Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar rapidamente os requisitos genéticos para a degradação de uma proteína instável em Croce Visier. Isso é conseguido pela fusão de uma enzima repórter necessária para o crescimento sob condições seletivas específicas a uma proteína instável de interesse. Em seguida, as células selvagens ou mutantes, ambas expressando a proteína de fusão, são cultivadas em placas de ágar meio seletivo.

O ensaio de plaqueamento fornece um indicador conveniente de estabilização de proteínas com base no crescimento de células de levedura, a fim de confirmar bioquimicamente as diferenças na abundância de proteínas, enquanto o tipo de células mutantes que abrigam a proteína de fusão é lisado por meio de um método de extração de proteína rápido e ineficiente para análise de Western blot. Os resultados mostram que a abundância de uma proteína instável é aumentada em células com uma mutação em um gene necessário para a degradação. O inverso é verdadeiro para cepas de tipo selvagem competentes para degradação.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como análises de perseguição de pulso e perseguição de ciclagem de heide, é que é menos trabalhosa e demorada, permitindo a determinação rápida e de alto rendimento dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas. Embora este método possa fornecer informações sobre os requisitos de degradação para uma variedade de proteínas instáveis. Também pode ser usado para identificar reguladores de outros aspectos das expressões gênicas, como transcrição e tradução.

Demonstrando os procedimentos estarão Sheldon Watts e Justin Crowder. Alunos do meu laboratório Antes do ensaio transformam um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão que consiste em uma proteína instável e uma enzima repórter metabólica em uma cepa de levedura mutante. Suspeito de ter defeitos genéticos relativos à regulação da degradação de proteínas como controle, também transforma o mesmo plasmídeo em uma cepa de levedura do tipo selvagem.

Inocular os transformantes em cinco mililitros de meio mínimo que seleciona as células, abrigando as moléculas de plasmídeo. Coloque o tubo de ensaio em um rotador inclinado e incube durante a noite a 30 graus Celsius no dia seguinte. Meça a densidade óptica das culturas noturnas e, em seguida, equalize a concentração celular para todas as células, diluindo cada cultura para um OD 600 de 0,2 com meio fresco e tubos de centrífuga individuais estéreis de 1,5 mililitro.

Para iniciar o ensaio principal, estabeleça uma matriz de série de diluição sêxtupla transferindo primeiro 200 microlitros de cada cepa pré-diluída, começando de um OD 600 de 0,2 em poços designados na primeira coluna de uma placa estéril de 96 poços em preparação para diluições subsequentes, use uma pipeta multicanal para adicionar 125 microlitros de água estéril nos poços vazios nas colunas dois, três e quatro. Em seguida, transfira 25 microlitros de fermento da coluna um para a coluna dois, pipete para cima e para baixo algumas vezes para misturar as células uniformemente e prossiga para transferir 25 microlitros de células da coluna dois para a coluna três. Repetir os passos de diluição em série até que os alvéolos da coluna quatro estejam bem misturados como auxílio visual para a detecção de células.

Imprima um modelo de grade e cole-o no interior de uma tampa de placa de Petri, começando com a coluna menos concentrada na matriz de diluição serial. Transfira quatro microlitros de células de cada coluna. Na placa de 96 poços em uma placa de ágar médio mínimo de controle que seleciona para manutenção de plasmídeo intracelular Localize outros quatro microlitros de células de cada coluna em uma placa de ágar média mínima separada que seleciona ambos os plasmídeos intracelulares.

Manutenção e expressão da proteína de fusão instável. Deixe as duas placas secarem na bancada por cinco a 10 minutos. Sele as tampas com papel para evitar a desidratação e incube as células a 30 graus Celsius por dois a seis dias.

Quando as colônias da cultura de crescimento mais rápido se tornarem visíveis pela primeira vez no ponto mais diluído de uma determinada placa, remova a placa da incubadora e documente a extensão do crescimento. Ao tirar fotografias, pode ser necessário tirar fotografias de pratos diferentes em dias diferentes ou do mesmo prato em vários dias. No caso de diferentes cepas de levedura que exibem uma ampla gama de taxas de crescimento, tão bioquimicamente confirmadas que um gene identificado no ensaio de crescimento regula a abundância de proteínas, comece transformando cepas de levedura do tipo selvagem e mutante com um plasmídeo que codifica a proteína de fusão acima mencionada, inocule os transformantes em cinco mililitros de meio mínimo que seleciona a manutenção do plasmídeo intracelular e incube os tubos durante a noite em um rotador inclinado de 30 graus Celsius.

