para 0,5-2% para manutenção. </li><li> Remover um ratinho individual da câmara, e colocá-lo lado ventral com a cabeça presa em um nariz de cone. Anestesia cheios devem ser monitorizadas e as patas traseiras deve ser ajustada de modo que eles são stretched atrás do mouse. </li><li> Coloque uma pomada veterinário sobre os olhos dos ratos para prevenir o ressecamento. </li><li> Segure a cauda do rato, onde se encontra com a parte inferior da coluna para revelar claramente o ânus. Introduza a bainha endoscópio rígido para uma proveta de água e ajustar o fluxo de ar para permitir a libertação de uma pequena bolha de cada vez. </li><li> O fluxo de ar vai permitir que o cólon para inflar. Se o fluxo de ar é muito forte, o ar será bombeado para dentro do estômago do rato. Nenhuma lubrificação adicional é necessária. </li><li> Insira cuidadosamente a bainha endoscópio rígido no recto. Geralmente, o endoscópio pode ser inserido até 3 cm, altura em que os dois pontos em curvas de ratos e não é acessível ao endoscópio rígido. </li><li> Uma dificuldade comum durante procedimentos endoscópicos é o bloqueio do acesso ao lúmen do cólon devido à matéria fecal. Evite isso, massageando suavemente da barriga de ratos antes do procedimento para incentivar a defecação, ou cuidadosamente manobrar o endoscópio em torno do Fecal assunto durante o procedimento. Peristaltismo também pode ocorrer, durante o qual o endoscópio deve ser mantido em posição até que a musculatura do cólon relaxa. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo em qualquer fase do procedimento de endoscopia. Scoring doença pode ser gravado por um assistente experiente durante o procedimento, ou em um ponto de tempo mais tarde a partir dos arquivos de vídeo. </li><li> Após o exame endoscópico, retornar os ratos para sua gaiola e monitorá-los durante a recuperação da anestesia. Os animais são geralmente acordado e móvel em até 2 minutos após a remoção do isoflurano administrar nariz cone. </li><li> Certifique-se de que esses procedimentos são realizados por um cientista experiente. Cada procedimento de endoscopia levará aproximadamente 2 min por mouse. </li></ol> 6. Doença Scoring <ol><li> Para monitorar colite, marcar vídeos para o Índice de murino endoscópica de Colite Gravidade (MEICS) 16, que documenta mudanças em (i) a espessura da parede do cólon indicado pela transparência, (Ii) a consistência das fezes, (iii) a integridade dos vasos sanguíneos e na presença, (iv) as úlceras e as zonas de regeneração que se apresentam numa forma granular, (v) o sangramento indicado por depósitos de fibrina (Figura 5a). </li><li> Para monitorar a carga tumoral, marcar vídeos para incidência e tamanho do tumor. A dimensão do tumor é determinada pelo diâmetro do lúmen do cólon ocupados pelo tumor 16 (Figura 5b). É comum a utilização de ambos os parâmetros de pontuação e colite tumor para um único rato. Usando endoscopia, tumores individuais e a saúde da mucosa do cólon pode ser monitorizado ao longo do tempo, fornecendo uma li-a para o sucesso de novas terapêuticas num único animal. </li><li> (Opcional) As imagens fixas podem ser extraídos dos vídeos para a geração de números representativos (Figura 6). </li></ol>

