Name: Cultivo de Heligmosomoides polygyrus: Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda a cultivar o nematode Heligmosomoides polygyrus em camundongos e isolar suas moléculas secretadas com propriedades imunomoduladoras. Este protocolo permite estudar mecanismos de supressão imune e potenciais aplicações terapêuticas.

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Os autores são financiados pelo Wellcome Trust por meio do Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) e Program Grant (Y.H., e R.M.M.) e financiamento da Fellowship (J.R.G.), do BBSRC (G.C.), da American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. e R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) e da Rainin Foundation (D.J.S. e R.M.M.).

NOTA: Todos os procedimentos descritos neste protocolo são realizadas em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Reino Unido Home Office ea Universidade de Edimburgo Serviços Veterinários. 1. infecção de camundongos por sonda <ol><li> Loja larvas Heligmosomoides polygyrus L3 em água destilada por até seis meses a 4 ° C. </li><li> Antes da utilização, lavar larvas L3 três vezes em água destilada: centrifugar a 300 xg durante 10 min (com freio), mas remover todos os 500 ul de água (para evitar larvas L3 perturbador peletizada) e ressuspender o sedimento de cada vez. </li><li> Para a terceira lavagem, adicionar água a um volume exato (normalmente 40 ml) e aspirado de 20 l com uma ponta de corte de 200 mL de alargar a sua abertura. Colocar duas amostras de 20 ul sobre a superfície de um prato de cultura de 60 mm e contar as larvas L3 (geralmente móvel, e melhor visualizado sob 50X de ampliação com um microscópio de dissecção). Ressuspender o sedimento final em água destilada a uma Concentraçãn de 2.000 larvas L3 por ml. </li><li> Para a produção de ciclo de vida, infectar F1 (C57BL / 6xCBA) ratos oito semanas de idade, com 400 H. polygyrus larvas L3 em 200 mL de água destilada por sonda oral (ratos conter na posição vertical pela nuca do pescoço e passar suavemente a agulha de gavagem romba através da boca e do esófago para o estômago). Agitar bem antes de cada infecção (larvas resolver rapidamente em água) e 200 ul de aspirado numa seringa de 1 ml; utilizar uma agulha de gavagem dedicado com uma extremidade arredondada. Para a infecção experimental de ratos mais jovens (6-8 semanas de idade), ou outras estirpes puras (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC), infectar ratinhos com 200 larvas L3. </li></ol> 2. Propagação e Manutenção de H. polygyrus <ol><li> Coloque carvão no centro de uma grande banheira de plástico e deixe a água fria da torneira a correr sobre ele para um mínimo de 30 min (carvão ativado unwashed é tóxica para as larvas L3). Escorra a água da banheira e coloque o carvão vegetal em two camadas de papel absorvente, deixando-o exposto ao ar ambiente até ficar completamente seca. </li><li> Se forem necessários ovos, raspar fezes primeiro fora do cólon com uma pinça e tesouras (se necessário). Se for necessário um grande número de larvas L3, colocar em ratinhos uma grelha de arame e recolher partículas fecais ao longo de vários dias. </li><li> Misturar as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos 1: 1, para atingir uma consistência suficiente para amortecer apenas aderir a papel de filtro. Espalhar uma camada fina sobre o centro de algum papel de filtro umedecido em uma placa de Petri e colocar isso em uma caixa úmido (adicione um pouco de toalha de papel úmido e um prato de água) no escuro durante 12-14 dias. </li><li> Remover larvas L3 a partir do dia 7 em diante, e recolhê-las em pelo menos duas ocasiões antes do papel ser descartado. As larvas formar um anel em torno da borda do papel de filtro; levantar o papel de filtro para fora do prato de petri e enxaguar as larvas que estão à esquerda da placa (usando uma pipeta, 5 ml de água estéril por placa) para um tubo de 50 ml. </li><li> Elevadorfora do papel de filtro e colher as larvas restante deixado na placa com água destilada para um tubo de 50 ml. Centrifuga-se a solução efluente a 300 xg durante 10 min. Lavar as larvas três vezes com água destilada e, em seguida, armazenar a 4 ° C no máximo de 50 ml de água destilada, até ser necessário. NOTA: As larvas permanecem viáveis ​​e infectantes por pelo menos 6 meses. </li></ol> 3. Cobrança de Adulto H. polygyrus Worms <ol><li> Prepare o Aparelho de Baermann modificado com antecedência como mostrado na Figura 1. </li><li> Cull ratinhos 14 dias após a infecção. </li><li> Lavar o abdómen com etanol a 70%. Corte a pele sobre o abdômen e puxar para trás para revelar a parede abdominal anterior. Fazer incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. </li><li> Remover todo o intestino delgado e grande (a partir de duodeno proximal para distal recto). Colocar num prato de Petri e seco. </li><li> Endireitar o intestino ao longo de todo o seu comprimento; excisar o cólon fezes contendo; colocar isso em um prato separado para ovos preparações posteriores. </li><li> Extirpar o proximais 20 cm de intestino delgado que contém os vermes adultos -identified pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes uma aparência vermelho devido aos vermes intra-luminais. Colocar em um (100 mm de diâmetro) caixa de Petri com 5 ml de solução de Hanks, aquecido a 37 ° C (dois espécimes por prato). </li><li> Abra a porção proximal do intestino cheio de verme longitudinalmente com a tesoura (tesoura redondas-ended são os melhores para isso), e raspar para baixo dentro do intestino alinhando com duas lâminas de vidro para remover os vermes. Em seguida, descartar a parede