Cultivo de Heligmosomoides polygyrus: Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

O objetivo geral deste procedimento é coletar e analisar as moléculas secretadas por parasitas helmuth de vida longa que regulam negativamente as respostas imunes do hospedeiro, permitindo assim a sobrevivência dos parasitas. Isso é feito primeiro cultivando os parasitas em seu habitat natural, o trato intestinal dos camundongos. O segundo passo é isolar os parasitas maduros dos camundongos após a eutanásia.

Em seguida, os parasitas helmuth são cultivados em cultura de tecidos, em erupção média por três semanas, período durante o qual liberam grandes quantidades de moléculas excretoras, secretoras ou ES. A etapa final é recuperar e concentrar as moléculas liberadas dos sobrenadantes da cultura em lotes de ES para testes biológicos e bioquímicos. Em última análise, os sobrenadantes concentrados podem ser testados diretamente em tipos específicos de células in vitro para estudar mudanças na função das células imunológicas ou administrados a camundongos para testar sua capacidade de suprimir alergias e outros distúrbios.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que a imunossupressão estava ligada à infecção por parasitas vivos, indicando liberação ativa e contínua de moléculas imunossupressoras de parasitas vivos. Embora esse método possa fornecer informações sobre infecções parasitárias, as moléculas, descobrimos que suprimir a imunidade provavelmente serão muito eficazes no tratamento de doenças-chave do mundo ocidental, como autoimunidade alérgica e doença inflamatória intestinal. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas para recuperar e processar os parasitas helmuth são bastante especializadas e precisam de atenção especial à técnica de cultura asséptica.

Camundongos F1 de oito semanas de idade serão infectados com larvas de H polyus por gavagem oral para o ciclo de vida da produção de H polyus. Preparar H polyus L três larvas a 2000 por mililitro de água destilada, conforme descrito no protocolo anexo. Texto para dar 400 L três por camundongo em 200 microlitros antes de cada infecção.

A educar a suspensão de larvas invertendo-a cinco vezes usando uma seringa de um mililitro com uma agulha de gavagem dedicada com uma extremidade arredondada aspirar 200 microlitros da suspensão de larvas. Para realizar a gavagem oral, prenda o camundongo na posição vertical pela nuca e passe suavemente a agulha de gavagem romba pela boca e pelo esôfago até o estômago. Vermes adultos e ovos de parasitas serão recuperados do camundongo.

14 dias após a infecção, 14 dias após a infecção. Os vermes h polyus adultos são coletados dos camundongos usando um aparelho de bayamon modificado preparado como mostrado aqui. Para iniciar este procedimento, lave o abdômen do animal eutanasiado com etanol 70%.

Corte a pele sobre o abdômen e puxe para trás para revelar a parede abdominal anterior. Faça uma incisão na linha média para entrar na cavidade peritoneal. Remova todo o intestino delgado e grosso do duodeno proximal até o reto distal.

Coloque-o em uma placa de Petri seca. Endireite o intestino ao longo de todo o seu comprimento que excisa as fezes contendo cólon e coloque-o em um prato separado para recuperar os ovos mais tarde. Em seguida, identifique os 20 centímetros proximais do intestino delgado que contém os vermes adultos.

É caracterizada pela parede relativamente espessa do duodeno e muitas vezes tem uma aparência vermelha devido aos vermes intraluminais. Extirpe esta porção do intestino delgado e coloque-a em uma placa de petróleo com cinco mililitros da solução de Hank. Aqueça a 37 graus Celsius usando uma tesoura de ponta redonda.

Abra a porção proximal do intestino preenchida com vermes longitudinalmente e raspe o interior do revestimento do intestino com duas lâminas de vidro. Para remover os vermes, descarte a parede intestinal limpa. Construa o funil com a solução de Hank.

Grampeie um pequeno saco de musselina fechado e despeje os vermes de duas placas de Petri nele. Arrume dois sacos de musselina em cada funil de vidro e prenda os sacos com clipes de papel ao redor da borda do funil. Coloque o aparelho em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma a duas horas.

Na metade da incubação, agite suavemente o aparelho para desalojar os detritos da preparação intestinal que podem ocluir o filtro de musselina. Tome cuidado para evitar derramamento de detritos fora do saco de musselina, pois isso causará contaminação na preparação final do HES. No final da incubação, retire cuidadosamente o tubo de ensaio de coleta da mangueira de borracha conectada sobre uma pia usando uma pipeta de plástico, transfira os vermes para um tubo de 50 mililitros e deixe os vermes assentarem com a gravidade.

Remova a mídia com uma stripette. Adicione 40 mililitros da solução de Hank e deixe os vermes assentarem Repita cinco vezes para um total de seis lavagens. Evitar a contaminação da cultura de neblina é fundamental para o sucesso deste protocolo.

A cultura de vermes deve ser mantida estéril a partir deste ponto. Passar para uma capela de fluxo laina e lavar a cultura de vermes mais seis vezes em solução estéril de Hank, suplementada com antibióticos usando uma pipeta e coletar duas amostras de 20 microlitros para contar os vermes adultos recuperados. Espera-se que aproximadamente 50% da quantidade de larvas inoculadas colete ovos no dia 14 da infecção para raspar as fezes do cólon previamente excisado com fórceps.

