Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

O objetivo geral deste procedimento é elucidar os perfis de expressão proteica de tumores líquidos e sólidos. Isso é feito primeiro enriquecendo as células cancerígenas a partir de amostras de sangue ou tecido derivadas de pacientes. Na segunda etapa, as proteínas são isoladas das células cancerígenas e, em seguida, misturadas com um padrão de quantificação de susac específico do tumor.

Na etapa final, a mistura de proteínas é digerida. Em última análise, a espectrometria de massa é usada para mostrar os perfis de expressão de proteínas de tumores líquidos e sólidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oncologia e patologia, como como os alvos de drogas e os mecanismos de resistência à terapia podem ser identificados?

Embora esse método possa fornecer informações sobre a descoberta de biomarcadores, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a investigação de cânceres diversos, sólidos e líquidos. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Hannibal Berger Institute for Pathology e o Dr. Christophe Lanz do meu laboratório Para preparar células tumorais líquidas para triagem fluorescente por citometria de fluxo, comece citando um mililitro da amostra de célula mononuclear humana suspensa em PBS mais 2% FBS para o controle negativo e um mililitro para cada corante fluorescente usado na coloração final. Em seguida, incubar as células com os anticorpos apropriados para isolar a população de células leucêmicas e para os controles de compensação no gelo.

Após 30 minutos, lave as células duas vezes com PBS mais 2%FCS. Em seguida, adicione uma coloração de viabilidade celular aos tubos apropriados e classifique as células de acordo com o esquema. Coleta das amostras em IMDM mais 10%FCS para coleta de tumores sólidos por microdissecção de captura a laser.

Primeiro, use um micrótomo para cortar seções de cinco a 10 micrômetros de espessura de amostras embebidas em parafina fixada com forma. Em seguida, monte as seções em lâminas de membrana cobertas com filme e seque as amostras a 37 graus Celsius após uma hora. Analisar e reidratar as secções por incubações sucessivas de um minuto em etanol absoluto de xileno, etanol a 70% e água.

Em seguida, core as seções com hematina por 20 segundos. Enxágue-os com água da torneira e colete as células de interesse com o sistema de microdissecção por captura a laser para extrair proteínas das células tumorais líquidas classificadas. Gire a amostra três vezes, lavando as células em 500 microlitros de PBS frio durante as duas segundas centrifugações.

Em seguida, incube as células em 40 microlitros de tampão de lise por um vezes 10 elevado às seis células. Após 15 minutos, centrifugue o lisado e transfira o lisado claro contendo sobrenadante para um novo tubo de reação para extrair a proteína das células tumorais sólidas microdissecadas. Incube a amostra de tecido com 60 microlitros de tampão de lise tecidual a 72 graus Celsius.

Após 15 minutos, recolher o líquido por centrifugação curta e transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção. Em seguida, sonicar o lisado em gelo por três minutos, seguido de uma incubação com 15 microlitros que possuem sulfato ESAL de sódio a 20% a 99 graus Celsius em um bloco de aquecimento com 600 RPM de agitação. Após uma hora, gire o lisado e transfira o S natin para um novo tubo.

Em seguida, determine as concentrações de proteínas do padrão celular e super SLAC limpo e, em seguida, misture quantidades iguais de pedaços de células tumorais com o padrão super SLAC, seguido de lítio. Faça o tampão de sulfato dessalinizador a 25% do volume da amostra e o agente redutor a 10% do volume da amostra. Em seguida, aqueça a solução resultante em um bloco de aquecimento por 10 minutos a 72 graus Celsius.

Para medir a concentração proteica do lisado de tumor sólido em um leitor de placas, misture uma série padrão de soluções de diluição de albumina de soro bovino, o lisado e o padrão super SLAC apropriado com um ensaio de proteína disponível comercialmente e uma placa de 96 poços. Após um minuto de agitação, incubar a amostra durante o período de tempo adequado e medir a absorvância de acordo com as indicações do fabricante. Em seguida, misture quantidades iguais de lisado clarificado e o padrão super SLAC com 200 microlitros de uréia em uma unidade de filtro e centrifugue as amostras por 30 minutos.

Analisar os lisados de células tumorais por cromatografia líquida e análise espectrométrica de massas. Comece resolvendo os peptídeos de interesse em 30 microlitros de tampão de carregamento por cinco minutos em um banho de sonicação. Em seguida, gire a proteína e transfira o sobrenadante transparente para um frasco de amostrador automático de espectrometria de massa.

Em seguida, injete cinco microlitros de amostra por análise no nano lc, ms ms system autos, amostrador e concentre e dessalinize os peptídeos on-line em uma configuração de coluna pré-montada e ventilada de fase C 18 invertida. Finalmente, separe os peptídeos em uma micro coluna de fase C 18 invertida em uma coluna de pulverização nanos individualizada. Usando um gradiente de 90 minutos de cinco a 35% de acetil nitrilo versus 0,1% de ácido fórmico aquoso a 300 nanolitros por minuto, use uma fonte de íons de nano spray para transferir e analisar os peptídeos.

Usando um método de aquisição dependente de dados dos 15 principais, diferentes tipos de espectrômetros de massa podem ser usados para analisar os peptídeos. O perfil proteômico de tumores líquidos e sólidos de pacientes é uma abordagem promissora para a descoberta de novos biomarcadores diagnósticos e preditivos. Por exemplo, esta primeira figura demonstra uma estratégia de gating exemplar para isolar as colorações de CD one 17, células leucêmicas de uma amostra líquida de tumor.

Considerando que aqui, uma seção de cinco a 10 micrômetros de espessura montada em lâminas de membrana cobertas por filme, como acabamos de demonstrar. Conforme mostrado, uma região de interesse foi então selecionada manualmente e excisada por microdissecção de captura a laser, a análise de agrupamento não supervisionada dos perfis de expressão de proteínas de amostras de tumores líquidos e sólidos pode então ser realizada por espectrometria de massa, permitindo a separação clara das diferentes entidades tumorais de acordo com seus perfis distintos de expressão de proteínas. Esses dados podem, então, contribuir para o estabelecimento de biomarcadores clinicamente relevantes.

A implementação de estratégias de enriquecimento para modificações pós-traducionais, como fosforilação ou ventilação UIC, também pode ser realizada para responder a perguntas adicionais, como: como os padrões de quinase desregulada podem ser identificados após seu desenvolvimento? Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da patologia e oncologia explorarem os biomarcadores específicos e as vias de sinalização em uma variedade de entidades cancerígenas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar proteínas de cânceres como subpopulações para analisar seus padrões de expressão de proteínas e estados de sinalização por espectrometria de massa.