do intestino limpo. </li><li> Dica vermes em pequenos sacos de musselina, grampo fechado e seguro, com clipes de papel ao redor da borda do funil de vidro (Figura 1). </li><li> Preencha funil com solução de Hanks e adicionar cerca de 4 placas de Petri de vermes em cada funil. </li><li> Local aparelho em 37 ° C incubadora durante 1-2 horas, agitando suavemente a meio para desalojardetritos a partir da preparação do intestino que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar o derramamento de detritos fora do saco de musselina - isso fará com que a contaminação da preparação final HES. Os vermes adultos deveria ter migrado lentamente através do pano de musselina e estabeleceu-se na parte inferior do tubo de ensaio de vidro. Retirar cuidadosamente o tubo de ensaio da mangueira de borracha que liga em cima da pia (tendo o cuidado de evitar a perda de vermes neste momento). </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transferir os vermes em um tubo de 50 ml e lavar seis vezes com Hanks Solution (permitir vermes de se contentar com a gravidade, ao remover a mídia com um stripette, adicione 40 ml de Hanks Solution e repita cinco vezes). NOTA: cultura verme deve ser mantido estéril a partir deste ponto em diante. <ol><li> Mover para uma câmara de fluxo laminar e lavar mais seis vezes em solução estéril de Hank suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, pronto para a cultura in vitro. </li></ol></li><li> Contar overmes adultos recuperados por tomar duas amostras de 20 l retomado com um corte de ponta amarela de alargar a sua abertura; esperar que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas. </li></ol> 4. Configurando culturas para HES: Preparação Médio, lavagem vermes adultos <ol><li> Embeber os vermes de 3,11 em cerca de 10 ml de RPMI suplementado com 10% de gentamicina durante 20 min, deixando o tubo de repouso em um ângulo para assegurar vermes são totalmente cobertas. </li><li> Executar esta numa câmara de fluxo laminar: lavar novamente seis vezes com a solução de Hanks (suplementado com 5 U / ml de penicilina e 5 ug / ml de estreptomicina). </li><li> Prepare H. media polygrus. </li><li> A manutenção de esterilidade numa capela de fluxo laminar, para 500 ml de RPMI 1640, adicionar 11,1 mL de 45% de glucose (concentração final 1,2% em RPMI1640 contém 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-Estreptomicina (concentração final de 5 U / ml de penicilina, 5 ug / ml de estreptomicina), 5 mL de L-glutamina (concentração final 2 mM), e5 ml de gentamicina (concentração final de 1%). Não adicione FCS. </li><li> Vermes alíquotas em frascos T25 ventilados, aprox. 1.000 vermes em 15 ml H. polygyrus media por frasco, e coloque na posição vertical em 37 ° C incubadora (5% de CO 2) por 3 semanas. </li></ol> 5. Preparação de HES <ol><li> Recolha HES contendo meio de cultura a partir de culturas em intervalos de não mais do que duas vezes por semana, deixando de lado a primeira coleção após 24 horas de cultura (devido aos altos níveis de contaminação LPS e proteínas do hospedeiro - podem ser processados ​​separadamente ou descartados). Mantenha cada recolha selectiva e claramente marcado com a data e número do lote. Substitua-o por um volume igual de H. polygyrus media em cada ocasião. </li><li> Centrífuga-HES contendo meio a 400 x g durante 5 min. Em seguida, filtrar esterilizar através 0,2 mm filtros de baixa proteína de ligação em tubos de 50 ml. Loja no freezer -20 ° C claramente identificada com data de verme colheita e data de HES collection. </li><li> Após 21 dias de coleta de HES de cultura, descarte worms. </li><li> Piscina 500-1000 ml de HES sobrenadante (geralmente a partir de estoque congelado, e não incluindo a recolha hr primeiro 24) e se concentram sobre um filtro 3000 MWCO no dispositivo de ultrafiltração sob pressão de azoto. NOTA: Tenha muito cuidado para não deixar a corrida filtro seco. <ol><li> Para configurar o dispositivo de filtro, primeiro lave 3 membrana kDa lado do brilhante para baixo num copo de 1 litro com água destilada por 3 x 20 min com agitação. Monte o dispositivo de ultrafiltração, conforme as instruções do fabricante, com membrana de filtro lado brilhante para cima. Em lugar do armário, a 4 ° C e passar 50 ml de água destilada através antes de começar a concentrar HES reunidas. </li><li> Adicionar a cada tubo de HES no dispositivo de filtração, conforme necessário (100-140 mL por dia), até que o volume é concentrada até 2-5 ml. </li></ol></li><li> A fim de remover os contaminantes do meio de cultura contendo HES, adicionar 50 ml de pirogénio-PBS livre para o dispositivo de filtração e, em seguida, concentrar e para baixo a cerca de 2 ml. Repetir este passo duas vezes (150 ml de PBS no total). Transferir HES em um tubo de 15 ml, esterilizar filtro (com um filtro de 0,2 um) numa câmara de fluxo laminar e medir a concentração de proteína usando um espectrofotómetro (E 280 = 10) ou pelo ensaio de Bradford. </li><li> Aliquota, a etiqueta com o número de lote e data, e congelamento a -80 ° C. </li><li> Realizar um ensaio de LAL cromogénico de acordo com os protocolos do fabricante em cada lote de HES antes da utilização. Se os níveis de LPS são maiores do que 1 U LPS por 1 mg de proteína, considere não usar este lote para experimentos in vivo ou em culturas in vitro. </li><li> Processar os HES recolhidos às 24 h separadamente da mesma maneira; ele conterá LPS e algumas proteínas do hospedeiro e, enquanto não é adequado para experiências funcionais, é uma fonte útil de moléculas individuais que podem ser isolados por purificação de afinidade de anticorpo monoclonal. </li></ol&gt;