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<li>Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+inhibits+the+activities+of+both+polymerase+and+reverse+transcriptase%3A+lithium+chloride+purification%2C+a+rapid+and+efficient+technique+to+purify+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA.</a> BMC Res Notes. 6, 350(2013).</li>
<li>Kerr, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification%3A+a+poly-A+purification+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution.</a> Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os três protocolos que são descritos os métodos de contorno de indução confiável e reprodutível da patologia da doença do cólon em camundongos. Quando combinado com as estratégias de intervenção descritas aqui acompanhamento endoscópico de rotina e, estes protocolos irá fornecer poderosa visão pré-clínicos sobre a eficácia da terapêutica. Nossos laboratórios rotineiramente usar todos esses protocolos para monitorar o sucesso de novas terapias 10,23,24. Há um número de considerações ao escolher um modelo animal pré-clínica para testar novas terapêuticas. Estes incluem a relevância do modelo para a doença humana, e a contribuição do microambiente do tumor para a acção proposta do alvo terapêutico. Aqui nós fornecemos três protocolos de intervenção terapêutica em modelos de doenças intestinais estabelecidos. Estes modelos são reprodutíveis e a entrega de reagentes para induzir a doença é fácil de gerir. É importante ressaltar que os modelos são altamente relevantesde múltiplas facetas e fases de início colite, e de iniciação e progressão tumoral. Os investigadores devem levar em consideração o fundo genético das linhagens de camundongos utilizados na concepção experiências, como a susceptibilidade à doença induzida por DSS e / ou AOM podem variar consideravelmente 25. Além disso, diferentes comunidades microbianas podem ter diferentes capacidades metabólicas no contexto de AOM, a qual é metabolizada pelas bactérias. Advertimos contra o uso de diferentes grupos de ratos que nasceram em diferentes instalações para animais (incluindo fornecedores comerciais) em um único experimento. Da mesma forma, o diferente microflora em camundongos usados ​​de diferentes instalações podem provocar diferentes respostas do hospedeiro para DSS-induzida danos barreira epitelial 11. Além disso, a análise de tecido apropriado (por exemplo, a purificação de ARN) também deve ser considerado, uma vez que a capacidade de DSS a inibir a transcriptase reversa terá um impacto sobre a análise molecular subsequente 26,27. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mouse endoscopia é uma técnica de ponta para monitorar constantemente o início da doença e progressão em um mouse individual. A capacidade de gravar vídeos e extrair imagens ainda permite fácil monitoramento de vários parâmetros de doenças e tumores. Além de melhorar o bem-estar animal, a monitorização endoscópica também reduz a necessidade de vários grupos de camundongos experimentais, que tradicionalmente foram abatidos em diferentes pontos de tempo para acompanhar a evolução da doença. O sistema de pontuação MEICS não é um substituto para a análise histopatológica, mas fornece um meio alternativo para monitorar danos a saúde animal e da mucosa em camundongos vivos. Rato endoscopia é uma técnica de laboratório especializado, e todos os procedimentos devem ser realizados por pessoal treinado para garantir a manipulação e manejo adequado dos camundongos, bem como para proporcionar qualidade consistente nas imagens usadas para marcar doença. Nas mãos de pessoal qualificado, descobrimos que a endoscopia induz pouco ou nenhum dano para o tumors que poderiam causar hemorragia intra-tumoral. Para os protocolos terapêuticos esboçados, consideramos endoscopia altamente vantajoso, uma vez que fornece uma maneira de determinar a carga do tumor inicial, e nos permite coortes grupo de animais com tumor encargos semelhantes antes da administração de uma droga terapêutica. Monitoramento seqüencial da camundongos permite aos pesquisadores determinar a eficácia de novas terapias no início, com a opção de terminar de experiências sem sucesso em tempo hábil. Como nossa compreensão da doença inflamatória intestinal e colorectal cânceres antecedência, novos alvos para a terapia será identificado. Modelos animais apropriados fará parte integrante de garantir que as novas terapias mais promissoras são movidos em direção ensaios clínicos.

