Validação de nanocorpo e Antibody Based In Vivo Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando Ex Vivo Citometria de fluxo e microscopia

O objetivo geral deste procedimento é realizar a validação ex vivo de experimentos de imagem de xenoenxerto de fluorescência no infravermelho próximo in vivo em camundongos usando nanocorpos marcados com Fluor quatro ou anticorpos convencionais. Isso é feito administrando primeiro o flúor infravermelho próximo, quatro anticorpos específicos de antígeno marcados e anticorpos convencionais a camundongos com xenoenxertos positivos e negativos para antígenos. O segundo passo é realizar imagens in vivo.

Após a imagem, os camundongos são sacrificados para remover os xenoenxertos, que são processados para análises ex vivo. Em última análise, a citometria de fluxo ex vivo e a microscopia de fluorescência são usadas para validar os resultados de imagem in vivo. A vantagem desse método sobre os métodos existentes, como imagens nucleares, é que o uso de um corante fluorescente infravermelho próximo permite uma comparação abrangente de imagens multimodalidades in vitro, in vivo e ex vivo com uma única sonda para citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e imagens de fluorescência no infravermelho próximo.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imagem tumoral, como localizar metástases durante a cirurgia e monitorar a eficiência das terapias antitumorais. A marcação de anticorpos com força fluorada permite a quantificação ex vivo exata de anticorpos ligados a células. Isso nos permite distinguir se singles específicos que vemos in vivo são devidos a anticorpos, ligados a antígenos de superfície celular, ou inespecíficos devido ao chamado efeito de permeabilidade e retenção aprimorados.

Sete a nove dias após a injeção das células tumorais, os tumores deveriam ter cerca de oito milímetros de diâmetro. Preparado para obter imagens dos camundongos primeiro, aplique pomada oftálmica e inicialize o sistema de imagem. Em seguida, posicione os camundongos anestesiados no estágio aquecido com seus tumores direcionados para a câmera.

Mantenha um a 2% de flúor ISO durante o procedimento de imagem usando o coletor de flúor isof alojado na câmara de imagem. Monitore as taxas de respiração. Se algum for muito rápido, a anestesia é muito leve e, se for lenta ou irregular, a anestesia é muito profunda.

Em seguida, imagine os mouses depois de obter a imagem de linha de base. Injete nos camundongos 50 microgramas de LOR seis construções de anticorpos marcadas com 80. Faça isso em um volume de 200 microlitros de solução salina na veia da cauda.

Após a imagem, eutanasiar o mouse e montá-lo em um bloco de isopor e limpá-lo com 70% de etanol. Em seguida, abra a pele para expor os tumores. Remova os tumores com um bisturi e mantenha os tumores intactos.

Uma vez removidos, corte os tumores ao meio e transfira a outra metade para um prato de solução P-B-S-A-E-B-S-F no ICE para análise por fax e transfira a outra metade para duas vezes fria, 4% PFA para imuno-histoquímica. Após 24 horas em fixador a quatro graus Celsius, transfira os tumores para PBS com 30% de sacarose e mantenha-os a quatro graus Celsius até que afundem totalmente na solução. Em seguida, corte os tumores em pedaços que se encaixem em moldes criogênicos.

Preencha os moldes com composto OCT e transfira os pedaços de tumor para os moldes. O tecido deve ser totalmente imerso em OCT. Em seguida, transfira os moldes criogênicos para gelo seco e, quando estiverem completamente congelados, armazene-os a menos 80 graus Celsius até que possam ser processados.

Para preparar as células, transfira a metade do tumor para uma célula, peneira na peneira. Corte-o em três a quatro pedaços e, em seguida, retire o êmbolo de uma seringa de dois mililitros e use o êmbolo para esmagar o tecido contra a peneira. Recolha a solução que flui através do filtro Depois que os tecidos forem amassados, lave o filtro com PBS.

Em seguida, transfira a suspensão recolhida para um novo tubo e gire-a a 500 G durante cinco minutos. Suspendemos o pellet celular em 10 mililitros de PBS com 0,2% BSA. Em seguida, conte as células alíquota de um a 5 milhões de células de linfoma para um tubo de fax de cinco mililitros, gire o tubo para baixo a 500 G e descarte o sobrenadante.

Em seguida, suspenda as células em 100 microlitros de PBS com 0,2% BSA. Neste ponto, é possível bloquear o FCR usando um anticorpo para se ligar ao FC gamma R. Aguarde 10 minutos e lave as células uma vez com PBS com 0,2% BSA. Agora adicione um anticorpo monoclonal anti CD 45 para identificar os leucócitos.

Incube as células por 20 minutos no escuro com este anticorpo e, em seguida, use duas lavagens para removê-lo antes da análise por fax. Manchar as células com iodeto de propídio durante 15 minutos em gelo para identificar as células mortas. Em seguida, lave-os com PBS simples.

Em seguida, Resus suspendendo as células em 150 microlitros de PBS e proceda aos fatos. Os camundongos foram injetados com 50 microgramas de nanocorpo e anticorpo monoclonal para avaliar a especificidade das construções marcadas com fluorescência. Para imagens in vivo.

Todas as imagens foram realizadas seis horas após o fluxo da injeção. A análise citométrica das suspensões de células tumorais mostrou marcação específica de células tumorais positivas para antígenos com ambos os conjugados AF six 80. Não houve marcação inespecífica de células negativas para antígenos em nenhuma das construções.

O tumor. As seções criogênicas mostraram uma marcação forte e quase homogênea de células positivas para antígenos com o nanocorpo. No entanto, o anticorpo monoclonal deu um antígeno muito mais fraco na coloração homogênea do que o esperado.

Os tumores negativos não apresentaram coloração do antígeno do anticorpo, os tumores negativos apresentaram coloração dispersa inespecífica no espaço intersticial após a injeção do anticorpo convencional. Isso foi muito semelhante à cena de coloração no antígeno. Tumores positivos após injeção do anticorpo convencional Uma vez dominado.

A parte de imagem desta tecnologia pode ser realizada em um único dia Após este procedimento. Outros métodos, como a marcação radioativa de nanocorpos, podem ser realizados para investigar a biodistribuição dos conjugados injetados em diferentes tecidos ou outras questões. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a validação ex vivo multimodalidade de sua experiência de imagem de fluorescência in vivo no infravermelho próximo com uma sonda marcada com flúor quatro.

Fornecendo-lhe assim uma técnica para avaliação de novas construções de anticorpos para imagens moleculares pré-clínicas.