Name: Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a gerar células T CAR específicas para EGFRvIII e avaliar sua eficácia em glioblastoma combinadas com radioterapia craniana e temozolomida em camundongos. Este método demonstra como a imunoterapia pode ser potencializada pelo tratamento padrão.

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Os autores gostariam de agradecer à Dra. Laura Johnson e ao Dr. Richard Morgan por fornecerem a construção retroviral do CAR. Os autores também agradecem a Giao Ngyuen por sua assistência com dosimetria para irradiação de todo o cérebro. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH NCI 1R01CA177476-01.

Este protocolo é baseado em um projeto experimental, onde 10 ratos são tratados com 10 células 7 carro T cada. Isto significa que serão necessários 10 8 células CAR T; o rendimento deve ser superestimada por 5 x 10 7 -1 x 10 8 a conta para a perda da viabilidade. O protocolo seguinte é dimensionado para gerar cerca de 200 x 10 6 células. As células são então administrada intravenosamente a fêmea C57BL / 6 com 9 dias estabelecidos os tumores intracranianos EGFRvIII-positivo singeneicos, desenvolvidos a partir das linhas celulares de melanoma B16 ou de astrocitoma KR158B existentes. Concomitante com a geração de células T CAR, os ratinhos portadores de tumor são administradas doses clinicamente relevantes de lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) e WBI (16,5 Gy). Os ratos foram mantidos e criados em condições livres de patógenos na Duke University Medical Center (DUMC). Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Duke University Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC). 1. A administração de temozolomida para portadores de tumor Ratos Dias de 0 a 4: <ol><li> Calcula-se o número total de ratinhos para serem injectados e multiplicar este por 0,5 para determinar o volume de solução necessário TMZ (por exemplo, 30 ratos x 0,5 ml = 15 ml TMZ) e adicionar 1,5 ml para este volume para contabilizar transbordamento (16,5 ml TMZ ). </li><li> Multiplicar este volume total de 3 mg / ml para determinar o peso do liofilizado TMZ necessário (por exemplo, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Pese isso em um cônico de 50 ml. CUIDADO: TMZ é tóxico por inalação, ingestão e contato com os olhos, pele e membranas mucosas. Consulte com a segurança da instituição ocupacional e / ou de saúde ambiental e do departamento de bem-estar para recomendações sobre como reduzir o risco de exposição. </li><li> Multiplicar o volume total de 0,15 para determinar o volume de dimetil sulfóxido (DMSO) necessário (por exemplo, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtrar esterilizar este volume de DMSO (mais um adicional de 2 ml para explicar transbordamento) através de um filtro de 0,2 um para um tubo estéril. Adicionar 2,475 mL de DMSO estéril para o pó TMZ. </li><li> Coloque a solução TMZ / DMSO num copo de água sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10-15 min. Uma vez TMZ estiver completamente dissolvido, a solução deve ficar de cor amarelo pálido; se a solução torna-se cor de rosa, em seguida, a TMZ é degradada, e uma nova solução deve ser preparada com um lote fresco de TMZ. </li><li> Calcula-se o volume apropriado de solução salina estéril através da multiplicação necessária 0,85 pelo volume total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solução salina). Adicionar 15 ml de solução salina estéril para uma cónico de 50 ml. Enquanto TMZ é dissolução em DMSO, a solução salina de calor a 65 ° C. </li><li> Vortex a solução / DMSO TMZ para garantir que o pó TMZ é totalmente dissolvido e adiciona-se lentamente solução salina aquecida até a solução / DMSO TMZ. </li><li> Imediatamente após a preparação, carregue totalmente 15 x 1 ml syring tuberculinaes com solução TMZ para administração a quatro dias camundongos com tumores estabelecidos. </li><li> Repetir este procedimento nos dias 1 a 4 para um total de cinco administrações TMZ. </li></ol> 2. cérebro inteiro de Irradiação de portadores de tumor Ratos Dias 2 a 4: <ol><li> Ligue o irradiador de raios-X e deixe-o aquecer-up de tensão total. Certifique-se de que o filtro apropriado está no lugar e entrada a tensão adequada e as configurações atuais (Figura 2A). NOTA: A dosimetria da irradiador deve ser estabelecido de antemão para determinar as configurações de tensão e layout de grade (Figura 2A, B) apropriado. </li><li> Calcula-se a duração do tempo que é necessário para resultar em 5,5 Gy de irradiação de raios-X. Por exemplo, se os raios X são entregues a uma taxa de 2 Gy / min, em seguida, 2,75 min é necessário para fornecer um total de 5,5 Gy. Introduza o tempo de duração apropriada. NOTA: A Tabela 2 apresenta rato WBI doses and seus equivalentes clínicos em seres humanos. No contexto de gliomas de alto grau, de 60 Gy WBI fraccionado (fracções de 2 Gy, 5 dias / semana, durante 6 semanas) é o padrão de cuidado clínico, e o equivalente murino aqui utilizado é de 16,5 Gy (5,5 Gy x 3). </li><li> Prepara-se uma solução fresca de cetamina / xilazina na anestesia sistémica, através da adição de 2 ml de cetamina e xilazina 1 ml a 17 ml de solução salina de modo a que a solução final é de 10 mg / ml de cetamina e 1 mg / ml de xilazina. </li><li> Pesar ratinhos e administrar 10 uL de cetamina / xilazina intraperitonealmente por grama de peso corporal de modo a que os animais recebem uma dose de cetamina a 100 mg / kg e 10 mg / kg de xilazina. Ratos deve ser totalmente sedado e respirando visivelmente dentro de 2 min de cetamina administração / xilazina. </li><li> Para manter a umidade oftálmica em animais sedados, esfregue suavemente uma pequena quantidade de pomada lágrimas artificiais em cada olho. </li><li> Coloque ratos sedados na grelha de tal modo que as cabeças estão posicionadas na área que recebe o raio-X em maiorintensidade (Figura 2B, C). Corpos Protetor de pescoço para baixo com tamanho adequado tubo de chumbo para bloquear a entrega de raios-X sistêmica (Figura 2D). </li><li> Coloque ratinhos posicionado sob o feixe de raios-X de tal forma que o laser denotando o ponto