Os autores não têm conflitos de interesse.

O ciclo de vida de H. polygyrus procede de maneira consistente com fiabilidade. Após a ingestão singular ou gavagem oral de larvas L3 no dia 0, começam a formar cistos sob a serosa duodenal por dia 5, progredindo para moults larvais e, em seguida, como vermes adultos emergentes para o lúmen do intestino desde o dia 10, os ovos podem ser vista nas fezes, a partir de dia 14 e granulomas são visíveis na superfície serosa do duodeno a partir do dia 21. O protocolo descrito acima (e resumidos na Figura 6) permite a produção de elevado rendimento de H. polygyrus produtos de excreção e secreção (HES), além de recuperação de confiança de larvas L3 viável para futuras infecções experimentais e de ciclo de vida. Infecção polygyrus H. demonstrou ser protectora em modelos de asma dependentes OVA ou Der p 1 (Casa alérgeno dos ácaros do pó) 14. Além disso, a supressão da inflamação das vias aéreas pode ser transferido com CD4 + CD25 + </sup&gt; células T reguladoras 14 ou CD19 + CD23 hi células B reguladoras 24 de não-sensibilizados, H. polygyrus ratinhos infectados. Em modelos de auto-imunidade, H. polygyrus infecção tem sido mostrado para ser supressiva no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) de esclerose múltipla 9 e supressão pode ser transferido com a utilização de células CD4 + T ou células B CD19 + a partir de ratinhos infectados 24. Heligmosomoides polygyrus produtos de excreção e secreção (HES) modulam a resposta imune do hospedeiro e suprimir a inflamação mediada por Th2 por um número de mecanismos (esboçado na Figura 7), incluindo: a) A inibição da capacidade de resposta à estimulação de células dendríticas 25, b) indução de células T CD4 + Foxp3 + células T reguladoras 18. e c) o bloqueio da produção de IL-33 20. HES tem sido mostrado para ser protectora quando administrada umat sensibilização ou desafio no modelo OVA-alum de asma 19 e também quando administrado por via intranasal com extrato de Alternaria alérgeno 20, através da supressão de início de IL-33 release. Evitar a contaminação LPS de HES é muitas vezes crucial para o sucesso de futuras experiências imunológicas. No protocolo descrito aqui, os passos críticos para atingir este são para garantir que os detritos contidos dentro dos sacos de musselina do aparelho Baermann não entra na preparação HES final (ver 2.10) e deixar de lado solução ES a partir da primeira 24 horas de cultura (ver 5.1). Nos últimos anos, HES foi completamente caracterizado a nível da proteômica com mais de 370 proteínas distintas identificadas 26,27. Além disso, as larvas de ES fase 4 foi submetida a análise proteómica 28. Os trabalhos em curso inclui a caracterização dos principais componentes de glicanos de HES, conhecido por ser fortemente imunogênica 3, e secretada micro-RNComo que são encapsulados em 50-100 vesículas nm ou exossomos (Buck et al., Submetido para publicação). Com o estabelecimento de protocolos reprodutíveis para a recolha de ES a partir deste parasita altamente imunomodulador, e com grande quantidade de dados de proteômica que identificam os componentes moleculares do HES, o palco já está definido para a identificação e teste terapêutico de moléculas individuais de H. polygyrus que podem mediar os efeitos principais sobre o sistema imunitário do hospedeiro.