O câncer colorretal (CCR) é a 4ª causa mais comum de tumor maligno em todo o mundo 1. Apesar dos progressos significativos em nossa compreensão da base familiar desta doença, a predisposição genética contribui apenas para ~ 20% dos casos 2 CRC. O restante é atribuído a vários fatores extrínsecos e ambientais, incluindo a inflamação crônica. Nos seres humanos, a ligação entre a inflamação crónica e o cancro do cólon é evidente em colite ulcerosa (UC) pacientes, que têm um maior risco de desenvolvimento de cancro do cólon associada à colite (CAC), dependendo da duração, amplitude e da gravidade da doença inflamatória 3 -5. Consequentemente, novas terapias estão em desenvolvimento para controlar a resposta imunitária e a produção de factores de crescimento associados factores pelo microambiente tumoral inflamatório 6-8. Existe uma exigência crescente de modelos animais pré-clínicos apropriados para caracterizar a eficácia terapêutica deestas drogas contra o desenvolvimento e progressão da doença. Modelos de ratos têm inequivocamente demonstrado que o microambiente inflamatório contribui para a progressão da CRC, mesmo na ausência de inflamação evidente 9,10. Estes modelos incluem a utilização do sulfato de sódio polissacárido dextrano (DSS), fornecido na água de beber dos ratos, para modelar lesão epitelial e doença intestinal inflamatória aguda e crónica (IBD) 11,12. Embora o mecanismo pelo qual DSS induz lesão da mucosa e colite não é completamente compreendido, alguns estudos sugerem que o DSS inibe as actividades de transcriptase reversa e de ribonuclease celulares no interior das células, ou promove a formação de complexos de nano-lipídico que se fundem com a membrana epitelial do cólon levando a danos 13,14. Modificações ao modelo DSS padrão também forneceram uma visão significativa sobre os mecanismos pelos quais as células epiteliais do cólon manter a homeostase do tecido e regularidadetarde respostas imunes nas mucosas 15. A administração intraperitoneal de Azoximetano (OMA) sozinho, ou em combinação com DSS, fornece um modelo para a análise da interacção entre as mutações somáticas na mucosa epitelial e estromal no microambiente inflamatório e 16,17. OMA é um metabólito da substância cancerígena 1,2-dimetil-hidrazina (DMH), que não resultam diretamente em mutações no DNA. Em vez disso, a AOM é hidrolisado para methylazoxymethanol (MAM) pela isoforma do citocromo CYP2E1 no fígado, onde MAM é conjugado com o ácido glucorónico e, em seguida, transportados para o intestino através de secreções biliares 18. Pensa-se que o β-glucuronidase bacteriana contribui para a degradação do MAM resultando na alquilação de DNA e a acumulação de mutações em células epiteliais 19. A maioria dos tumores do cólon induzida por AOM abrigar mutações missense no gene que codifica a β-catenina, tornando a proteína resistente a degradação de proteossomono, o que resulta na activação aberrante da canónica via de sinalização Wnt-20. Quando a atividade da OMA é combinada com a lesão da mucosa provocada por DSS, a ferida que se seguiu a resposta de cura cria um microambiente que é propício para o crescimento e expansão do epitélio mutado. Numa variação deste modelo, a administração repetitiva de OMA sozinho ao longo de um período de várias semanas pode ser usado para modelar o cancro colorectal esporádica, na ausência de colite induzida por DSS 10,17. Estes dois modelos de cortesia fornecer configurações experimentais para estudar as CAC e esporádica CRC, respectivamente, ambas as quais estão associadas com um microambiente tumoral pró-inflamatória 10. O uso de endoscopia de série em camundongos foi iniciada por Becker e seus colegas 21, e permite o monitoramento longitudinal da colite e progressão tumoral. Aqui nós fornecemos três protocolos pré-clínicos com base em danos na mucosa induzida por DSS e / ou mediada por AOM tumor indução para induzir reproducibly patologias do cólon específicos. O primeiro protocolo descreve induzir danos na mucosa aguda em resposta à administração de DSS para induzir muitas das características histológicas associadas com IBD. O segundo protocolo baseia-se em três ciclos consecutivos de administração DSS para simular as chamas de inflamação normalmente observadas em doentes de IBD, e pode ser levada a cabo em conjunção com mutações induzidas por AOM. O protocolo final é baseado em mutações esporádicas epiteliais induzida pela OMA. Para cada um destes protocolos, vamos expandir sobre os procedimentos padrões relevantes a incluir métodos de intervenção profiláticas e terapêuticas que temos desenvolvido para monitorar a eficácia de novos medicamentos.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de dextrano sódico (MW 36.000-50.000)</td><td>MP Bioquímicos</td><td>160110</td><td>Requer testes em lote.</td></tr><tr><td>Azoximetano</td><td>Sigma</td><td>A5486-100MG</td><td>Requer testes em lote.</td></tr><tr><td>Batido de proteína de baunilha</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Disponível em farmácias hospitalares.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>PPC</td><td>M60303</td><td>Este é um reagente restrito, que deve ser armazenado a sete chaves.</td></tr><tr><td>70% de etanol</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Reagente de laboratório padrão.</td></tr><tr><td>Sistema miniendoscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coloview Endovision Tricam</td><td>Karl Storz</td><td>20212001-020</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz Xenon 175 com bomba antiembaçante</td><td>Karl Storz</td><td>20134001</td><td></td></tr><tr><td>Telescópio direto HOPKINS</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Bainha endoscópica (diâmetro total 3 mm)</td><td>Kalr Stroz</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de fibra óptica</td><td>Kalr Stroz</td><td>69495ND</td><td></td></tr><tr><td>Software para computador e media player</td><td>Apple</td><td></td><td>iMovie</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any</td><td></td><td>Qualquer balança adequada para pesagem de mouses.</td></tr></tbody></table>