focal do feixe de raios-X está na coordenada (0,0) sobre a disposição da grade. Comece a entrega de raios-X. </li><li> Quando a entrega de raios-X é completo, remover animais do irradiador e coloque sobre uma almofada de aquecimento quente. Não abrigar animais sedados com animais conscientes até animais recuperou a consciência suficiente para manter decúbito externo. Uma vez que os animais podem manter decúbito externo, coloque animais conscientes de volta em suas gaiolas apropriadas. </li><li> Repita este procedimento nos dias 3 e 4 de um total de três doses fracionadas de radiação. </li></ol> 3. Transfection Dia -1: <ol><li> Prepare meios D10 pela adição de 50 ml de soro fetal bovino (FBS) a 500 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM). </li><li> Prepare meios de células T (MTC) por adição de 5,5 ml de L-glutamina, 5,5 ml de piruvato de sódio, 5,5 ml de aminoácidos não essenciais, e 5,5 ml de penicilina / estreptomicina (pen / strep) em 500 ml de meio RPMI-1640. Em seguida, adicione 550 mL de 2-mercaptoetanol e gentamicina 550 mL. Finalmente, adicione 50 ml FBS. </li><li> Colheita in vitro de células em cultura e HEK293T levar a uma concentração de 7,5 x 10 6 células / ml em meio D10. </li><li> Placa 10 ml de meio de D10 e adicionar 1 ml de suspensão de células HEK293T em cada um de 16 x 10 cm poli-D-lisina (PDL) placas revestidas. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> Dia 0: <ol start="6"><li> Substituir meios com 10 ml D10 fresco, pelo menos, 30 min antes da transfecção de células. </li><li> Determinar a quantidade de vector de plasmídeo, pCL-Eco vector, e o reagente de transfecção lipossómica necessária para transfecção através da multiplicação do número total de placas + 1 (16 + 1 = 17) de 14,1 ugvector plasmídico (14,1 x 17 = 239,7 g), 9,9 ug pCL-Eco vector (9,9 x 17 = 168,3 g), e 60 ul de reagente de transfecção lipossómica (60 x 17 = 1020 mL). Todos os reagentes devem estar à temperatura ambiente antes de preparar soluções. </li><li> Rotular dois tubos A e B. No tubo A, adicionar 239,7 g vector plasmídeo e 168,3 mg PCL-Eco vector de (1,5 x 17) ml de soro reduzida meio de Eagle modificado (RS-MEM). No tubo B, adicionar 1,020 mL de reagente de transfecção lipossómica de (1,5 x 17) ml de RS-MEM. </li><li> Incubar A e B separadamente, durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Misturar A e B, em conjunto com cuidado (vortex durante 1-2 segundos ou gire várias vezes) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente para formar complexos lípido / ADN. </li><li> Adicionar lípido / DNA do complexo gota a gota às células HEK293T em placa de 10 cm. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 6-8 horas ou durante a noite (não exceder 24 h). </li><li> Depois de 6-8 horas de incubação, substitua médio, com 12 ml de TCM fresco para a produção viral. Este chapeados mediaserão utilizados no Dia 2 como sobrenadante viral para a transdução de células T. </li></ol> 4. A esplenectomia e Preparação de Células T Dia 0: <ol><li> Despeje 10 ml de TCM em um cônico de 50 ml e colocar no gelo para a coleta de baço. </li><li> Sacrificar o número adequado de animais por asfixia com CO2 e decapitação secundário: Colocar os animais em uma gaiola de recepção de CO 2 a um caudal de 10-30% do volume da gaiola / minuto, por orientações American Veterinary Medical Association (não mais do que 5 animais podem ser sacrificado simultaneamente) até termina respiração e durante dois minutos depois. Remover animais da câmara de CO 2 e decapitar. NOTA: Um baço de um 6-12 semanas de idade do sexo feminino C57BL / 6 do mouse irá produzir cerca de 4,5-5 x 10 7 esplenócitos. Aqui, 4 baços serão colhidas para aproximadamente 200 x 10 6 células. </li><li> Coloque o rato de tal forma que seu lado direito está virado para cima, epulverizar com etanol a 70%. Com a pinça, pegue uma dobra fina de pele abaixo da caixa torácica esquerda e cortou uma pequena incisão com a tesoura. Retire a pele, pegue cuidadosamente uma dobra fina do peritônio com uma pinça, e cortou uma pequena cavidade. </li><li> O baço é um órgão alongado pequeno, escuro vermelho que se assemelha a um bean achatada; delicadamente agarrar o baço com a pinça e impostos especiais de consumo por cortar o tecido conjuntivo circundante. Colocar os baços extirpados em cónico contendo 10 ml de TCM em gelo. </li><li> Pour baços mais de um 70 um filtro de células de malha e desagregar por trituração com a extremidade romba do interior de uma seringa de 5 ml para gerar uma suspensão de célula única. Devem ser desagregados Um máximo de dois baços per mesh peneira. </li><li> Use um pequeno volume de TCM para lavar cuidadosamente o filtro seguinte desagregação de recolher quaisquer esplenocitos restantes. Associação Todos os baços desagregados em uma suspensão de uma única célula. Levar o volume final para 50 mL com uma lavagem de TCM para umad girar a 300 xg durante 10 min. </li><li> Prepara-se uma solução de tampão de lise 1x por adição de 5 ml de 10x tampão de lise a 45 ml de água estéril. Para eliminar as células vermelhas do sangue, ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de lise 1x por baço em uma cónico de 50 ml, misturando bem cuidado pipetando para cima e para baixo. Se não superior a 5 baços, utilizar um tubo de centrífuga de 250 ml. Colocar o tubo de centrifugação cónico ou em um banho de água a 37 C ° durante 5 min. </li><li> Remover a reacção de lise a partir do banho de água e adicionar TCM na proporção de 1: 1 com tampão de lise para neutralizar a reacção. Lavar por centrifugação a 300 xg durante 10 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e pellet totalmente ressuspender em TCM (2 ml / baço, 8 ml total para 4 baços) por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Contar as células por adição de 10 ul de suspensão de células a 190 ul azul de tripano (diluição de 1:20). Multiplicar o número obtido em um dos quatro quadrados em grade por 20 x 10 4 x volume total (8 mL) para se obter o número total de células (por exemplo, células 125 x 20 x 10 4 </saté&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 