Heligmosomoides polygyrus é um helminto gastrointestinal murino natural que está intimamente relacionado com altamente prevalentes nematóides parasitos humanos 1. Em contraste com outros modelos de nematóides tais como Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus consistentemente estabelece a infecção crônica em camundongos como um resultado direto de múltiplos mecanismos poderosos imunomoduladores que emprega para suprimir a resposta imune do hospedeiro 2. H. polygyrus tem um ciclo de vida direto: larvas L3 infectantes são ingeridos por transmissão FECO-oral (ou administrada por sonda oral no ambiente de laboratório), após o que eles migram para a camada subserosal do duodeno e enquistam antes de voltar para o lúmen intestinal como vermes adultos cerca de oito dias após a infecção inicial. Acasalamento e produção de ovos ocorre no dia 10 e é possível colher vermes adultos para a cultura e recolha de produtos de excreção e secreção de Day 14 em diante 3. H. polygyrus também interage com a microflora comensal, com aumento lactobacilos presentes em camundongos susceptíveis infectados 4-6, e aumento dos níveis de H. polygyrus infecção após a exposição de ratos para Lactobacilli 6. Infecção ativa com H. polygyrus tem demonstrado proteger contra a imunopatologia em diversos modelos animais de autoimunidade 7-10, colite 11,12 alergia e 13-16. Houve, consequentemente, grande interesse no potencial de moléculas de excreção e secreção de este parasita (&quot;HES&quot;) para down-modular patologia in vivo 17,18. De fato, os efeitos protetores são vistos após o tratamento de camundongos com produtos HES 19 através de vias que estão agora a ser identificados 18,20. Aqui nós descrevemos um protocolo para a produção confiável de Heligmosomoides polygyrus e recuperação de seus produtos secretadosque pode ainda ser utilizada para uma série de investigações bioquímicas e imunológicas funcionais.

<table><tbody><tr><td>Concentrador Amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Modelo 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada Hanks'</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Solução de glicose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml solução a 45% http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>Frascos T25</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>Frasco ventilado de 25cm http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Ensaio cromogênico LAL</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 ensaio http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; sem L-glutamina http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivo de<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; um imunomodulador nematode parasite e seus produtos secretados

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (anteriormente conhecido como Nematospiroides dubius, e também conhecido por alguns como H. bakeri) é um helminto gastrointestinal que emprega vários mecanismos imunomoduladores para estabelecer infecção crônica em camundongos e se assemelha infecções por helmintos humanos prevalentes. H. polygyrus tem sido extensivamente estudado na área de regulação imune derivada-helmíntico e foi encontrado para suprimir potentemente modelos experimentais de autoimunidade e alergia (ambos com infecção activa e produtos secretados isolado). O protocolo descrito no presente documento descreve gestão do H. ciclo de vida polygyrus para uma produção consistente de larvas L3, recuperação de parasitas adultos e coleta de seus produtos de excreção e secreção (HES).

