Name: Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de Cryptococcus neoformans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a depletar colesterol de macrófagos murinos usando metil beta ciclodextrina para estudar a fagocitose de Cryptococcus neoformans. Este protocolo permite investigar o papel dos esterois em infecções fúngicas in vitro.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta é Burroughs Wellcome Investigator em Doenças Infecciosas.

1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 5 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. </li><li> Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) que foi filtrado e autoclavado. </li><li> Adicionar 200 ul de solução MβCD na concentração desejada (10 mM mM ou 30 em PBS) ou 1x PBS como um controlo e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação. Remover o sobrenadante e reserva a RT para a análise quantitativa com um kit disponível comercialmente imediatamente após o procedimento. </li><li> Lavar as células duas a três vezes com PBS 1x ou DMEM isento de soro e continuar com infecção ou lisam as células por pipetting de duas a três vezes com H2O desionizada para análise com cromatografia de camada fina ou com um kit. NOTA: Após a depleção de colesterol um kit de colesterol quantificação disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Consulte a seção de materiais para obter detalhes. Siga as instruções do fabricante, conforme escrito. </li></ol> 2. Observação de Colesterol conteúdo por cromatografia em camada delgada (TLC) <ol><li> Lavar um tanque TLC duas vezes com acetona e uma vez com uma solução de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume). Saturar o tanque com o éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume) e solução deixar S / N. NOTA: Organic solventes deve sempre ser usado sob uma coifa para evitar a inalação de vapor. Luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. O ácido acético é um ácido forte e devem ser utilizados com cautela. </li><li> Em um gabinete de biossegurança estéril, semente 10 macrófagos-like 6 J774A.1 por poço em uma de 6 poços cell placa de cultura num volume de 5 ml de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4, substituindo 1 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem. </li><li> Adicionar 500 ul de Tripsina-EDTA a cada poço, incubar durante 3 min a 37 ° C, e raspe as células com um raspador de células. </li><li> Transferir para um tubo de microcentrífuga e adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. </li><li> Rodar as células durante 5 min a 300 xg e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S para a pelete de células e ressuspender cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo. </li><li> Retirar 10 ml de células e contagem de células em um hemocitômetro. Normalizar as concentrações de células a partir de cada amostra e adicionar um número igual de células para tubos de vidro. NOTA: Neste passo, um maioescolher a combinação de células a partir dos mesmos grupos de tratamento para se obter um extracto mais concentrado final de lípido. </li><li> Centrifugar células a 300 xg por 5 min a RT e remover mídia. </li><li> Adicionar 2 ml de metanol e vortex. Em seguida, adicione 1 ml de clorofórmio e vortex. Verifique o estado de fase para garantir que a solução em monofásico. NOTA: Os tubos podem ser armazenados a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo </li><li> Adicionar um adicional de 1 ml de clorofórmio, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex duas vezes durante 30 segundos. Centrifugar a 1.700 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Pesar um tubo de vidro sobre uma balança sensível e utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir a fase mais baixa no tubo de vidro de peso conhecido. </li><li> Seque-se lipídios em um evaporador centrífugo até secar (cerca de 2 horas). Pesar tubo com lípidos secos e calcular o peso seco de lípidos. NOTA: lípidos secos podem ser armazenados em -20 ° C até estar pronto para executar TLC. </li><li> Dilui-se lípidos secos em clorofórmio suficiente para normalizar a concentração de lípido (geralmente 20 - 50 ul) e 20 ul de carga do lípido diluído em uma placa de TLC de sílica. Carga de 20 ug de colesterol diluída em 20 ul de clorofórmio como um padrão. </li><li> Adicionar placa TLC seco para o tanque TLC saturado e permitir solvente migrar até 1 cm antes da borda da placa. Retire a placa de TLC de tanque e deixe-a secar cerca de 5 min. </li><li> Visualize lipídios, colocando em um tanque de vapor de iodo para verificar a migração. Remover manchas e permitir a desvanecer-se para cerca de 10 - 15 min sob o capô. NOTA: O iodo é um perigo de inalação. Utilize sempre sob uma coifa. </li><li> Prepara-se uma solução para a coloração de lípidos neutros através da combinação de 60 ml de metanol com 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, e 630 mg de cloreto de manganês. </li><li> Cuidadosa e lentamente mergulhar na placa de TLC em solução de coloração de lípidos neutros em uma bandeja e remover sem desprendendo-se a sílica layer. NOTA: A solução de coloração lípido neutro pode ser reutilizado várias vezes e por isso pode ser recuperado a partir da bandeja e colocados em um frasco de volta para uso posterior. </li><li> Permitir que a placa secar sob o capô à temperatura ambiente até que todas as bolhas desapareceu. Aquecer a placa de TLC em um conjunto de blocos de calor a 160 ° C e char para a cor desejada. NOTA: Um programa de densitometria como funciona a visão LS pode ser utilizado para quantificar as bandas carbonizados para comparar