Name: Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a criar lesão vascular mecânica em embriões de zebrafish para estudar hemostasia e reparo tecidual. Este método permite visualização em tempo real por microscopia de fluorescência.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Stephen Wilson e Lisa Wilsbacher pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH HL054737.

NOTA: Os procedimentos que utilizam peixe-zebra foram aprovados pelo Institutional Animal Care da UCSF e Comitê de Uso. 1. Preparação de Ferramentas <ol><li> Insira pin minúcia em um suporte de pino e prenda o pino. </li><li> Utilizando uma pinça de ponta fina, dobre com cuidado a ponta do pino para criar um ligeiro gancho. </li><li> Para manipulação e estabilização do embrião durante a lesão, dobre a extremidade de um calibre 28 ½ polegadas agulha montada em uma seringa de insulina usando alicates. </li></ol> 2. Preparação de embriões Zebrafish por lesão <ol><li> Configure casais reprodutores de peixes-zebra e recolher os ovos em água ovo (60ug / sais aquário ml) como mostrado anteriormente 22. </li><li> Adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água de ovos quando os embriões são aproximadamente 8 horas pós-fertilização (hpf) para impedir que a melanização. </li><li> Dechorionate dois dia após a fertilização (DPF) embriões antes da experiência com a pinça de ponta fina. <br/&gt; NOTA: Os embriões podem ser ferido a qualquer momento após a circulação começa. Os dados aqui apresentados são para 2 dpf embriões, mas a técnica foi aplicada com sucesso em embriões de até 5 dpf. </li><li> Anestesiar os embriões com 0,02% tamponado com ácido 3-aminobenzóico (tricaina) aproximadamente 10 min antes de manipulações. </li></ol> 3. Vessel Mecânica Lesão de Embriões <ol><li> Transferência de embriões anestesiados para uma lâmina de depressão em um microscópio estereoscópico de dissecação usando uma pipeta de transferência. </li><li> Usando o lado curto plana da agulha da seringa para manipular o embrião com a mão dominante, posicionar o embrião de lado, com a superfície ventral virada para fora da agulha. </li><li> Posicionar o pino minúcia com a ponta virada directamente contra a superfície ventral do peixe para a posterior abertura urogenital. Posicionar o pino minúcia com um ligeiro ângulo de tal modo que a ponta curvada é capaz de perfurar o periderme directamente na veia caudal (Figura 1 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Usando a agulha da seringa para manipular o embrião, perfurar a veia caudal com o pino de minúcia tocando no embrião para o pino de gancho ligeiramente o pino para dentro da veia. </li><li> Usando a agulha da seringa, puxe o embrião para longe do pino de minúcia para criar um pequeno rasgo no recipiente. NOTA: A lesão de sucesso vai resultar em sangramento imediato a partir da veia. </li></ol> 4. Análise da hemostasia <ol><li> Escolha apenas os embriões com visivelmente células circulantes no sangue para este procedimento. </li><li> Prepare-se para iniciar o temporizador assim que o pino de minúcia é puxado a partir do vaso. </li><li> Inicie o cronometro logo que a perda de sangue pode ser visualizado a partir da ferida. Quando a perda de sangue da ferida cessa, parar o temporizador e registrar o tempo total, como o tempo de sangramento. Se a coagulação é inibida, o tempo para gravar quando não há mais visivelmente células circulantes no sangue. </li></ol> 5. Análise da cicatrização de feridas <ol><li> Transferência posanimais t-lesão em placas de imagem com fundo de vidro para microscopia. </li><li> Remover a maior parte da água do ovo. </li><li> Cubra os embriões em 0,3-1,2% baixo ponto de fusão agarose dissolvidos na água do ovo, aquecido a entre 42 e 45 ºC e suplementadas com 0,02% tricaina. </li><li> Embriões posição sobre os seus lados, usando uma pinça. </li><li> Após a agarose esfria, encher o prato com 0,02% tricaina em água ovo. </li><li> Adquirir imagens usando brightfield, epifluorescência, ou microscopia confocal. </li><li> Remover embrião do agarose usando uma pinça e transferência de volta para a água ovo. </li></ol>