A susceptibilidade à infecção por H. polygyrus é controlada em grande medida pelo fundo genético da estirpe de ratinho (Tabela 1); Camundongos C57BL / 6 e CBA são altamente suscetíveis 21,22. Para a manutenção do ciclo de vida do parasita, o híbrido F1 entre estas duas estirpes foi escolhido pela sua capacidade para suportar carga parasitária muito mais elevadas, sem morbidez (dano epitelial intestinal excessiva) em comparação com as estirpes parentais. Gavagem oral de 400 larvas L3 é usado para manter o ciclo de vida em ratinhos F1 (resultando em fardos de vermes adultos, mostrados na Figura 2), enquanto que uma dose de 200 larvas L3 é geralmente utilizado para experiências em estirpes puras homozigóticas (por exemplo, ratinhos C57BL / 6 ou BalbC). No entanto, esta dose pode ter de ser reduzida de acordo com os co-factores ambientais que podem diferir entre as instalações de animais, tais como variações na flora intestinal. Os lotes de HES provaram efi reprodutívelcácia em ensaios funcionais e na composição das proteínas; Além disso, quando foram analisados ​​os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura, até um total de 4 semanas, os perfis de proteínas foram encontrados para ser muito semelhante (Figura 3). Quando a concentração de HES é medida pelo ensaio de Bradford (ver 5.5), o total proteína é geralmente cerca de 1 mg / mL (Figura 4). Um método alternativo de se concentrar HES é com um concentrador centrífugo (por exemplo, 3-kDa membrana de corte Vivaspin), em que as amostras são centrifugadas a até 4.000 g numa centrifugadora de rotor basculante para fora, remoção de sais do tampão e os componentes de baixo peso molecular. Concentração centrífuga é o mais adequado para processamento de volumes pequenos (1-10 ml) e são limitados a um máximo factor de concentração de aproximadamente 30x. Ao coletar HES, prevenção da contaminação é crítica. Para evitar a contaminação com moléculas do hospedeiro, descartamos HES-containing meios de cultura a partir do primeiro de 24 horas após a colheita verme adulto a partir do intestino mouse. Nós também quantificar o nível de contaminação por LPS em cada lote de HES com um ensaio cromogénico de LAL (ver 5.7). 1 U de LPS equivale a ~ 100 pg LPS e níveis abaixo desta são consideradas insignificantes 23. Em nossas mãos, a maioria dos lotes de HES são significativamente abaixo deste limite, a concentração média de LPS em HES sendo 0,23 U / g (Figura 5). Os efeitos de LPS em modelos in vivo de patologia (por exemplo, a supressão de respostas asmáticas) requer, pelo menos, 10 ng de LPS 23. Daí a administração in vivo de 5 ug HES de um lote com 100 pg LPS / ug HES vai incluir 500 LPS pg, bem abaixo da concentração eficaz onde LPS se torna um problema. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figura 1: Aparelho de Baermann Baerconfiguração Aparelho mann para a coleta de adulto H. polygyrus (como descrito na seção 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figura 2: A média de Worm Burden 14 dias após a infecção com 400 L3 Larvas Média verme pesa 14 dias após a infecção com 400 larvas L3. Os pontos de dados mostrados são de 19 rodadas separadas de infecção de camundongos C57BL / 6xCBA. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figura 3: Perfis de proteínas de HES de semanas sucessivas em cultura perfil de SDS-PAGE de proteínas de HES recolhidos em semanas sucessivas de cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figura 4: </strong&gt; Quantidade final de HES a partir de 500 ml contendo meio de ES-Rendimento de proteína a partir de HES 11 lotes diferentes derivadas de cerca de 500 ml de sobrenadante da cultura. A média ± SEM mostrado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figura 5: Níveis de contaminação por LPS de HES de contaminação por LPS em 41 lotes de HES medidos pelo ensaio de Limulus ameobocyte. Concentração de LPS Média = 86 U por mg de HES. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figura 6: Animated esquemática do H. polygyrus Ciclo de Vida Resumo das principais fases do ciclo de vida de sonda oral de larvas L3, através da recuperação de larvas e vermes adultos para isolamento de HES. Figura 7: Animated esquemática do HES e suas funções efeitos imunomoduladores chave de mediadores solúveis e exosomes contidos HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genótipo (e fundo tensão) </td><td> Fenótipo Infecção Primária </td><td> Referência </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Linhagens puras </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 e C57BL / 10 </td><td> Suscetível </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermediário </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Baixa susceptibilidade </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para citocinas ou receptores de citocinas </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Menos suscetível (a); nenhuma mudança na susceptibilidade mas aumentou granulomas (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rp transgénico (C57BL / 6) </td><td> Resistente </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (ratinhos C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Altamente suscetíveis </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (ratinho BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Altamente resistente </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgénico(FVB) </td><td> Resistente </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Deficiência de Th2, diminuiu granuloma gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Nenhuma mudança na susceptibilidade </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Alta Th1, aumento da susceptibilidade </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para marcadores de células T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Marginalmente maior fecundidade </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Superior </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (ratinho BALB / c) </td><td> Fecundidade Higher &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgênico para loci imune inata </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 do receptor de interferão (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Fecundidade mais elevada, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Mais resistentes, mais granulomas </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Mais susceptíveis </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: As infecções primárias com H. polygyrus em geneticamente diferentes e gene-targetted linhagens de camundongos.

Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

O objetivo geral deste procedimento é coletar e analisar as moléculas secretadas por helmintos de vida longa que desativam as respostas imunológicas do hospedeiro, permitindo assim a sobrevivência dos parasitas. Isso é realizado primeiramente cultivando os parasitas em seu habitat natural, o trato intestinal de camundongos. O segundo passo é isolar os parasitas maduros dos camundongos após a eutanásia.Em seguida, os parasitas helmintos são cultivados em cultura de tecidos, em meio apropriado, por até três semanas, período durante o qual liberam grandes quantidades de moléculas excretadas, secretadas ou moléculas ES. O passo final consiste em recuperar e concentrar as moléculas liberadas dos sobrenadantes da cultura em lotes de ES para testes biológicos e bioquímicos. Em última instância, os sobrenadantes concentrados podem ser testados diretamente sobre tipos celulares específicos in vitro para estudar alterações na função das células imunológicas ou administrados a camundongos para avaliar sua capacidade de suprimir alergias e outras doenças.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando observamos que a imunossupressão estava associada à infecção por parasitas vivos, indicando a liberação ativa e contínua de moléculas imunossupressoras por parasitas vivos. Embora este método possa fornecer informações sobre infecções parasitárias, as moléculas que descobrimos suprimirem a imunidade têm grande potencial para tratar doenças importantes do mundo ocidental, como alergias, autoimunidade e doença inflamatória intestinal. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos para recuperar e processar parasitas helmintos são bastante especializados e exigem atenção particular à técnica de cultura asséptica.Murinos F1 com oito semanas de idade serão infectados com larvas de H. polygrus por meio de gavagem oral para a produção do ciclo de vida de H. polygrus. Prepare as larvas L3 de H. polygrus a 2000 por mililitro de água destilada conforme descrito no protocolo anexo. Administrar 400 larvas L3 por camundongo em 200 microlitros antes de cada infecção.A homogeneíze a suspensão de larvas invertendo-a cinco vezes usando uma seringa de um mililitro com uma agulha dedicada para gavagem com extremidade arredondada; aspire 200 microlitros da suspensão de larvas. Para realizar a gavagem oral, segure o camundongo em posição ereta pelo pescoço e passe suavemente a agulha romba da gavagem pela boca e pelo esôfago até o estômago. Verme adultos e ovos de parasitas serão recuperados do camundongo.14 dias após a infecção, 14 dias após a infecção. Vermes adultos de H. polygyrus são coletados dos camundongos utilizando um aparelho de Bayliss modificado, preparado conforme mostrado aqui. Para iniciar este procedimento, lave o abdômen do animal eutanasiado com etanol a 70%.Corte a pele sobre o abdômen e puxe para trás para expor a parede abdominal anterior. Faça uma incisão mediana para acessar a cavidade peritoneal. Remova todo o intestino delgado e grosso, do duodeno proximal até o reto distal.Coloque-o em uma placa de Petri seca. Alise o intestino ao longo de todo o seu comprimento, excise o cólon contendo fezes e coloque-o em um recipiente separado para recuperar os ovos posteriormente. Em seguida, identifique os 20 centímetros proximais do intestino delgado que contêm as formas adultas dos vermes.É caracterizado pela parede relativamente espessa do duodeno e frequentemente apresenta aparência avermelhada devido aos vermes intraluminais. Resseque esta porção do intestino delgado e coloque-a em uma placa de Petri com cinco mililitros de solução de Hank. Aqueça a 37 graus Celsius utilizando tesoura de pontas arredondadas.Abra longitudinalmente a porção proximal do intestino cheia de vermes e raspe o interior do revestimento intestinal com duas lâminas de vidro. Para remover os vermes, descarte a parede intestinal limpa. Monte o funil com solução de Hank.Prenda com grampos um pequeno saco de musselina e despeje nele os vermes de duas placas de Petri. Coloque dois sacos de musselina em cada funil de vidro e fixe-os com clipes de papel ao redor da borda do funil. Posicione o aparato em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma a duas horas.Na metade do período de incubação, agite suavemente o aparelho para desprender detritos da preparação intestinal que possam obstruir o filtro de musselina. Tenha cuidado para evitar derramar detritos para fora do saco de musselina, pois isso causará contaminação na preparação final de HES. Ao final da incubação, retire cuidadosamente o tubo de coleta da mangueira de conexão sobre uma pia utilizando uma pipeta de plástico, transfira os vermes para um tubo de 50 mililitros e deixe os vermes sedimentarem pela ação da gravidade.Remova o meio com uma pipeta de borracha. Adicione 40 mililitros da solução de Hank e deixe as minhocas sedimentarem. Repita cinco vezes, totalizando seis lavagens. É fundamental evitar a contaminação da cultura turva para o sucesso deste protocolo.A cultura de vermes deve ser mantida estéril a partir deste ponto. Transfira para uma cabine de fluxo laminar e lave a cultura de vermes outras seis vezes em solução de Hank estéril, suplementada com antibióticos, usando uma pipeta, e colete duas amostras de 20 microlitros para contagem dos vermes adultos recuperados. Espera-se que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas colete ovos no dia 14 de infecção, para raspar as fezes do cólon previamente ressecado com pinça.Em seguida, misture as fezes com carvão granulado numa