amostras de lipídios. </li></ol> 3. A infecção de macrófagos com C. neoformans (H99) <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 5 células semelhantes a macrófagos por cavidade em uma placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTA: A infecção também pode ser feito de vidro de fundo pratos confocal para imagens mais fácil; todas as quantidades permanecem as mesmas. </li><li> Crescer uma cultura de C. neoformans (H99)através da inoculação de 10 ml de YNB com uma colónia obtida a partir de uma placa atingido e incubando-O / N a 30 ° C com agitação. </li><li> Lave e contar C. neoformans (H99) células. <ol><li> Centrífuga C. neoformans cultura O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remova a mídia e descarte. Lavar as células com 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover PBS e lavar com 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este passo mais 2 vezes. </li><li> Remover PBS e ressuspender em 5 ml de PBS 1x. </li><li> Fazer uma diluição em série em PBS para obter uma diluição de 1: 500 a cultura lavada. <ol><li> Adicionar 100 ul da amostra original de 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1:10. </li><li> Adicionar 100 ul de amostra diluída a 1:10 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1: 100. </li><li> Adicionar 200 ul de 1: 100 da amostra diluída para 800 ul de 1x PBS para se obter uma mistura 1: 500 dilutiem </li></ol></li><li> Tomar 10 ul de 1: 500 de diluição e contar com hemocitómetro para calcular o número de células. </li></ol></li><li> Prepare a solução de trabalho para ativar macrófagos e opsonizantes C. neoformans. <ol><li> Diluir LPS e IFN-y 100x de soluções estoque, adicionando 10 ml para 990 mL. NOTA: LPS e IFN-y são utilizados para aumentar a absorção fagocíticas, mas não são necessárias para a fagocitose. Se houver um interesse na actividade fungicida de macrófagos, realizar activação de O / N a 37 ° C com agitação antes da infecção. </li><li> Por exemplo combinar 7,5 ul de LPS diluídas, 1,25 ul de IFNy diluída, 1,25 ul de anticorpo GXM e o volume da C. cultura neoformans que dá 1,25 x 10 5 células. Levar o volume até 250 ul multiplicado pelo número de amostras com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. </li><li> Vortex e incubar solução durante 20 min a 37 ° C com agitação. NOTA:Depleção de colesterol (passos 1,2-1,4) pode ser feita simultaneamente com o passo de opsonização. Certifique-se de tratar os macrófagos antes de se combinar a solução de trabalho, como as células opsonizadas deve ser otimamente não é mais usado do que 20 minutos após o passo 3.4.3 incubação. </li></ol></li><li> Infectam macrófagos <ol><li> Macrófagos lavar duas vezes com DMEM isento de soro e adicionar 200 mL de opsonizado C. neoformans solução de trabalho a cada poço. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fixar e corar as células <ol><li> Remova a mídia e lavar as células duas vezes com DMEM. </li><li> Secar a monocamada de células durante 10 min e adicionar 200 uL de metanol arrefecido em gelo para fixar as células. </li><li> Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e remover qualquer metanol remanescente. </li><li> Adicionar 200 ul de 10x Giemsa e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Lave 2-3 vezes com água deionizada e seco O / N com tampa off. NOTA: Imagem pode ser feito no dia seguinte ou até uma semana followicoloração ng. </li></ol></li><li> Visualize e Contagem <ol><li> Usando um microscópio, a contagem de 300 células por ponto de dados (se houver 2 do mesmo tratamento contar 150 por poço) e anote o número de macrófagos infectados e número de células Cryptococcus engoliram. NOTA: Para garantir ainda amostragem per use ponto de dados 2 placas por estado, escolher 3 áreas não sobrepostas por placa e conte 50 células por área. </li><li> Calcular o índice fagocitário multiplicando a percentagem de macrófagos infectados pelo número significativo de C. neoformans por macrófago. Normalizar o índice fagocitário, expressando os valores como uma percentagem do controlo tratado com PBS 1x. Depois de vários ensaios calcular o valor médio e o desvio padrão da média para determinar as tendências no índice de fagocitose. Use t de Student para determinar a significância. </li><li> Tome micrografias das células de 1000X ou aumento de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Ensaio de Azul de Tripano <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 6 células tipo macrófagos por cavidade em uma placa de 6 poços de cultura de células num volume de 5 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina . Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4 substituindo 2 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem. NOTA: Certifique-se de incluir um controle tratado com 1x PBS, bem como um controle que é raspado antes de qualquer tratamento. </li><li> Adicionar 500 ul de 1x PBS a cada poço e suavemente raspar as células com um raspador de células. Transferir para um tubo de microcentrífuga e suspender as células cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Retirar 10 ml de células e mancha com 1 ml de 4% Trypan azul. </li><li> Contagem de células em um hemocitômetro e calcular a viabilidade usando a seguinte equação:% de viabilidade = [1 - (células azuis / células totais)]x 100. Os valores de normalização para o controle que não foi tratado. Depois de vários ensaios calcular o valor médio eo desvio-padrão para determinar as tendências da viabilidade. Use t de Student para determinar a significância. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. Longos períodos de ...