esplenócitos). </li><li> Dilui-se as células a uma concentração de 2 x 10 6 células / ml em TCM, suplementado com 2 ug / ml de concanavalina A (ConA) e 50 UI / ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2). Assim, para 200 x 10 6 esplenócitos, adicionar 92 ml de meio de células de 8 ml, 200 ug de Con A, e 5000 UI de rhIL-2. </li><li> Adicionar 2 mL de células para cada poço de placas tratadas de cultura de tecidos de 24 poços, de tal modo que 4 x 10 6 células em cada poço são (por exemplo, 100 ml de células vai demorar aproximadamente 4 placas). </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> 5. Transdução Dia 1: <ol><li> Calcular o número de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços necessários para a transdução através da multiplicação do número de baços colhidos por 2 (8 placas são necessários para baços 4). </li><li> Em seguida, calcular o volume requerido de solução fragmento de fibronectina humana recombinante (RHFF)necessária para placas de revestimento através da multiplicação (número total de poços + 3) x 0,5 ml (8 x 24 placas = 192 poços + 3 = 195) x 0,5 mL = 97,5 mL. </li><li> Prepare a 97,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo RHFF a uma concentração de 25 ug / ml, multiplicando o volume total de 25? G (97,5 x 25 = 2437,5 ug). Adicionar esta quantidade de RHFF a 97,5 ml PBS. </li><li> Bata de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços por adição de 0,5 ml de solução PBS / RHFF por poço. </li><li> Incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> Dia 2: <ol start="6"><li> Despejar solução de PBS / RHFF de cultura não-tecido tratado placas de 24 poços. </li><li> Adicionar 1 ml / poço de albumina de soro bovino a 2% (BSA) em PBS e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Remover BSA por firmemente upending placa. Lavar por adição de 2 ml de PBS. </li><li> Recolher o sobrenadante virai por transferência de meios de comunicação a partir de cada placa HEK293T PDL para um tubo de centrífuga de 250 ml e girar 10 min a 500 x g. </li><li> Transferir cuidadosamente su viralpernatant em um 250 ml fresco tubo de centrifugação, tendo a certeza de não perturbar o sedimento de células que podem ter se formado. </li><li> Adicionar TCM fresco ao sobrenadante virai, tal que o volume final de 3 ml é mais do que a quantidade necessária para poços RHFF-revestidos. Por exemplo, para 192 poços RHFF-revestidos, trazer ao volume de sobrenadante virai a 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Remover esplenócitos cultivadas na incubadora e ressuspender por suavemente pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes em cada poço. Transfira para uma cónico de 250 ml. Se utilizando uma pipeta multicanal, utilizando um reservatório estéril antes de serem transferidos vai ajudar a acelerar esta etapa. Contagem como anteriormente descrito e centrifugação a 300 xg durante 10 min. </li><li> Adicionar rhIL-2 a sobrenadante viral a uma concentração de 50 Ul / ml. Por exemplo, adicionar 50 x 195 = 9.750 UI a 195 ml de sobrenadante viral-2 rhIL. </li><li> Ressuspender esplenócitos em sobrenadante virai a 1 x 10 6 células / ml </li><li> Adicionar 1 ml / poço de uma suspensão de esplenócitos em placas de 24 poços revestidas com RHFF. </li><li>Rotação por 90 min de acordo com as seguintes configurações: 770 xg, aceleração = 4, freio / desaceleração = 0, 32 ° C. </li><li> Prepara-se uma solução de TCM com 50 UI / ml de rhIL-2. Por exemplo, preparar uma solução de 200 TCM por adição de 10.000 UI de rhIL-2. Adicionar 1 ml de rhIL-2 / TCM a cada poço, após a centrifugação. </li><li> Cultura durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2. </li></ol> 6. CAR célula T Cultura e colheita Dias 3 e 4: <ol><li> Se as células T obter&gt; 80% de confluência, as células podem ser divididas (isto normalmente ocorre no dia 3 ou dia 4). Para dividir as células, pipetar suavemente para cima e para baixo em cada poço de 2-3 vezes, e mover-se 1 ml de cada poço em novos poços de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos tratados fresco. Em seguida, adicionar 1 ml de TCM fresco com 50 UI / ml de IL-2 a cada cavidade de tal modo que o volume final é de 2 ml em todos os poços. </li><li> Se as células não atingem&gt; 80% de confluência, realizar uma mudança de metade meios por pipetagem fora lentamente 1 ml de meios de comunicação a partir do topo de cada cavidade. Evite disturbing células se instalaram no fundo durante a remoção da mídia. Adicionar 1 ml de TCM fresco contendo 50 UI / ml de rhIL-2. </li></ol> Dia 5: <ol start="3"><li> Suspenda as células T CAR cuidado pipetando para cima e para baixo 3 vezes em cada poço e transferir para um tubo de centrífuga de 250 ml. Girar células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Sobrenadante completamente aspirado sem perturbar pellet. Lavar uma vez com PBS, a contagem de células como descrito anteriormente, e lavar com PBS uma segunda vez. Um rendimento típico de células T CAR é de aproximadamente 1 x 10 6 células por poço (8 placas de células x 24 poços = 192 x 10 6 CAR T). </li><li> Ressuspender as células em PBS a uma concentração de 5 x 10 7 / ml para uma injecção de 1 x 10 7 num volume de 200? G (por exemplo, para 192 x 10 6 células T CAR, ressuspender o sedimento lavado em 3,84 ml de PBS). </li></ol> 7. CAR T Administration celular para portadores de tumor Ratos Dia 5: <ol><li> Transport células sobre gelo para instalações de animais por injecção intravenosa. Carga 500-1.000 ul em seringa de insulina com 27-31 G agulha, assegurando que todas as bolhas são expulsos. </li><li> Pegue um rato na base da cauda e colocar em restrainer tubo. </li><li> Puxar a cauda esticada com a veia virada para cima, e deslizar a agulha aproximadamente 1-2 mm sob a pele para dentro da veia, inserindo-o paralelo na veia da cauda. Lentamente expelir 200 ul na veia. Se a agulha estiver correctamente introduzida na veia, o volume vai fluir facilmente in; caso contrário, haverá resistência e da agulha terá que ser removido a partir da cauda e re-inserido correctamente. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesses a declarar.