avaliação não invasiva da eficácia de novos therapeutics para intestinal patologias usando imagem endoscópica série da vivo ratos

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Modelos animais de doença inflamatória intestinal (DII) e câncer colorretal (CCR) forneceram informações significativas sobre os mecanismos intrínsecos e extrínsecos celulares que contribuem para o aparecimento e progressão de doenças intestinais. A identificação de novas moléculas que promovem essas patologias levou a uma enxurrada de atividades focadas no desenvolvimento de novas terapias potenciais para inibir sua função. Como resultado, vários modelos de camundongos pré-clínicos com sistema imunológico intacto e microambiente estromal são agora muito usados. Aqui descrevemos três protocolos experimentais para testar a eficácia de novas terapêuticas em modelos pré-clínicos de (1) dano agudo da mucosa, (2) colite crônica e/ou câncer de cólon associado à colite e (3) câncer colorretal esporádico. Também descrevemos procedimentos para exame endoscópico seriado que podem ser usados para documentar a resposta terapêutica de um tumor individual e monitorar a saúde de camundongos individuais. Esses protocolos fornecem plataformas experimentais complementares para testar a eficácia de compostos terapêuticos que se mostraram bem tolerados por camundongos.

Perda de peso é utilizada como um parâmetro padrão para monitorizar a doença associada com colite, que é utilizada rotineiramente para monitorizar a saúde geral dos ratos. Animais em geral, manter o seu peso enquanto DSS contendo água é administrado, e só começar a perder peso quando eles são devolvidos à água potável normal. Parâmetros de perda de peso aceitável deve ser estabelecida de acordo com o comitê de ética animal da instituição. A fim de evitar a desidratação associada à diarreia prolongada, utilizar o fornecimento de mosto de rotina (peletes alimentares amassada e misturada com água de beber), suplementado com uma agitação da proteína em adição à água de beber normal. Como uma alternativa a anestesia, a cetamina / xilazina ou agentes similares pode ser usado, se o equipamento isoflurano não está disponível. Devido à natureza rígida do endoscópio, estes processos permitem apenas a visualização das mais 3 centímetros distais do cólon do rato. Endoscópios mais novos, com<html> recursos adicionais (incluindo flexibilidade e fluorescência) estão disponíveis, dependendo das necessidades do experimento. No entanto, uma vez que os efeitos deletérios da SCD é limitada principalmente no cólon distai de ratinhos, com a patologia mais suave observada no cólon médio, o endoscópio rígido não prejudicar o acompanhamento da saúde das mucosas de ratinhos individuais. Embora os autores descrevem um protocolo para o tratamento profilático de colite induzida por DSS aguda, este protocolo pode facilmente ser modificado para testar estratégias de tratamento de intervenção. A eficácia de um fármaco de modo a aliviar danos epiteliais e colite pode ser monitorizada longitudinalmente em ratinhos individuais e quantificada com base nos parâmetros de pontuação descritas (Figura 5). Isto é vantajoso em relação a modelos experimentais tradicionais, as quais requerem o abate de ratinhos, em pontos de tempo específicos durante o protocolo experimental, e não permite a caracterização da resposta a um tratamento da doença ao longo do tempo. <html> t &quot;&gt; estudos clínicos em seres humanos revelaram uma considerável variabilidade em como diferentes tumores num paciente individual responder aos tratamentos. Os procedimentos que são descritos aqui proporcionam um meio para monitorar a carga tumoral total, bem como a resposta ao tratamento de tumores individuais ao longo de um experimento. É importante considerar que as protocolos de intervenção que são descritas para os modelos de câncer não levam em conta os efeitos de uma terapia em iniciação tumor. protocolos de profilaxia, com o tratamento prestado antes quando os tumores se tornam visíveis por endoscopia, são necessários para obter essa informação. Os protocolos descritos aqui fornecem informações sobre os efeitos terapêuticos sobre o sobre a progressão (medida pelo tamanho do tumor) de tumores individuais. regressão do tumor pode também