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<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Zebrafish têm sido utilizados com sucesso como um modelo para vários tipos de feridas, incluindo lesão de laser 13-15, trombose induzida por laser 16, e epitelial ferindo 10. Relata-se um método de ferimento mecânico que é simples de executar e produz uma lesão controlada num modelo in vivo, que é altamente favorável à microscopia em tempo real. Resultados da lesão em um resposta hemostática rápida e mensurável e um programa de reparação ferida reprodutível que pode ser...

O peixe-zebra tem sido usado extensivamente para estudar uma variedade de tópicos em biologia vascular, incluindo desenvolvimento vascular, angiogênese e desenvolvimento e patologia hematopoiética1-3. Os embriões desenvolvem uma circulação funcional, bem como leucócitos e outros componentes do sistema imunológico inato até 1 dia após a fertilização (dpf) 1,4,5. A conservação da resposta inflamatória e leucocitária à lesão tornou o embrião de peixe-zebra um modelo informativo para processos inflamatórios tão diversos como infecção tuberculosa, enterocolite e regeneração tecidual6-9. Embriões de peixe-zebra têm sido usados para estudar a inflamação relacionada à lesão, particularmente no contexto de ferimento epitelial e resposta de neutrófilos10,11. A lesão do embrião resulta em uma resposta celular altamente conservada das células no local da lesão e das células imunes inatas recrutadas para responder à lesão e regular sua resolução11,12. Outros modelos de lesão usaram pulsos de laser focalizados para localizar espacialmente a lesão em tipos específicos de células, incluindo neurônios, células musculares e cardiomiócitos13-15. 
Embriões de peixe-zebra têm sido utilizados como modelo para estudar hemostasia e trombose em condições de manipulação farmacológica e genética, utilizando tanto a formação de trombos mecânicos quanto os induzidos porlaser16-19. Os componentes da cascata de coagulação parecem estar bem conservados e os transgênicos têm permitido estudos detalhados da deposição de trombócitos e fibrina no local da coagulação17,20,21. O procedimento apresentado neste artigo complementa esses métodos, fornecendo um sistema para estudar a lesão mecânica do vaso, resultando em ruptura do vaso, formação e resolução de trombos e reparo do vaso.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Diâmetro da ponta 0.0125 mm, diâmetro da haste 0.1 mm</td></tr><tr><td>Suporte de pino</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Slide de Depressão de Vidro</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Baixo Derretimento Agarose</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>Pré-aquecido a 42 &ordm; C</td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>ácido 3-aminobenzóico (tricaína)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Placas de imagem com fundo de vidro</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td> Microscópio de fluorescência <td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Sais de aquário Seringa</td> de insulina <td>instantânea para o oceano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com agulha de 28,5 G</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

lesão vessel mecânica em embriões zebrafish

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Embriões de peixe-zebra (Danio rerio) provaram ser um modelo poderoso para estudar uma variedade de processos de desenvolvimento e doenças. O desenvolvimento externo e a transparência óptica tornam esses embriões especialmente passíveis de microscopia, e numerosas linhagens transgênicas que rotulam tipos específicos de células com proteínas fluorescentes estão disponíveis, tornando o embrião de peixe-zebra um sistema ideal para visualizar a interação de vasculares, hematopoiéticas e outros tipos de células durante a lesão e reparo in vivo. A genética direta e reversa no peixe-zebra está bem desenvolvida e a manipulação farmacológica é possível. Descrevemos um modelo de lesão vascular mecânica usando técnicas de micromanipulação que explora várias dessas características para estudar as respostas à lesão vascular, incluindo hemostasia e reparo de vasos sanguíneos. Usando uma combinação de microscopia de vídeo e timelapse, demonstramos que esse método de lesão vascular resulta em respostas mensuráveis e reprodutíveis durante a hemostasia e o reparo da ferida. Este método fornece um sistema para estudar lesões vasculares e reparos em detalhes em um modelo animal inteiro.