A linha do tempo de tratamento descrito aqui foi projetado para modelar padrão clínico de cuidado e alavancar os seus efeitos para a terapia adotiva CAR. T doses carro de célula, regimes TMZ, administrativos e radioterapia podem ser modificados para aumentar a actividade in vivo de células T, lymphodepletion e assassinato tumor. Os regimes de TMZ pode ser aumentada para se obter mieloablação hospedeiro e aumentar a expansão das células adoptivamente transferidos 30. Além disso, os efeitos lymphodeple...

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno primário mais comum e é invariavelmente fatal. A ressecção cirúrgica associada com o padrão não específico de quimioterapia e radioterapia cuidado para não eliminar completamente as células malignas, resultando em um mau prognóstico de menos de 15 meses, em pacientes com esta doença 1. Em contraste, a imunoterapia oferece uma abordagem precisa para visar especificamente células tumorais, e portanto tem o potencial de servir como uma plataforma de tratamento altamente eficaz, com um risco reduzido de toxicidade colateral 2-4. As células T engenharia ex vivo para expressar receptores de antigénios quiméricos (CARs) oferecem uma estratégia versátil para imunoterapia de tumor. CARs são gerados por fusão da região variável extracelular de um anticorpo com uma ou mais das células T intracelular molécula (s) de sinalização, em vez de um de histocompatibilidade principal de comprimento completo complexo (MHC) -restricted receptor de células T 5. Este modo de anticorpo-like reconhecimen antígenosobre permite células específicas para o antigénio T reactivas para reconhecer e responder aos antigénios tumorais na ausência de MHC e podem ser adaptados para um repertório antigénio praticamente infinito. CARRO células T modificadas contra uma variedade de antigénios de tumor demonstraram eficácia pré-clínica e excelente na promessa clínica 6-9. Especificamente, no contexto de GBM, uma variante de t CARRO plataforma de direccionamento celular de crescimento epidermal do receptor do factor III (EGFRvIII), uma mutação específica do tumor expressos na superfície da célula 10, foi mostrado prolongar a sobrevivência de ratinhos portadores de glioma 11. Apesar de sua versatilidade, no entanto, o benefício clínico da terapia adoptiva CAR ainda não foi plenamente realizado, em parte devido à imunossupressão associada ao tumor e evasão imune 12-16, bem como desafios na criação e manutenção de células T específicas de antigénio in vivo. Aproveitando padrão de atendimento (SOC) com a imunoterapia pode potencialmente superar vários destes limitações, resultando num aumento da eficácia tanto na configuração de pré-clínica e clínica. SOC para pós-ressecção GBM consiste de temozolomida em altas doses (TMZ), um agente de alquilação de ADN 17, e a irradiação do cérebro inteiro (WBI) 1. Presume-se que estes tratamentos a sinergia com vacinas tumorais via regulação positiva de tumor MHC expressão 18-20 eo derramamento de antígenos pelas células tumorais mortas 17,19,21,22. Com efeito, a adição de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI leva ao aumento da eficácia antitumoral de tratamentos de base imunológica na configuração pré-clínico. Além disso, como muitos quimioterápicos citotóxicos não específicos, TMZ é conhecido por causar 25,26 lymphopenia sistêmica, que pode ser aproveitado como um meio de host-condicionado para as plataformas de terapia adotivos 27-29. Lymphodepletion TMZ mediada tem demonstrado aumentar a frequência e função de células T específicas de antigénio, que conduz a um aumento da eficácia de um adopplataforma terapia tiva contra tumores intracranianos 30. No contexto da terapia de CAR, lymphodepletion serve como um meio de acolhimento-condicionado tanto pela redução do número de células T supressoras endógenas 31, e induzindo a proliferação homeostática 32 através de competição reduzida para citocinas 33, aumentando assim a actividade anti-tumoral 11,34. Dada a relação sinérgica entre SOC e imunoterapia plataformas GBM, avaliando terapias adotivos novos e plataformas de vacina no contexto do SOC é fundamental para tirar conclusões significativas a respeito da eficácia. Neste protocolo, que descrevem um método para a geração e administração intravenosa de células de murino CAR T específicas para EGFRvIII ao lado TMZ e WBI em camundongos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos (veja a Figura 1 para a linha do tempo de tratamento). Resumidamente, as células T são feitos CAR ex vivo por transdução retroviral. Rim embrionário humano (HEK) 293T células são transfectadas utilizando um complexo de ADN / lípido (contendo o vector CAR e plasmídeos pCL-Eco) para produzir vírus, que é então utilizado para transduzir os esplenócitos de murideo activadas que são colhidas e cultivadas em paralelo. Durante o curso da geração CAR, hospedeiros murinos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos são administrados fraccionado em todo o cérebro de irradiação de raios X e TMZ tratamento sistémico com doses comparáveis ​​às SOC clínica. Células carro T são então entregues por via intravenosa aos anfitriões lymphodepleted. O procedimento que se segue é descrita em sete fases distintas: (1) administração de temozolomida para (3) Transfecção Ratos, (2) Irradiação Cérebro Total de Ratos portadores de tumor, que possui o tumor, (4) e esplenectomia Preparação de células T, (5 ) Transdução, (6) Cultura de células T CAR e colheita, e (7) a administração de células T CAR para portadores de tumor Ratos. Estas fases consistem em várias etapas que se estendem por 6-7 dias e são realizadas simultaneamente.