A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo 1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos &quot;profissionais&quot; são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelipï¿½ios, que engolir o patógeno e formar um fagossoma 2. Entre as chamadas fagócitos &#39;profissionais&#39; são os macrófagos. Os macrófagos são células altamente especializadas que realizam funções de proteção que incluem procurando e eliminando os agentes que causam doenças, reparar tecidos danificados, e mediação da inflamação, a maioria dosestes através do processo de fagocitose 1,2. Cryptococcus neoformans é uma espécie de fungo patogênico que causa uma doença grave conhecida como criptococose. Esporos Cryptococcus são inaladas pelo acolhimento e resultar em uma infecção pulmonar, que é geralmente assintomática. Pensa-se que a exposição é extremamente predominante; uma amostra de 61 crianças a partir dos Infectologia Pediátrica do Hospital Clinic Center Bronx-Lebanon descobriu que todos os entrevistados tinham anticorpos para o glucuronoxylomannan polissacarídeo cryptococcal e outros estudos têm mostrado prevalência em ambos os vírus da imunodeficiência humana (HIV) não infectado e adultos infectados 3, 4. macrófagos alveolares são a primeira linha de resposta à infecção pulmonar e na maioria dos casos com sucesso claro o patógeno. No entanto, em indivíduos imunodeprimidos (pacientes por exemplo, HIV e AIDS) o fermento é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos. Nestescasos, os macrófagos podem servir como um nicho para a replicação do patógeno e pode facilitar a sua difusão para o sistema nervoso central (SNC) em que a doença se torna fatal 5-8. Pensa-se que os macrófagos podem até mesmo entregar o fermento diretamente nas meninges, ajudando a levedura de atravessar a barreira hemato-encefálica através do modelo de &quot;cavalo de Tróia&quot; 3,9 - 11. Assim, é importante compreender o processo de fagocitose e os factores que a afectam, especialmente na infecção pelo fungo. Trabalhos anteriores em outros sistemas de patógenos apontam para colesterol e lipídios jangadas formadas por colesterol como tendo um papel importante a desempenhar na fagocitose 12-15. O colesterol é as espécies mais abundantes de lípidos nas células de mamíferos e compreende 25 - 50% da membrana da célula de mamífero 16. Verificou-se que desempenham um papel na modulação da BIOPpropriedades hysical de membranas, alterando a sua rigidez 17. O colesterol e esfingolípidos em conjunto formam microdomínios lipídicos dentro da membrana conhecida como jangadas lipídicas. Jangadas lipídicas foram encontrados para ser envolvida na formação de caveolas, bem como o fornecimento de um domínio isolado para certos tipos de sinalização 16-18. Devido ao seu tamanho pequeno, é difícil estudar as jangadas lipídicas in vivo. Uma forma útil para estudar o papel de jangadas lipídicas é alterar os seus constituintes. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) é um composto que foi encontrado para esgotar o colesterol das membranas de mamíferos e é normalmente utilizado para estudar o papel das jangadas lipídicas 18. Neste protocolo, que apresentam um método para esgotar o colesterol das membranas das células hospedeiras e quantificar o efeito do esgotamento da capacidade das células hospedeiras para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimento faz uso de cultura de células techniques sobre um macrófago imortalizado como linha celular (J774A.1) como um modelo para a infecção. Depleção de colesterol foi realizada por exposição a MβCD, que tem um núcleo hidrofóbico específico para o tamanho de esteróis e é capaz de actuar como um dissipador para o colesterol desenhá-lo para fora da membrana 19. Depleção de colesterol foi medida quantitativamente usando um kit disponível comercialmente e qualitativamente utilizando uma extracção de lípidos Bligh-Dyer modificado, seguidas por cromatografia em camada fina (TLC) 20. . Fagocitose foi medida através da infecção da linha celular com uma cultura de fermento opsonizado misturado com um cocktail de interferão-γ e lipopolissacárido para activar os macrófagos Cryptococcus foi opsonizadas utilizando um anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. A coloração e microscopia de experiências permitiu a visualização de células e do cálculo do índice de fagocitose de avaliar o grau de fagocitose. Tomados em conjunto, este protocolo describes um método de base que integra a alteração da composição lipídica com um processo fisiológico.