proporção de pelo menos um para um. Para obter uma consistência que adere apenas o suficiente para preencher uma folha de papel. Espalhe uma camada fina no centro de uma folha de papel filtro úmido em uma placa de Petri e coloque-a em uma caixa úmida e à prova de luz para mantê-la no escuro por 12 a 14 dias.A partir do sétimo dia, comece a coletar as larvas L3. Forme um anel ao redor da borda do papel de filtro. Levante o papel de filtro para fora da placa de Petri e use uma pipeta para adicionar cinco mililitros de água estéril por placa, a fim de enxaguar as larvas que permaneceram na placa.Transfira as larvas para um tubo de 50 mililitros. Devolva o papel filtro ao recipiente e substitua no escuro, repetindo a coleta de larvas semanalmente por até um mês. As larvas coletadas são então lavadas conforme descrito no texto do protocolo e armazenadas a quatro graus Celsius em água destilada.Para iniciar este procedimento, mergulhe os vermes em aproximadamente 10 mililitros de solução de Hank, suplementada com 10% de gentamicina, durante 20 minutos, mantendo o tubo em posição inclinada para garantir que os vermes fiquem completamente cobertos após 20 minutos. Lave os vermes seis vezes com solução de Hank, suplementada com antibióticos, e transfira os vermes para frascos T 25 ventilados. Coloque os frascos na posição vertical em uma incubadora a 37 graus Celsius por três semanas, visando a obtenção de produtos excretórios e secretórios ou HES provenientes dos vermes.Cultura contendo HES. O meio é coletado das culturas em intervalos de no máximo duas vezes por semana, sendo substituído por um volume igual de meio h polyus a cada vez. Mantenha cada coleta separada e claramente rotulada com a data e o número do lote, devido ao maior risco de contaminação com LPS e proteínas do hospedeiro.A primeira coleta após 24 horas de cultivo deve ser separada e processada separadamente ou descartada. Centrifugue o HES contendo meio a 400 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, aspire o meio com uma seringa de 50 mililitros e filtre através de um filtro com baixa ligação a proteínas de 0,2 mícron para tubos de 50 mililitros. Posteriormente, o sobrenadante de HES em pool é concentrado em um filtro com limite de peso molecular de 3000 em um dispositivo de ultrafiltração sob pressão de nitrogênio. Para montar o dispositivo de filtração, primeiro lave a membrana de três kilodaltons com o lado brilhante voltado para baixo em um béquer de um litro com água destilada sob agitação.Monte o dispositivo de ultrafiltração conforme as instruções do fabricante, com o lado brilhante da membrana de filtro voltado para cima, coloque em uma câmara a quatro graus Celsius e faça passar 50 mililitros de água destilada antes de iniciar a concentração do HES vertido. Tenha muito cuidado para não deixar o filtro secar. Adicione cada tubo de HES ao dispositivo de filtração conforme necessário, até que o volume seja concentrado de dois a cinco mililitros, com o objetivo de remover aminoácidos e outros componentes do meio de cultura de tecidos.A partir do preparo de HES, adicione 50 mililitros de PBS livre de pirogênio ao dispositivo de filtração e, em seguida, concentre até aproximadamente dois mililitros. Repita este passo duas vezes. Usando um total de 150 mililitros de PBS, transfira um ES para uma seringa e filtre esterilizando com um filtro de 0,2 mícron.Após medir a concentração proteica, rotule a alíquota com o número do lote e a data e congele a menos 80 graus Celsius. A gavagem oral de 400 L em três larvas é utilizada para manter o ciclo de vida de H poly gyus em camundongos F1. As cargas resultantes de vermes adultos são mostradas aqui.Lotes de HES demonstraram eficácia reprodutível em ensaios funcionais e na composição proteica. Além disso, quando os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultivo foram analisados, observou-se que os perfis proteicos foram muito semelhantes por até um total de quatro semanas. Quando a concentração de TS é medida pelo ensaio de Bradford, a proteína total geralmente é de aproximadamente um miligrama por mililitro.O rendimento da proteína HES obtido a partir de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 mililitros do sobrenadante do cultivo é apresentado. A prevenção de contaminação é essencial durante a coleta de HES, quando os níveis de contaminação por LPS em 41 lotes de HES foram medidos pelo ensaio limbo AAMI CYTE. A maioria dos lotes de HES apresentou níveis significativamente abaixo do limite recomendado de contaminação.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter uma técnica estéril cuidadosa ao preparar os cultivos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente seguindo este procedimento. Outros métodos, como proteômica, fracionamento de proteínas e análise de glicanos, lipídios e microRNAs, podem ser realizados para compreender completamente o espectro de produtos moleculares liberados por esses parasitas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como propagar Poly limus. O objetivo é Polyus e coletar produtos DS dos vermes adultos cultivados para testar seus efeitos no sistema imunológico. Embora este parasita não seja patogênico para humanos, é importante seguir as precauções de segurança e aderir ao protocolo especificado para garantir a reprodutibilidade entre os lotes de Hess.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Trichuris Muris infecção intestinal é um modelo de imunidade Th2 onde os ratos resistentes ao gerar uma resposta protetora Th2 e camundongos suscetíveis de gerar uma resposta Th1 patológico.