<table><tbody><tr><td>Vetor de embalagem de retrovírus pCL-Eco</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Vetor auxiliar para gerar retrovírus CAR</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Mitógeno não específico para induzir a proliferação de células T e transdução viral</td></tr><tr><td>Retronectina</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Facilita a transdução retroviral de células</td></tr><tr><td>T Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293 meios de cultura</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Meios de cultura de células T</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido</td><td>Medium Life technologies</td><td>11058-021</td><td>Meios de transfecção</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamina</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>Suplemento de meios de cultura de células T</td></tr><tr><td>100 mM Pyruvate de Sódio</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td>Suplemento de meios de cultura de células T</td></tr><tr><td>100X MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais Life</td><td>technologies</td><td>11140-050</td><td>Suplemento de meios de cultura de células T</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoetanol</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>Agente redutor para remover radicais livres</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122 Suplemento de</td><td>mídia de cultura de células T</td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060 Suplemento de</td><td>mídia de cultura de células T</td></tr><tr><td>GemCell Origem dos EUA Soro Fetal Bovino</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Fornece fatores de crescimento e nutrientes para crescimento celular in vitro</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA), Fração V&ndash; Grau Padrão</td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td><td>Bloqueia a ligação não específica do retrovírus às placas revestidas com retronectina</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (concentrado 10x)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lisa os glóbulos vermelhos durante o processamento de esplenócitos</td></tr><tr><td>70 &mu; m Filtros de células estéreis</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtra grandes partículas de tecido durante o processamento de esplenócitos</td></tr><tr><td>Placas de cultura BioCoat de 100 mm com 356469 de poli-D-lisina</td><td>Corning</td><td></td><td>Promove a adesão de células HEK293 para maximizar a proliferação após a transfecção</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Temozolomida</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Pó liofilizado preparado no dia da administração</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Necessário para a dissolução completa da temozolomida</td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Solvente para temozolomida e cetamina/xilazina</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Solução de cetamina</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Solução estéril de xilazina 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