<table><tbody><tr><td>Gabinete de Biossegurança Classe II tipo A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular J774A.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Chega congelado. Consulte as instruções do ATCC para cultura.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium Gibco</td><td></td><td>11995-065</td><td>Loja em 4 &deg; C e quente a 37 &graus; C antes de usar</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Mantenha congelado a -20 &deg; C e descongele antes de adicionar ao DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Usado para complementar a</td></tr><tr><td>incubadora de cultura de células DMEM Isotemp</td><td>Modelo Fisher Scientific</td><td></td><td># 3530</td></tr><tr><td>Prato de cultura de 96 poços</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline Fisher</td><td>Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Diluir para 1x e filtrar ou autoclave antes de usar.</td></tr><tr><td>Metil-&beta;-ciclodextrina</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolver em 1x PBS para fazer soluções de concentrações de 10 mM e 30 mM</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td> Kit de Ensaio de Colesterol <td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red</td> Life <td>Technologies Sondas Moleculares</td><td>A12216</td><td>Todos os reagentes para Ensaio de Colesterol estão contidos no kit. Siga as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Placa de ensaio preta de 96 poços</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Modelo F5</td></tr><tr><td>Câmara TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Corte no tamanho necessário para o tanque TLC</td></tr><tr><td>Exaustor</td><td></td><td></td><td>Qualquer exaustor que esteja em conformidade com os padrões AIHA/ANSI</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Modelo Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Misturador Votex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Modelo # MS104S mede até 0,1 mg</td></tr><tr><td>Pipeta Glass Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Modelo # SPD2010</td></tr><tr><td>Éter de petróleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Sílica Gel 60 com zona de concentração</td><td>Cromatografia Analítica Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Chips de iodo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de manganês</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging</td><td>System Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use o software Vision Works LS para análise de densitometria</td></tr><tr><td>Prato confocal com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtido do Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Consulte o fabricante para obter instruções de preparação. Use uma concentração de glicose de 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeo</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolva em 1x PBS para fazer estoque de 1 mg/ml. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Interferon gama</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolva em 1x PBS para fazer 0,1 mg / ml de solução estoque</td></tr><tr><td>Anticorpo glucuronoxilomanano (anti-GXM)</td><td></td><td></td> <td>Presente do laboratório de Arturo Casadevall A concentração é de 1,98 mg / ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolva 0,8 g de Giemsa em 25 ml de glicerol e aqueça a 60 &deg; C por 1 hora. Adicionar 25 ml de metanol à solução e deixar envelhecer à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 mês.</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 com AxioCam MRm para tirar imagens</td></tr></tbody></table>

macrófago colesterol exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil - ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.

Colesterol Esgotamento Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode ser calculado utiliza...

Neste artigo, é descrito um protocolo para infecção de macrófagos por Cryptococcus neoformans. Além disso, um método para depleção de esteróis dos macrófagos é explicado. Esses protocolos fornecem um guia para estudar infecções fúngicas in vitro e examinar o papel dos esteróis nessas infecções.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