Trichuris Muris Infecção: Um Modelo de imunidade do tipo 2 e inflamação no intestino

O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Os nematoides de Caenorhabditis selvagens estão associados a muitos micróbios, muitas vezes no lúmen intestinal ou infectando o intestino. Este protocolo detalha um método para enriquecer micróbios não culturais colonizando o intestino, aproveitando a resistência da cutícula dauer.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

As células T e ILC2 que expressam IL-9 são induzidas durante a infecção por N. brasiliensis , mas sua caracterização tem sido amplamente negligenciada no intestino infectado devido à sua baixa frequência e cinética diferencial. Este protocolo descreve o isolamento dessas células de diferentes órgãos-alvo e a confirmação de sua identidade via citometria de fluxo em diferentes estágios de infecção.

Uma estratégia para o estudo de células linfoides produtoras de IL-9 no modelo de infecção por Nippostrongylus brasiliensis

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Strongyloides ratti é um nematóide parasita que causa infecções transitórias em camundongos de laboratório, exibindo estágios de migração de tecidos e vida intestinal. Aqui, apresentamos um protocolo para a manutenção do ciclo parasitário em ratos e infecção experimental de camundongos, incluindo quantificação do parasita na cabeça, pulmão e intestino.

Infecção experimental de camundongos com o nematóide parasita Strongyloides ratti

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Aprenda a cultivar o nematode Heligmosomoides polygyrus em camundongos e isolar suas moléculas secretadas com propriedades imunomoduladoras. Este protocolo permite estudar mecanismos de supressão imune e potenciais aplicações terapêuticas.

Cultivo de

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