ser indicada por uma redução no número de tumores visíveis. g &quot;/&gt; Figura 1:. A monitorização da eficácia de uma terapia de tratamento profilático num modelo de dano agudo do cólon O protocolo experimental (um) requer oito dias do início ao fim. Therapeutics são administrados (b) a partir do dia 1 para tratamentos profiláticos. DSS é fornecido na água de beber (c) a partir do dia 3 do protocolo experimental. A endoscopia é realizada (d) acompanhar a progressão da doença nos animais. Timepoints sugeridas incluem Dia 0 (sem tratamento) e Dia 2 (vigilância da saúde), Dia 5 e 8 (para determinar a carga de doença). A experiência é terminada (e) na manhã do Dia 8. Em um ratinho de tipo selvagem (f) a progressão da doença aumenta com o tempo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig2highres.jpg" /> Figura 2: Monitorando a eficácia da terapia de intervenção em um modelo of colite associada ao cancro. O protocolo experimental (um) requer 72 dias do início ao fim. Therapeutics (b) são administrados a ratinhos com tumores estabelecidos a partir do dia 46 para os tratamentos de intervenção. AOM (c) é injectado no Dia 1, e DSS é fornecido na água de beber durante o decurso de três ciclos do protocolo experimental, começando no Dia 8. A endoscopia (d) é realizado para monitorar a progressão da doença nos animais. Timepoints sugeridas incluem Dia 0 (não tratada), Dia 20 (vigilância da saúde), e dia 40 (para os animais do grupo de acordo com a carga tumoral). A endoscopia é realizada semanalmente durante o curso do tratamento terapêutico para monitorizar os efeitos da doença. O experimento (e) é encerrado na manhã do dia 72. Em um fardo tumor do tipo selvagem do mouse (f) aumenta de dia 40 em diante. <img alt="Figura 3"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52383 / 52383fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Acompanhamento da eficácia da terapia de intervenção em um modelo de câncer colorretal espontânea O protocolo experimental (a) requer&gt; 50 semanas do início ao fim. Therapeutics (b) são administrados a ratinhos com tumores estabelecidos para tratamentos de intervenção. AOM (c) é injectado no dia 1, e em seguida semanalmente durante 6 injecções consecutivas ao longo do curso do protocolo experimental. A endoscopia (d) é realizado para monitorar a progressão da doença nos animais. Timepoints sugeridas incluem Dia 0 (sem tratamento) e Semana 8 (monitoramento de tumor) e quinzenal lá depois (para estabelecer a carga tumoral). A endoscopia é realizada semanalmente durante o curso de tratamento para monitorizar os resultados terapêuticos. O experimento (e) é encerrado na Semana 50. Em uma carga tumoral de tipo selvagem do rato (f) aumenta desde a Semana 40 em diante. </<html> p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" width="650" /> Figura 4:. Equipamento set-up O experimental set-up (a) para a unidade endoscópica, com peças individuais de equipamento indicado. O endoscópio rígido (b), com os componentes individuais indicados. Barra de escala = 2,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig5highres.jpg" width="650" /> Figura 5:. Scoring parâmetros de doença por endoscopia Um esboço (a) do Índice Endoscopic Murino de Colite Gravidade (MEICS). Um esboço (b) dos parâmetros de pontuação tumor individuais.es / ftp_upload / 52383 / &quot;target =&quot; _ 52383fig5highres.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" width="650" /> Figura 6: tratamentos terapêuticos representativos perda de peso-Representante, imagens endoscópicas e partituras para:. (A) Aguda DSS-induzida lesão da mucosa (b) tumores que se desenvolveram seguindo o protocolo / DSS AOM (c) Os tumores que se desenvolveram após o seqüencial.. protocolo OMA. N = 3 ratos por grupo. * P &lt;0,05, *** P &lt;0,001 (T-Student). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Descrevemos métodos para monitoramento longitudinal da eficácia da terapêutica para o tratamento de patologias colônicas em camundongos usando um endoscópio rígido. Este protocolo pode ser prontamente utilizado para a caracterização da resposta terapêutica de um tumor individual em camundongos vivos e também para monitorar a potencial recidiva da doença.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