O objetivo geral deste procedimento é elucidar um papel para o colesterol na captação de cryptococcus neoformans por macrófagos. Isso é realizado primeiramente esgotando o colesterol de uma linhagem celular de macrófagos murinos utilizando metil beta ciclodextrina. Em seguida, o esgotamento de colesterol é confirmado e quantificado por meio de cromatografia em camada delgada e um kit comercialmente disponível.Em seguida, as células de Cryptococcus neoformans são ionizadas com anticorpos específicos para o componente gluc, xlo manina ou GXMA da cápsula de Cryptococcus. Por fim, os macrófagos com colesterol reduzido são infectados com Cryptococcus neoformans opsonizado. Em última análise, a microscopia de manutenção de gemas e a microscopia de luz são utilizadas para visualizar as células infectadas e permitir o cálculo do grau de fagocitose.As principais vantagens desta técnica são que ela pode ser realizada com equipamentos básicos de laboratório em um tempo relativamente curto e ainda assim obter resultados quantitativos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da patogênese fúngica. Por exemplo, qual é o papel dos enxertos lipídicos do hospedeiro na ótica dos patógenos fúngicos?A implicação dessa técnica estende-se à terapia ou à prevenção da infecção por *Coccidioides*, pois a internalização dentro de macrófagos é uma etapa crítica para o início de causas graves. Embora esses métodos possam fornecer informações sobre a infectividade de patógenos fúngicos, eles também podem ser aplicados a outros organismos, como em patógenos intracelulares obrigatórios. Em uma cabine de segurança biológica estéril, semear 10⁵ células semelhantes a macrófagos J774A.1 por poço de uma placa de cultura de 96 poços. Em 200 microlitros de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (PS), incubá-las durante a noite a 37 °C e 5% CO₂. No dia seguinte.Remova o meio da monocamada de células e use PBS filtrado ou autoclavado para lavar as células duas vezes. Adicione 200 microlitros de metil beta ciclodextrina ou solução de embeta CD na concentração desejada ou um XPBS como controle e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação. Remova o sobrenadante e reserve-o em temperatura ambiente para análise quantitativa com um kit comercialmente disponível.Imediatamente após este procedimento com PBS ou DMEM sem soro, lave as células duas a três vezes antes de realizar a quantificação de colesterol ou prosseguir para a infecção. Proceda para infectar os macrófagos com colesterol reduzido em uma cabine de segurança biológica estéril. Semente de 10 à quinta potência de células semelhantes a macrófagos por poço.Em uma placa de 96 poços, incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ ao mesmo tempo. Cultivar uma cultura de C. neoformans H99 isolando uma colônia de uma placa estriada e inoculando 10 mililitros de YNB; incubar durante a noite a 30 graus Celsius com agitação no dia seguinte. Centrifugar a cultura de C. neoformans a 1.700 × g e 4 graus Celsius por 10 minutos.Remova o sobrenadante e adicione cinco mililitros de um XPBS antes de centrifugar novamente. Em seguida, use um XPBS filtrado para lavar as células mais três vezes antes de ressuspender as células em cinco mililitros de um XPBS. A seguir, para preparar uma diluição seriada do cultivo lavado, adicione 100 microlitros da amostra original a 900 microlitros de um XPBS.Para obter uma diluição de um para 10, adicione 100 microlitros da amostra diluída um para 10 a 900 microlitros de PBS 1X para obter uma diluição de um para 100. E, finalmente, adicione 200 microlitros da amostra diluída um para 100 a 800 microlitros de PBS 1X. Para obter uma diluição de um para 500, adicione 10 microlitros da diluição final a um hemocitômetro e conte para calcular o número de células necessário para preparar uma solução de trabalho para ativar macrófagos e opsonizar C. neoformans. Dilua o LPS e o interferon gama 100 vezes a partir das soluções estoque diluindo 10 microlitros de cada composto em 990 microlitros de PBS. Para cada amostra, combine 7,5 microlitros de LPS, 1,25 microlitros de interferon gama, 1,25 microlitros de anticorpo GXM e 1,25 vezes 10 à quinta.Veja as células de neo forman, então usando DMEM suplementado com FBS e Ps, complete o volume até 250 microlitros por amostra. Vortexe a solução e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius com agitação antes de infectar os macrófagos. A depleção de colesterol pode ser realizada após a depleção de colesterol. Use DMEM sem soro para lavá-los duas vezes antes de adicionar 200 microlitros da solução de trabalho de C. neoformans opsonizada a cada um.Incubar bem por duas horas a 37 graus Celsius. Em seguida, fixar e corar as células. Após lavar as células duas vezes com DMEM e secar ao ar a monocamada celular por 10 minutos, adicionar 200 microlitros de fixador de metanol gelado por 15 minutos à temperatura ambiente antes de remover todo o metanol remanescente.Em seguida, adicione 200 microlitros de 10 x giza e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois, use água desionizada para lavar duas ou três vezes, deixe a tampa aberta e seque durante a noite no dia seguinte ou até uma semana depois sob um microscópio. Conte 300 células por ponto de dados e anote o número de macrófagos infectados e o número de células de cryptococcus fagocitadas.Calcule o índice ácido de PHA multiplicando a porcentagem de macrófagos infectados pelo número médio de C neoformans por macrófago. Normalize o índice ácido F expressando os valores como uma porcentagem do controle tratado com XPBS. Após várias tentativas, calcule o valor médio e o desvio padrão da média para determinar as tendências no índice ácido F.Utilize o teste t de Student para determinar a significância, conforme mostrado aqui. A análise do sobrenadante reservado de células tratadas com M beta CD revelou colesterol elevado em comparação com o sobrenadante isolado de células controle tratadas com PBS, indicando um nível mais alto de esgotamento de colesterol nas células tratadas com M beta CD. O esgotamento pode ser calculado usando os valores de colesterol obtidos a partir do sobrenadante e do lisado celular, conforme ilustrado aqui, para apoiar os resultados de esgotamento de colesterol.O lisado celular analisado por meio de cromatografia em camada delgada (TLC) mostra uma diminuição acentuada na coloração do colesterol em células tratadas com concentrações crescentes de M beta CD citometria. A análise da TLC revela uma tendência semelhante ao ensaio quantitativo após infecção; as células permanecem aderidas e intactas, e a morfologia celular permanece inalterada nas células infectadas por neoformans em comparação com as células controle não tratadas. Micrografias de células infectadas de forma ideal mostram claramente c neoformans englobado dentro das células de mamíferos.Este gráfico demonstra que, quando calculado a partir de 300 células de macrófagos por grupo de tratamento, foi observada uma redução no índice F ácido em células com colesterol esgotado. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente cinco horas, não incluindo os tempos de incubação que devem ser feitos durante a noite após este procedimento. Outros métodos, como a extração de membranas resistentes a detergentes dos macrófagos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se o esgotamento de colesterol está reduzindo a internalização de *Cryptococcus* por meio da alteração dos enxertos lipídicos do hospedeiro após seu desenvolvimento.Essas técnicas abrem caminho para que pesquisadores na área de biologia de membranas e imunologia compreendam os mecanismos da fagocitose por meio das interações entre macrófagos e patógenos em fungos patogênicos. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar...