No dia seguinte, medir a densidade óptica a 600 de cada cultura durante a noite. Uma vez que todas as cepas tenham atingido um OD 600 de 0,4 ou superior, dilua todas as culturas de volta para 0,2 com meio fresco de modo que o volume final para cada cepa seja de 10 mililitros. Incubar as células em um agitador de plataforma de 30 graus Celsius até que todas as culturas atinjam um crescimento de fase logarítmica intermediária OD 600, entre 0,8 e 1,2.

Colha uma célula transferindo 2,5 unidades totais de OD de células para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar as células à temperatura ambiente durante cinco minutos e remover o sobrenadante S. Em seguida, adicione um mililitro de vórtice de água destilada ou pipeta para cima e para baixo para ressuspender o palato e transferir a suspensão celular para um tubo novo de 1,5 mililitro.

Isole as células com a segunda centrifugação por 30 segundos À temperatura ambiente, remova o snat e ressuspenda as células em 100 microlitros de água destilada. Adicione 100 microlitros de hidróxido de sódio 0,2 molar à suspensão celular, pipete para cima e para baixo algumas vezes para misturar e incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente Para evitar lise celular prematura. Não faça vórtice nas células.

Isolar novamente as células com uma terceira centrifugação durante 30 segundos. À temperatura ambiente, remova os sobrenadantes das células e lide as células suspendendo novamente o pellet em 50 a 100 microlitros de um tampão de amostra xlamby desnature todas as proteínas incubando a suspensão a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie todo o lisado celular em gelo por cinco minutos. Para testar a abundância de proteínas propensas à agregação, como proteínas com vários segmentos transmembranares, determinam empiricamente a incubação, a temperatura e o tempo ideais de desnaturação, começando em 70 graus Celsius por 10 minutos, em vez de 95 graus Celsius por cinco minutos.

Por fim, isolar a fracção solúvel centrifugando o lisado durante um minuto à temperatura ambiente, transferir o snat para um tubo novo e rejeitar a fracção insolúvel do sedimento. A fração solúvel agora pode ser carregada diretamente em uma página SDS, gel ou armazenada a 20 graus Celsius negativos na configuração de um ensaio de degradação de proteína baseado no crescimento de leveduras. Uma proteína de fusão tripla instável é fundida com uma enzima metabólica adicional que complementa o fundo da cepa de levedura sem o mesmo gene metabólico.

Quando a proteína de fusão é expressa em leveduras, ela é propensa a eventos de translocação estéreis na membrana do retículo endoplasmático. Essa translocação aberrante desencadeia a degradação mediada pela ubiquitina de toda a proteína, incluindo a enzima metabólica, impedindo assim a proliferação celular. No entanto, em cepas de levedura sem ubiquitina ligase, a proteína de fusão é protegida da degradação, mesmo após a translocação média, permitindo que as células proliferem.

Portanto, na presença de ubiquitina ligase, há uma correspondência entre a degradação da proteína que ocorre dentro das células e a falha das células de levedura em proliferar em placas de ágar empobrecidas com metabólitos. Por outro lado, no contexto de uma proliferação celular de ubiquitina ligase defeituosa ou ausente indica que a proteína de fusão foi protegida da degradação para reduzir o crescimento de fundo ou espúrio e aumentar o rigor deste ensaio. Inibidores competitivos da enzima metabólica podem ser adicionados ao meio de crescimento para confirmar os resultados observados no ensaio de crescimento de leveduras.

Evidências diretas de degradação da proteína de fusão também podem ser verificadas com um western blot. Na presença ou ausência de ubiquitina ligase, a proteína de fusão será degradada ou poupada da destruição, respectivamente. É importante lembrar que esses procedimentos relatam mais diretamente a abundância em estado estacionário da proteína de interesse.

Após a realização desses procedimentos, análises de pulso ou cicloheximida podem ser realizadas para analisar diretamente a cinética de degradação da proteína e a presença de mutações encontradas para aumentar os níveis de proteína do estado de estudo.