A lesão mecânica vaso foi realizada em 2 dpf embriões (Figura 2A - C). Resultados da lesão em um resposta rápida e confiável de coagulação medida pelo tempo de interrupção do sangramento (Figura 2D). Para determinar se ou não diferenças na resposta de coagulação pode ser medido, o anticoagulante hirudina foi administrada aos embriões por injecção para dentro da conduta de Cuvier imediatamente antes do ferimento (5-10 nl de 1 unidade por ul de hirudina dissolvidos em águ...

Este artigo descreve um método para criar uma lesão mecânica do vaso em embriões de peixe-zebra. Este modelo de lesão fornece uma plataforma para estudar hemostasia, inflamação relacionada a lesões e cicatrização de feridas em um organismo ideal para microscopia em tempo real.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é criar uma lesão mecânica no vaso sanguíneo de embriões de peixe-zebra. Isso é conseguido perfurando a veia coddle do embrião de peixe-zebra utilizando um pino de minutia. Em seguida, a hemostasia é avaliada medindo o tempo durante o qual o sangue flui ativamente a partir do ferimento.Em seguida, é realizada microscopia com lapso de tempo para visualizar aspectos da cicatrização de feridas, como o reparo vascular. Os resultados mostram que a lesão mecânica de vasos em embriões de peixe-zebra pode ser usada para medir de forma reprodutível aspectos da hemostasia e do reparo de feridas, tais como o tempo de sangramento e o tempo necessário para restabelecer o fluxo sanguíneo. A principal vantagem desta técnica em relação aos modelos de lesão padrão em camundongos e outros é que, no embrião de peixe-zebra, a inflamação, a hemostasia e o reparo podem ser facilmente visualizados por meio de microscopia em tempo real.Para começar, insira um pino de minúcia em um suporte de pino e fixe o pino usando pinças finas. Dobre cuidadosamente a ponta do pino para criar um pequeno gancho, utilizado para manipular e estabilizar o embrião durante a lesão. Use alicate de bico para dobrar a extremidade de uma agulha de calibre 28, com meia polegada de comprimento, montada em uma seringa de insulina.Em seguida, prepare embriões de peixe-zebra montando pares reprodutores e coletando ovos em água para ovos, conforme mostrado anteriormente. Quando os embriões atingirem de oito a 24 horas pós-fertilização ou HPF, adicione PTU à água dos ovos para prevenir a melanização aos dois dias pós-fertilização ou DPF. Use pinças finas para desencapsular os embriões e anestesie os embriões utilizando uma concentração final de 0,02% de trica tamponada para provocar lesão mecânica nos vasos sanguíneos embrionários.Use uma pipeta de transferência para colocar embriões anestesiados sobre uma lâmina com depressão. Apoiado em um microscópio estereoscópico, com a mão dominante segurando o lado curto e plano da agulha da seringa, posicione o embrião de lado, com a superfície ventral voltada para longe da agulha. Em seguida, posicione o alfinete fino com a ponta direcionada diretamente contra a superfície ventral do peixe, posterior à abertura urogenital.Mantenha-o em um ângulo ligeiramente inclinado para que a ponta curva consiga perfurar o periderma diretamente na veia coddle. Em seguida, utilize a agulha da seringa para manipular o embrião. Use o pino de minutia para perfurar a veia coddle, empurrando levemente o embrião contra o pino para enganchar sutilmente o pino na veia com a ajuda da agulha da seringa.Puxe o embrião para longe do alfinete de minutia para criar um pequeno rasgo no vaso. Um ferimento bem-sucedido resultará em sangramento imediato da veia. Para este procedimento, escolha apenas embriões com células sanguíneas visivelmente em circulação.Com o pino de minutia no lugar, puxe-o do vaso e, assim que a perda de sangue puder ser visualizada no local da lesão, inicie um cronômetro. Quando a perda de sangue cessar, pare o cronômetro e registre o tempo total como tempo de sangramento; se a coagulação estiver inibida, registre o tempo em que não houver mais células circulantes visíveis. Transfira os animais pós-lesão para placas de imagem com fundo de vidro para microscopia e remova a maior parte da água dos ovos, então com 0,3 a 1,2% de agarose de baixo ponto de fusão suplementada com 0,02% de trica e aquecida entre 42 e 45 graus Celsius. Cubra os embriões.Use pin&ccedil;as para posicionar os embri&otilde;es de lado. Ap&oacute;s o resfriamento do aro, preencha a placa com trica 0,02% em &aacute;gua de ovo. Use microscopia de epifluoresc&ecirc;ncia em campo claro ou microscopia confocal para adquirir imagens ap&oacute;s a aquisi&ccedil;&atilde;o de imagens.Use uma pin&ccedil;a para transferir os embri&otilde;es de volta para a &aacute;gua de ovo. Este v&iacute;deo mostra uma les&atilde;o mec&acirc;nica do vaso realizada em um embri&atilde;o PF 2D. Pode-se observar perda ativa de sangue, seguida pela cess&atilde;o do sangramento; a les&atilde;o resulta em uma resposta de coagula&ccedil;&atilde;o r&aacute;pida e confi&aacute;vel, medida pelo tempo at&eacute; a cess&atilde;o do sangramento, para determinar se diferencas na resposta de coagula&ccedil;&atilde;o poderiam ser medidas.O anticoagulante odin foi administrado aos embriões por injeção no ducto de QVA imediatamente antes da lesão. Como mostrado aqui, a droga aumentou significativamente os tempos de sangramento em comparação com o controle veicular. Neste vídeo, evidências de dano vascular e coagulação podem ser observadas imediatamente após a lesão, utilizando linhagens transgênicas para marcadores endoteliais e de hemácias.As imagens foram adquiridas a cada cinco minutos durante um período de 12 horas, mostrando as diferentes fases da reparação da ferida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como provocar uma lesão mecânica em embriões de peixe-zebra.