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de citotoxicidade para avaliar a infecção por Cryptococcus neoformans, um fungo patogênico, em macrófagos. A citotoxicidade é determinada pela liberação da enzima lactato desidrogenase citoplasmática devido à lise de macrófagos causada pela infecção por Cryptococcus neoformans.

Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase para detectar a infecção por Cryptococcus neoformans em macrófagos

Este vídeo mostra um método para avaliar o impacto da aspirina e do ibuprofeno, em suas concentrações inibitórias mínimas, na fagocitose de macrófagos usando células fúngicas coradas com corante fluorescente sensível ao pH. As drogas inibem a ciclooxigenase-2, diminuindo a formação de prostaglandinas e aumentando a fagocitose de macrófagos, conforme observado por meio de medições de fluorescência de corantes sensíveis ao pH.

O efeito da aspirina e do ibuprofeno na capacidade fagocítica dos macrófagos

Descrevemos métodos para live-célula vídeo de...

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Nós descrevemos como visualizar macrófago C. neoformans (Cn) interações em tempo real, com especial ênfase para o processo de exocitose não-lítica usando microscopia de luz digital. Usando esta técnica individualmente macrófagos infectados podem ser estudados para determinar os vários aspectos deste fenómeno.

A visualização não-lítica exocitose de Cryptococcus neoformans De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Descrevemos um método para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao centro celular em células vivas infectadas com ou sem o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1, usando microscopia de fluorescência confocal de disco giratório para identificar células infectadas fluorescentes e microscopia de campo claro para detectar fagossomos.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Apresentado aqui é um protocolo para quantificar e produzir imagens dinâmicas de células-tronco mesenquimais (MSC) regulação mediada de fagocitose macrófago (MΦ) de partículas de levedura não opssonizada (zymosan) que são conjugadas a uma molécula fluorescente sensível ao pH.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Aprenda a depletar colesterol de macrófagos murinos usando metil beta ciclodextrina para estudar a fagocitose de Cryptococcus neoformans. Este protocolo permite investigar o papel dos esterois em infecções fúngicas in vitro.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de

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