O objetivo geral do experimento a seguir é testar a eficácia de novos terapêuticos em modelos de colite e câncer mediante a indução de doença em camundongos, a fim de investigar terapias que inibam a patologia induzida. O tratamento é administrado de forma profilática. Neste vídeo, utiliza-se a proteína recombinante de interleucina 11 humana; em seguida, o sulfato de dextrana sódico ou DSS é administrado na água de beber para provocar dano mucoso agudo e muitas das características histopatológicas associadas à doença inflamatória intestinal.Em seguida, as alterações na doença são monitoradas por endoscopia para determinar a eficácia terapêutica. Em última análise, os resultados mostram uma redução na carga da doença com base no monitoramento endoscópico e na pontuação após o tratamento terapêutico de camundongos com patologia da doença induzida. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de monitorar um único camundongo ao longo do experimento, em comparação com as técnicas padrão de análise histológica.É necessário examinar múltiplas coortes de animais. Esta metodologia pode nos ajudar a formular e responder perguntas fundamentais sobre inflamação e câncer de cólon, e em particular a tentar estabelecer se uma manipulação mais eficaz da sinalização de citocinas pode influenciar a progressão da doença. É importante utilizar esses modelos pré-clínicos para avaliar a eficácia de fármacos e compostos, o que nos permite realmente testar o mesmo camundongo em diversos momentos e verificar se esses compostos apresentam alguma atividade.Realizarei a demonstração deste procedimento com Giovanni CI Ciano, um técnico em animais do nosso instituto. No primeiro dia, administre o agente terapêutico de interesse e os controles apropriados com veículo. Nesta demonstração, cinco microgramas de proteína recombinante de interleucina 11 humana foram dissolvidos em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato e administrados por via intraperitoneal. Determine o momento e a frequência das administrações, o que dependerá do perfil farmacocinético estabelecido para o agente terapêutico que está sendo testado. Abaixo é apresentado um esquema de tratamento profilático utilizando injeções intraperitoneais duas vezes ao dia ao longo do experimento.Monitore a consistência das fezes e a presença de sangue, e pese cada camundongo diariamente. Nos dias de tratamento, a pesagem deve coincidir com a administração do fármaco terapêutico para minimizar o estresse nos camundongos causado pelo manuseio repetido. No terceiro dia, prepare uma solução de sulfato de dextrana 2,5% ou solução de DSS na água de bebida normalmente fornecida aos camundongos pela instalação animal.São necessários aproximadamente cinco mililitros por camundongo por dia da solução de DSS para o experimento. O consumo da água com DSS pode alterar-se se a temperatura ambiente do biotério variar. Forneça DSS fresco aos camundongos.Adicione Liam em garrafas limpas de água por cinco dias consecutivos, na noite do quinto dia. Forneça água potável normal, além de pellets de alimento triturados e um suplemento proteico fornecido em pequenas placas de Petri. Na manhã do oitavo dia.Prossiga com a eutanásia de camundongos conforme descrito no protocolo textual para coletar tecidos para análise histológica subsequente. Realize testes de rotina em lotes para estabelecer a dosagem apropriada de DSS e evitar variações entre lotes. A dosagem apropriada deve ser baseada na perda de peso e confirmada pela histopatologia da colite.Ajuste a dose de DSS entre 1 e 4% peso por volume, dependendo da microflora da instalação animal e do lote de DSS. O equipamento de endoscopia deve ser montado de acordo com os procedimentos padrão.Esterilize e limpe a sonda do endoscópio com etanol 70% ou um lubrificante antibacteriano. Os vídeos podem ser gravados usando um laptop ou computador desktop e softwares de mídia padrão, como o iMovie. Um monitor de computador comum, em vez de um monitor de grau médico, é suficiente para visualizar o cólon durante o procedimento de endoscopia.Animar grupos de cinco a seis camundongos simultaneamente em uma câmara com 3% de isofluorano em 100% de oxigênio a uma taxa de 0,2 a 0,4 litros por minuto. Uma vez que os camundongos estejam anestesiados, o que é confirmado pelo aperto dos dedos dos pés, os níveis de isofluorano devem ser ajustados para entre 0,5 e 2%. Para manutenção, retire um camundongo individual da câmara