Em seguida, misture as fezes com carvão granulado na proporção de pelo menos um para um. Para obter uma consistência, basta barrar o suficiente para aderir a um papel. Espalhe uma camada fina no centro de um pedaço de papel de filtro úmido em uma placa de Petri e coloque-a em uma caixa à prova de luz úmida para mantê-la escura por 12 a 14 dias.

A partir do sétimo dia, comece a coletar L três larvas uma larva. Forme um anel ao redor da borda do papel de filtro. Levante o papel de filtro da placa de Petri e use uma pipeta, cinco mililitros de água estéril por placa para enxaguar as larvas que sobraram na placa.

Transfira as larvas para um tubo de 50 mililitros. Retorne o papel de filtro ao prato e substitua no escuro repita a coleta de larvas semanalmente por até um mês. As larvas coletadas são então lavadas conforme descrito no texto do protocolo e armazenadas a quatro graus Celsius em água destilada.

Para iniciar este procedimento, mergulhe os vermes em aproximadamente 10 mililitros de soluções suspensas, suplementadas com 10% de gentamicina por 20 minutos, deixando o tubo em repouso em um ângulo para garantir que os vermes estejam totalmente cobertos após 20 minutos. Lave os vermes seis vezes com as soluções de Hank, suplementadas com antibióticos, vermes Eloqua em frascos T 25 ventilados. Coloque os frascos na vertical em uma incubadora de 37 graus Celsius por três semanas, uma preparação de produtos secretores excretores ou HES dos vermes.

HES contendo cultura. A mídia é coletada de culturas em intervalos não superiores a duas vezes por semana, substituída por um volume igual de h polyus Media em cada ocasião. Mantenha cada coleção separada e claramente rotulada com a data e o número do lote devido ao maior potencial de contaminação com LPS e proteínas do hospedeiro.

A primeira colheita após 24 horas de cultura deve ser retirada de lado e processada separadamente ou descartada por centrifugadora HES contendo meios de 400 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, aspire o meio com uma seringa de 50 mililitros e passe por um filtro de ligação a proteínas de 0,2 mícron para tubos de 50 mililitros. Posteriormente, o HES Supena agrupado é concentrado sobre um filtro de corte de peso molecular de 3000 em um dispositivo de ultrafiltração sob pressão de nitrogênio para configurar o dispositivo de filtro primeiro, lave a membrana Dalton de três quilos com o lado brilhante para baixo em um copo de um litro com água destilada enquanto mexe.

Monte o dispositivo de ultrafiltração de acordo com as instruções do fabricante com a membrana do filtro com o lado brilhante para cima, coloque em um gabinete de quatro graus Celsius e passe 50 mililitros de água destilada antes de começar a concentrar o HES derramado. Tenha muito cuidado para não deixar o filtro secar. Adicione cada tubo de HES ao dispositivo de filtração conforme necessário até que o volume esteja concentrado em dois a cinco mililitros para remover aminoácidos e outros componentes do meio de cultura de tecidos.

A partir da preparação HES, adicione 50 mililitros de PBS livre de piro ao dispositivo de filtragem e, em seguida, concentre até aproximadamente dois mililitros. Repita esta etapa duas vezes. Usando um total de 150 mililitros de PBS, transfira um ES para uma seringa e filtre esterilize com um filtro de 0,2 mícron.

Depois de medir a concentração de proteínas, rotular alíquota com o número do lote e a data e congelar a 80 graus Celsius negativos. A gavagem oral de 400 L de três larvas é usada para manter o ciclo de vida do H poly gyus em camundongos F1. As cargas de vermes adultos resultantes são mostradas aqui.

Os lotes de HES têm eficácia reprodutível comprovada em ensaios funcionais e na composição proteica. Além disso, quando os sobrenadantes de cada semana sucessiva de cultura foram analisados, os perfis proteicos foram muito semelhantes por até um total de quatro semanas. Quando uma concentração de TS é medida pelo ensaio de Bradford, a proteína total é geralmente de aproximadamente um miligrama por mililitro.

O rendimento da proteína HES de 11 lotes diferentes derivados de aproximadamente 500 mililitros de sobrenadante da cultura é mostrado. Evitar a contaminação é fundamental ao coletar HES quando os níveis de contaminação por LPS em 41 lotes de HES foram medidos pelo ensaio limbus AAMI CYTE. A maioria dos lotes de HES estava significativamente abaixo do limite de contaminação recomendado.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter uma técnica estéril cuidadosa na configuração das culturas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em três a quatro horas se for realizada corretamente seguindo este procedimento. Outros métodos como proteômica, fracionamento de proteínas e análise de glicanos, lipídios e microRNAs podem ser realizados para entender completamente o espectro de produtos moleculares liberados por esses parasitas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como propagar polilimus. Moid é polius e coleta produtos DS dos vermes adultos cultivados para testar seus efeitos no sistema imunológico. Embora este parasita não seja eficaz para humanos, é importante seguir as precauções de segurança e aderir ao protocolo especificado para garantir a reprodutibilidade entre os lotes de Hess.