geração de células t para car adoptivo therapy no contexto do glioblastoma padrão de atendimento

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

A imunoterapia adotiva com células T oferece uma estratégia promissora para direcionar e eliminar especificamente gliomas malignos. As células T podem ser projetadas ex vivo para expressar receptores de antígenos quiméricos específicos para antígenos de glioma (células T CAR). A expansão e a função das células T CAR transferidas adotivamente podem ser potencializadas pelos efeitos linfodepletivos e tumoricidas da quimioterapia e radioterapia padrão de tratamento. Descrevemos um método para gerar células T CAR direcionadas ao EGFRvIII, um antígeno específico do glioma, e avaliamos sua eficácia quando combinado com um modelo murino de glioblastoma padrão de tratamento. As células T são projetadas por transdução com um vetor retroviral contendo o gene CAR anti-EGFRvIII. Animais portadores de tumor são submetidos ao condicionamento do hospedeiro por um curso de temozolomida e irradiação cerebral total em regimes de dose projetados para modelar o padrão clínico de atendimento. As células T CAR são então entregues por via intravenosa aos hospedeiros preparados. Este método pode ser usado para avaliar a eficácia antitumoral das células T CAR no contexto do tratamento padrão.

Células carro T são gerados por transdução com o vector retroviral EGFRvIII CAR 11. Este vector, MSGV1, foi desenvolvido a partir do vector SFGtcLuc_ITE4 35, que contém o vírus de células estaminais de murino (MSCV) repetições terminais longas, a região gag estendida e local de splicing do envelope (dador de splicing, sd, e aceitador de splicing, sa), e viral sinal de empacotamento (ψ). O CARRO EGFRvIII contendo o fragmento de anticorpo humano anti-EGFRvIII de cadeia única variável (scFv) 139, em c...