e coloque-o em posição ventral com a cabeça fixada em um cone nasal; a anestesia completa deve ser monitorada e as patas traseiras devem ser ajustadas de modo que fiquem esticadas para trás do animal. Aplique pomada oftálmica nos olhos dos camundongos para prevenir ressecamento.Segure a cauda do camundongo no ponto em que ela se encontra com a coluna vertebral inferior para expor claramente o ânus. O fluxo de ar permitirá que o cólon se infle se a intensidade do ar for muito forte. O ar será bombeado para o estômago do camundongo.Insira cuidadosamente a bainha do endoscópio rígido no reto. Geralmente, o endoscópio pode ser inserido até três centímetros, ponto em que o cólon em camundongos faz uma curva e deixa de ser acessível ao endoscópio rígido. Uma dificuldade comum durante os procedimentos de endoscopia é o bloqueio do acesso à luz do cólon devido à matéria fecal.Evite isso massageando suavemente o abdome dos camundongos antes do procedimento para estimular a defecação. Inicie a gravação em vídeo em qualquer fase do procedimento de endoscopia. A pontuação da doença pode ser registrada por um assistente experiente durante o procedimento ou em um momento posterior a partir dos arquivos de vídeo; certifique-se de que esses procedimentos sejam realizados por um cientista experiente.Cada procedimento de endoscopia levará aproximadamente dois minutos por camundongo após o exame endoscópico. Retorne os camundongos para suas gaiolas e monitore-os durante a recuperação da anestesia. Os animais geralmente despertam e ficam móveis dentro de dois minutos após a remoção do cone nasal que administra isoflurano. Os resultados apresentados aqui são representativos de camundongos expostos ao DSS para modelar a doença inflamatória intestinal aguda.No oitavo dia do protocolo sem tratamento. Camundongos selvagens apresentam colite, conforme esperado, com perda de peso, imagens de endoscopia e escores de colite na endoscopia de camundongos controle e daqueles submetidos ao tratamento com proteína recombinante humana de interleucina 11 são mostrados. A perda de peso é utilizada como um parâmetro padrão para monitorar doenças associadas à colite, sendo rotineiramente empregada para acompanhar a saúde geral dos camundongos, conforme visualizado pela redução do escore de colite na endoscopia.A doença reduzida é evidente após o tratamento terapêutico de camundongos com patologia de doença induzida. Assim, uma vez que você domine esta técnica, deverá ser capaz de avaliar o camundongo em aproximadamente dois minutos. E, em geral, o que ela realmente permite é testar de forma muito eficaz se esses tratamentos têm ou não um efeito sobre a inflamação e o câncer em um modelo pré-clínico relevante.

non-invasive-assessment-efficacy-new-therapeutics-for-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Ao longo dos últimos anos, novas endoscópios geração surgiram como importantes auxiliares de pesquisa de diagnóstico para a avaliação de colite murina e tumores colorectais. Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a avaliação endoscópica de inflamação e tumores colo-rectal em ratos, bem como um novo sistema de pontuação que utiliza identificadores decimais para documentar a gravidade endoscópico de colite e tumores colorectais.

A colonoscopia flexível em camundongos para avaliar a gravidade da colite e colorretal Tumores Usando um sistema validado endoscópica Scoring

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Este artigo descreve uma técnica de imagem de vídeo e mapeamento espaço-temporal de alta resolução para identificar mudanças na regulação neural da motilidade colônica em camundongos adultos. Efeitos sutis na função gastrointestinal (GI) podem ser detectados usando essa abordagem em preparações de tecidos isolados para avançar nossa compreensão da doença gastrointestinal.

Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para estabelecer pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha e usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite.

Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.

Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Aprenda a avaliar a eficácia de novos tratamentos para patologias intestinais usando endoscopia em camundongos vivos. Este método permite monitoramento longitudinal individual da resposta terapêutica.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

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