Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar mudanças rápidas na adesão da matriz celular em células endoteliais expostas a agentes modificadores de matriz em tempo real usando impedância de substrato celular e imagens de células vivas. Neste experimento, a enzima heme mielo peroxidase é empregada como um agente modificador de matriz fisiopatologicamente relevante. Isso é conseguido primeiro revestindo as superfícies com fibronectina para fornecer um substrato de matriz adesiva.

A micoperoxidase ou MPO pode então se ligar à fibronectina. Em seguida, as células endoteliais suspensas são assentadas nas superfícies e incubadas para atingir a máxima fixação celular e se espalhar para a fibronectina. Em seguida, as células são expostas ao peróxido de hidrogênio para iniciar a oxidação da fibronectina mediada por NPO.

As mudanças rápidas subsequentes na adesão da matriz celular são então quantificadas em tempo real usando impedância de substrato celular e análise de imagem de células vivas. Os resultados mostram que as perdas rápidas na adesão da matriz celular endotelial desencadeadas pela oxidação da fibronectina mediada por NPO podem ser quantificadas em tempo real com alta resolução temporal e de maneira livre de marcação por impedância do substrato celular e imagem de células vivas. Bem, a vantagem dessas técnicas é que elas podem quantificar mudanças na adesão da matriz celular continuamente com alta resolução temporal, e isso significa que elas podem fornecer novos insights importantes sobre como as modificações da matriz impulsionam as mudanças a jusante na morfologia celular e nos processos de sinalização dependentes da adesão.

Os protocolos são de significado mais amplo, pois podem ser prontamente adaptados substituindo MPO por outros agentes modificadores de matriz, como matriz para gating, proteases ou usando tipos de células aderentes que não sejam células endoteliais, como células epiteliais. Para começar, adicione 80 microlitros por poço de fibronectina para revestir 96 matrizes de microeletrodos de ouro para medições de impedância de substrato celular ou adicione dois mililitros de fibronectina a placas de cultura de células com fundo de vidro para análise de imagem de células vivas. Incube as matrizes e/ou as placas de cultura a 37 graus Celsius por duas horas.

Em seguida, para bloquear as superfícies, adicione 0,2% BSA e incube a 37 graus Celsius por mais duas horas. Em seguida, adicione minha peroxidase humana purificada em HBSS e incube por 30 minutos. Em seguida, use o HBSS para lavar as superfícies duas vezes para remover qualquer MPO não ligado.

Em seguida, veja 250.000 células por mililitro de células endoteliais suspensas preparadas de acordo com o protocolo de texto Em matrizes de microeletrodos de impedância de substrato de células de 96 poços com superfícies revestidas de fibronectina nativas ou com MPO. Para as placas de cultura de células com fundo de vidro de 35 milímetros, adicione dois mililitros de 500.000 células por mililitro. Imediatamente após a semeadura, as células montam as placas de matriz de microeletrodos na porta da incubadora de impedância do substrato celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

E faça leituras em branco para iniciar a aquisição contínua de dados de índice de células. Transfira as placas de cultura de células com fundo de vidro de 35 milímetros para uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 35 graus Celsius. Incubar durante duas horas para permitir a máxima fixação e disseminação celular.

Após a incubação, pause as leituras do índice celular e remova brevemente a placa de matriz de microeletrodos ou remova a placa de fundo de vidro da incubadora, aspire o snat e adicione HBSS aquecido para examinar os efeitos de inibidores, moduladores de MPO, reações catalisadas ou inibidores de sinalização celular. Adicione-os às culturas. Neste ponto, coloque imediatamente a placa de matriz de volta na porta da incubadora ou a placa de fundo de vidro na incubadora e deixe as células se equilibrarem por 30 minutos.

Para iniciar a oxidação e a adesão da fibronectina dependente de ácido hipocloroso catalisado por NPO para estudos de impedância celular, remova a placa de matriz de microeletrodos da incubadora e pause as medições do índice celular. Adicione peróxido de hidrogênio ao HBSS e misture suavemente por pipetagem repetida, remonte imediatamente na matriz de microeletrodos de volta à porta da incubadora e reinicie as leituras do índice de células para estudos de imagem de células vivas usando placas com fundo de vidro de 35 milímetros. Depois de remover o prato da incubadora, montado em um estágio aquecido a 37 graus Celsius de um microscópio confocal invertido, equipado com uma lente objetiva de água 63x.

E óptica DIC Para gravar filmes de células ao vivo, concentre-se nas células e otimize a óptica DIC de acordo com as diretrizes mencionadas aqui. Inicie o filme DIC e registre as leituras de linha de base das células não tratadas por um minuto, depois adicione peróxido de hidrogênio e misture suavemente por pipetagem repetida, refocalize o microscópio e continue gravando filmes DIC das células tratadas pelo período de tempo necessário. Para analisar os dados de impedância do substrato celular, comece exportando os dados para uma planilha para adesão da célula d.

Os estudos normalizam os dados definindo os valores registrados imediatamente antes do início da oxidação da fibronectina mediada por NPO para apresentar dados como gráficos de índice de células normalizadas versus tempo para analisar dados de imagem de células vivas. Abra os filmes de imagem de células vivas DIC gravados imediatamente antes e após o início da oxidação de fibronectina mediada por MPO em um programa de análise de imagem, como a Imagem J em pelo menos dois filmes DIC separados, selecione aleatoriamente várias células e meça sua área projetada em quadros sequenciais traçando manualmente a borda da membrana e quantificando o número de pixels fechados. Finalmente, apresente os dados como um gráfico de área celular normalizada versus tempo: a colocação de suspensões de células endoteliais em fibronectina ou fibronectina portadora de MPO resulta em fixação e disseminação celular máxima em duas horas, conforme julgado por um platô dos valores do índice celular no substrato celular.

Medições de impedância, uma vez que a adesão celular máxima é estabelecida na fibronectina nativa ou portadora de NPO, oxidação de fibronectina direcionada mediada por ácido hipocloroso catalisado por NPO e iniciada pela adição de NPOs cos substrato O peróxido de hidrogênio causa uma rápida diminuição na área de superfície do contato da matriz celular medida pela impedância do substrato celular e por imagens de células vivas, conforme mostrado aqui, a rápida adesão celular aparente nas células endoteliais ligadas à fibronectina portadora de NPO em resposta ao tratamento com peróxido de hidrogênio está ausente nas células tratadas apenas com peróxido de hidrogênio. A inibição da miosina duas funções motoras com BLEs estatina inibe a taxa de adesão da célula endotelial medida pela impedância do substrato celular e por imagem de células vivas, identificando que a adesão e contração celular em resposta à MPO catalisa a oxidação da matriz subcelular é impulsionada pelas forças de tração da miosina da OTCA. Como esses métodos podem medir com precisão mudanças muito rápidas na adesão celular, eles podem fornecer uma visão crítica sobre as relações causais entre as mudanças de adesão e as mudanças a jusante nos processos de sinalização dependentes da adesão, como fosforilação SARK ou sinalização de adesão focal, que podem ser prontamente medidas em experimentos paralelos ao longo do tempo usando Western blotting.