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar linfócitos T murinos geneticamente modificados com receptor de antígeno quimérico e avaliar sua eficácia no contexto do tratamento padrão. Para glioma de alto grau, isso é realizado iniciando primeiramente o tratamento padrão, que consiste na radioterapia de cérebro total e administração de temozolomida em camundongos. Em seguida, produz-se um retrovírus que expressa o vetor car, e então os linfócitos T murinos são transduzidos com o retrovírus car.Por fim, as células T CAR são administradas em camundongos tratados com o padrão assistencial, culminando na entrega das células T CAR em conjunto com a irradiação cerebral total e temozolomida. A administração é utilizada para testar se a condicionamento do hospedeiro pelo padrão assistencial melhora a eficácia de uma plataforma de terapia celular adotiva. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da imunoterapia de tumores cerebrais, como a eficácia antitumoral de novas imunoterapias no contexto do padrão assistencial para gliomas de alto grau.Embora este método possa fornecer informações sobre a eficácia de mi e linfócitos T modificados geneticamente contra gliomas de alto grau, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a avaliação da terapia com linfócitos T contra modelos de tumores de melanoma, pulmão e outras metástases cerebrais. De modo geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois este procedimento exige que várias etapas sejam realizadas em paralelo.Portanto, planejar e organizar tarefas é essencial. A demonstração do procedimento será realizada por Catherine Uni e Carter s Deva, ambos estudantes de pós-graduação talentosos do meu laboratório. Após preparar três miligramas por mililitro de temozolomida ou TMZ em DMSO, coloque a solução em um béquer com água sobre uma placa aquecedora a 65 graus Celsius por 10 a 15 minutos.Uma vez que o TMZ esteja completamente dissolvido, a solução deverá ficar de cor amarelo-pálida. Encha completamente 15 seringas de um mililitro com a solução de TMZ. O TMZ deve ser administrado dentro de 90 minutos após a preparação para garantir que nenhum precipitado de TMZ se forme na solução. Ligue a fonte de irradiação de cérebro inteiro no irradiador de raios X e deixe aquecer; certifique-se de que o filtro apropriado esteja no lugar e insira as configurações corretas de voltagem e corrente.Uma vez que os camundongos tenham sido sedados, de acordo com o protocolo descrito, posicione os camundongos sedados sobre a grade com as cabeças na área que recebe a maior intensidade de raios X. Utilize tubos de chumbo para proteger os corpos a partir da região do pescoço, evitando a exposição sistêmica aos raios X. Coloque os camundongos dentro da máquina de raios X quando a administração dos raios X for concluída.Retire os animais do irradiador. Quando os animais recuperarem consciência suficiente e mantiverem decúbito esternal, coloque-os de volta em suas respectivas gaiolas. Após preparar o meio D 10 e colher as células HEC 2 93 T de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione um mililitro de suspensão celular a 7,5 vezes 10 à sexta células por mililitro em cada uma das placas de 1610 centímetros revestidas com poli-L-lisina contendo 10 mililitros de meio D 10 e incube durante a noite no dia seguinte.E após preparar o plasmídeo de carro e o reagente de transfeção conforme descrito no protocolo textual, adicione o complexo lipídio-DNA gota a gota às células T HEC 293 e incube por seis a oito horas. Em seguida, substitua o meio por 12 mililitros de meio fresco para células T ou TCM. A seguir, despeje um baço sobre uma peneira de malha de 70 micrômetros e desagregue usando a extremidade romba da parte interna de uma seringa de cinco mililitros para gerar uma suspensão de células simples.Após preparar o pool fresco de MCT, transfira o baço dissociado para um tubo cônico de 50 mililitros contendo MCT e centrifugue para obter o pellet. Elimine as hemácias utilizando cinco mililitros de tampão de lise 1x por baço, ressuspendendo as células com mistura suave por pipetagem para cima e para baixo. Coloque a suspensão celular em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos. Retire a reação de lise do banho-maria e adicione MCT numa proporção de um para um em relação ao tampão de lise para neutralizar a reação. Lave centrifugando a 300 Gs por 10 minutos.Após aspirar o sobrenadante, utilize dois mililitros por baço de MCT para ressuspender o pellet. Para contar as células, adicione 10 microlitros de suspensão celular a 190 microlitros de azul de tripan. Uma vez calculado o número total de células, utilize MCT suplementado com dois microgramas por mililitro de concanavalina A e 50 unidades internacionais por mililitro de interleucina-2 humana recombinante para diluir as células até uma concentração de dois vezes 10 à sexta células por mililitro. Adicione dois mililitros ou quatro vezes 10 à sexta células a cada poço de uma placa de cultura de tecidos tratada de 24 poços e incube durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte à esplenectomia.Prepare PBS contendo 25 microgramas por mililitro. Fragmento recombinante de fibronectina humana ou RHFF e revista placas de 24 poços não tratadas para cultura de tecidos adicionando 0,5 mililitros da solução em cada poço no dia seguinte. Remova a solução dos poços e adicione um mililitro por poço de BSA 2% em PBS, incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, remova a BSA virando firmemente a placa de cabeça para baixo antes de adicionar dois mililitros de PBS para lavar. Após coletar o sobrenadante viral das células HEC 2 93 T, adicione TCM fresco a um volume final em mililitros igual ao número de poços revestidos com RHFF, mais três mililitros adicionais. Remova os esplenócitos cultivados do incubador e ressuspenda pipetando