mechanical-vessel-injury-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento. O implante de contas é uma técnica valiosa de manipulação de tecidos que pode ser usada para interrogar os mecanismos de desenvolvimento, introduzindo alterações nos ambientes celulares locais. Este protocolo descreve como realizar a implantação de microesferas no embrião de peixe-zebra.

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O objetivo deste protocolo é detalhar um novo método para a avaliação da função cardíaca segmental em zebrafish embrionário sem condições fisiológicas e patológicas.

Análise de deslocamento da Deformação Mecânica Miocárdica (DIAMANTE) revela heterogeneidade segmental da função cardíaca em zebrafish embrionário

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Este protocolo descreve um método para enxertar um cordão magnético no coração do peixe-zebra em desenvolvimento por meio de microcirurgia, permitindo a manipulação de forças mecânicas in vivo e desencadeando o influxo de cálcio dependente de estímulo mecânico nas células endocárdicas.

Manipulando forças mecânicas no coração do peixe-zebra em desenvolvimento usando contas magnéticas

Este protocolo descreve um método de microscopia de luz de baixo custo para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra, permitindo a avaliação reprodutível da cardiotoxicidade do desenvolvimento sem a necessidade de sistemas avançados de imagem.

Imagem cardíaca funcional em embriões de peixe-zebra usando microscopia padrão e análise de vídeo: aplicações em pesquisa ambiental e biomédica

Aprenda a criar lesão vascular mecânica em embriões de zebrafish para estudar hemostasia e reparo tecidual. Este método permite visualização em tempo real por microscopia de fluorescência.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

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