suavemente para cima e para baixo de duas a três vezes em cada poço.Transferiremos as suspens&otilde;es celulares para um tubo c&ocirc;nico de 50 mililitros. Em seguida, ressuspenda as c&eacute;lulas no sobrenadante viral at&eacute; obter um milh&atilde;o de c&eacute;lulas por mililitro. Depois, adicione um mililitro por po&ccedil;o da suspens&atilde;o celular &agrave;s cavidades das placas revestidas com RHFF.Agora, centrifugue as placas durante 90 minutos a 32 graus Celsius e 770 GS com uma aceleração de quatro e configuração de freio em zero durante a centrifugação. Prepare 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 humana recombinante em TCM. Após a centrifugação, adicione um mililitro do meio a cada poço das placas e incube durante a noite.Se os linfócitos T atingirem mais de 80% de confluência, divida as células pipetando suavemente para cima e para baixo em cada poço duas a três vezes. Em seguida, transfira um mililitro de cada poço para novos poços de uma placa fresca de cultura de tecidos com 24 poços. Adicione um mililitro de TCM fresco contendo 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 a cada poço; se as células não atingirem mais de 80% de confluência, troque metade do meio pipetando lentamente um mililitro do meio do topo de cada poço e substituindo-o por um mililitro de TCM fresco contendo 50 unidades internacionais por mililitro de IL-2 recombinante humana. Re-suspenda as células CAR T pipetando suavemente para cima e para baixo três vezes em cada poço e transfira para um tubo de centrífuga de 250 mililitros.Centrifugue as células a 300 ×g por 10 minutos. Em seguida, aspire completamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Use PBS para lavar as células, depois conte-as antes de lavar uma segunda vez.Um rendimento típico de células CAR T é aproximadamente uma vez 10 à sexta células por poço com PBS Resus. Suspenda as células numa concentração de cinco vezes 10 à sétima por mililitro para uma injeção de uma vez 10 à sétima em um volume de 200 microlitros para injetar em camundongos com tumor, utilizando uma agulha de 27 a 31 gauge para carregar 500 a 1000 microlitros em uma seringa de insulina, garantindo que todas as bolhas sejam expulsas. As células CAR T foram geradas por transdução com o vetor retroviral CAR E GFR V três, que contém os terminais repetidos longos do vírus da leucemia de camundongo ou MSCV.A região gag estendida, o sítio de splicing do envelope e um sinal de empacotamento viral. O EG FFR V três car contendo o fragmento variável de cadeia simples humano anti-EEG FRV três 1 39 foi clonado no vetor retroviral em tandem com as regiões intracelulares murinas CD oito, tm CD 28 4 1 BBB e CD três zeta. Após a transdução, as células T CAR EG FFR V três podem ser quantificadas e fenotipadas por citometria de fluxo com um painel de duas cores composto por STRT bico rina conjugada com biotina, multímero derivado de EG FFR V três e anti-CD três fit C. Utilizando o protocolo descrito neste vídeo, a expressão de CAR é rotineiramente observada em 55 a 70% das células T murinas positivas para CD três.Células T com CAR podem ser fenotipadas ainda mais pela adição de outros anticorpos marcados com fluoróforos ao painel de dois cores para CAR, como visto neste exemplo; a coloração para CD8 e CD4 mostra que 70% dos CARs transduzidos são células T positivas para CD8, enquanto 20% são células T positivas para CD4. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 12 horas ao longo de um período de uma semana, se for executada corretamente seguindo este procedimento. Outros métodos, como ELISA, ELISpot e/ou coloração intracelular de citocinas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais.Por exemplo, suas células T transduzidas com receptor de antígeno quimérico são funcionalmente responsivas ao reconhecimento de antígeno e essa funcionalidade é específica para o antígeno? Não se esqueça de que trabalhar com retrovírus, temozolomida e radiação de raios X pode ser extremamente perigoso, exigindo precauções como operar em condições BSL dois, usar equipamento de proteção individual, realizar experimentos em áreas designadas e obter treinamento adequado para o manejo de animais.E o uso de equipamentos de raios X deve sempre ser considerado ao realizar esses procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Uma nova metodologia que é utilizada para o tratamento de glioblastomas recorrentes é descrito. Esta abordagem de tratamento emprega a aplicação alternada de tumor eléctrico tratamento campos (TTFields), conhecido como TTF terapia em combinação com bevacizumab, um agente direccionado que está actualmente aprovado pela FDA como monoterapia.

Tumor Tratar Terapia campo em combinação com bevacizumabe para o tratamento do glioblastoma recorrente

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e testes pré-clínicos de murino células CD19 carro T por transdução retroviral e utilização como uma terapia contra linfoma de célula B A20 syngeneic estabelecida em camundongos BALB/c com ou sem lymphodepleting pré-condicionamento.

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

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Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para gerar células T do receptor de antígeno quimérico transitório (CAR) usando mRNA não integrante para imunoterapia contra o câncer e fornece métodos confiáveis para avaliar as células CAR-T e sua função citotóxica.

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

Aprenda a gerar células T CAR específicas para EGFRvIII e avaliar sua eficácia em glioblastoma combinadas com radioterapia craniana e temozolomida em camundongos. Este método demonstra como a imunoterapia pode ser potencializada pelo tratamento padrão.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

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