A auto-montagem de formas bidimensionais complexos de ADN de cadeia simples Azulejos

O objetivo geral do experimento a seguir é formar nanoestruturas complexas de DNA com telhas de fita simples. Isso é conseguido misturando fitas de DNA sintético cuidadosamente projetadas na solução tampão desejada para formar a nanoestrutura de DNA desejada como uma segunda etapa. A amostra é ajoelhada durante a qual ocorre a automontagem da estrutura.

Em seguida, a eletroforese em gel agros nativa e a imagem do microscópio de força atômica são realizadas para verificar o sucesso da formação das nanoestruturas. Os resultados mostram nanoestruturas de DNA automontadas com base em agros nativos, eletroforese em gel e imagens de microscópio de força atômica. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a preparação da amostra de tal automontagem parecia complicada Antes de iniciar este procedimento, obtinham-se fitas de componentes de DNA de sequências especificadas dissolvidas em RNAs água livre de um fabricante de oligonucleotídeos em placas de poços Vbo 96 pipeta um microlitro de cada um dos 362 poços para as 24 hélices por 28 voltas.

Retângulo adicione 100 micromolares por fio em um tubo de ensaio de dois mililitros. Em seguida, adicione 138 microlitros de água destilada deionizada ao tubo de ensaio para fazer uma solução estoque. A uma concentração de 200 nano molares por fio.

Adicione 50 microlitros da solução estoque de 200 molares anuais. 10 microlitros de 10 x tampão de recozimento A e 40 microlitros de água destilada deionizada a um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Em seguida, uma amostra por 17 horas em um termociclador resfriando de 90 a 25 graus Celsius.

Depois de preparar um gel nativo 2%agros prestained com SYBR safe, execute-o por duas horas a 100 volts em banho de água gelada. Quando terminar, crie a imagem do gel usando um scanner de gel com um filtro apropriado para a mancha segura SYBR em um transiluminador de luz azul, retire a banda dominante com mobilidade semelhante à banda de 1.500 pares de bases de uma escada de DNA Kilobase usando uma lâmina de barbear afiada e limpa. Coloque os pedaços de gel desejados em uma coluna de centrifugação e, em seguida, esmague o gel em pedaços finos usando um microtubo Pele e centrifugue a 438 G por três minutos a quatro graus Celsius.

Após centrifugação. Medir a concentração do ADN utilizando um espectrofotómetro ultravioleta a 260 nanómetros. Neste ponto, retire o MICA preso a um disco metálico de amostra usando fita adesiva para obter uma superfície plana e coloque um disco de amostra no estágio de imagem do microscópio.

Adicione 40 microlitros de um x e tampão ajoelhado A, seguido por cinco microlitros da amostra purificada dos 24 HELOCs por 28 voltas retângulo à superfície recém-clivada de Micah. Deixe a mistura repousar por aproximadamente dois minutos. Instale um chip cantilever de nitrito de silício A FM em um suporte cantilever, imagem da amostra no modo de derivação de fluido usando um tamanho de varredura de dois micrômetros 1024 linhas para a resolução.

E uma taxa de varredura de 0,5 a um hertz para marcação interna ligada a três segmentos de nucleotídeos 17 primos a oito ladrilhos internos e seis ladrilhos de limite do retângulo. Misture os 28 fios com alças com o resto dos fios componentes dos 24 HELOCs em um retângulo de 28 voltas para fazer uma solução estoque de 200 NANOMOLARES para rotulagem de limites. Misture os 14 fios com alças com o resto dos fios componentes dos 24 mares de calcanhar por 28 voltas retângulo para obter uma solução estoque de 200 nanomolares para rotulagem interna.

Para a rotulagem de limites, adicione 50 microlitros da solução estoque de 200 nanomolares. 60 microlitros dos fios anti-alça modificados com biotina de 100 micromolares. 10 microlitros de 10 x tampão de recozimento A e 34 microlitros de água destilada deionizada para um tubo de ensaio de PCR.

Para rotulagem interna, adicione 50 microlitros da solução estoque de 200 nanomolares. Três microlitros do fio modificado de biotina anti-alça interna a 100 micromolares. 10 microlitros de 10 x tampão de recozimento A e 37 microlitros de água destilada deionizada para um tubo de ensaio PCR.

Em seguida, pesar 0,06 gramas de formato de mictório em três mililitros de água destilada. Para preparar uma solução aquosa de coloração de formato de mictório a 2%, filtre a solução de coloração usando um filtro de 0,2 microlitro conectado à seringa. Adicione cinco microlitros de cinco hidróxido de sódio normal a um mililitro da solução de coloração filtrada.

Após um breve vórtice, a centrífuga de solução com 20.000 G de brilho. Descarregue as grades revestidas de carbono com o lado revestido voltado para cima usando as seguintes configurações Quando terminar, pipete 3.5 microlitros de sample na grade tratada com descarga incandescente. Após quatro minutos, use um pedaço de papel de filtro para absorver a amostra, colocando o papel de filtro em contato com a grade pela lateral.

Em seguida, adicione imediatamente 3,5 microlitros da solução de coloração na grade. Após um minuto, retire a mancha e segure o papel de filtro contra a grade por um a dois minutos. Transfira a grade para um suporte de amostra TEM.

Uma imagem usando A-J-E-O-L GM 1400, operada a 80 quilovolts com ampliação variando de 10 K a 80 K.Uma vez identificada a forma, selecione os fios que correspondem à forma na tela molecular. Substitua o domínio exposto por um segmento poli T, de 10 a 11 nucleotídeos de comprimento, ou adicione um protetor de borda que seja complementar ao domínio exposto e termine-o com um segmento poli T de 10 a 11 nucleotídeos longos. Para evitar a agregação, crie uma biblioteca de fios para a tela molecular de 310 pixels, que inclui o espartilho.

Conjunto de uma estrela, conjunto de duas estrelas, três estrelas e conjunto de quatro estrelas para dar um total de 1.344 protetores de borda. Depois de centrifugar as placas de 96 poços para os diferentes conjuntos, pipetar um microlitro de 206 fios do conjunto principal, zero do conjunto uma estrela zero do conjunto, duas estrelas zero do conjunto, três estrelas e 24 fios do conjunto quatro estrelas em um tubo de centrífuga de dois mililitros. Adicione 20 microlitros de água destilada deionizada ao tubo para fazer uma solução de estoque de 400 nanomolares das fitas de DNA.

Em seguida, adicione 50 microlitros da solução estoque de 400 nanomolares. 10 microlitros de 10 x tampão de recozimento B e 40 microlitros de água destilada deionizada a um tubo de PCR de 0,2 mililitro e a mistura no termociclador por 17 horas, conforme descrito anteriormente. Depois de purificar a amostra e medir a imagem de concentração de DNA, a amostra usando um FM da mesma maneira que antes de quatro finalmente constrói retângulos de tamanhos diferentes simplesmente alterando o número de heoc paralelos e o número de voltas helicoidais.

A automontagem de ladrilhos de fita simples produzirá 24 HELOCs por 28 voltas retângulo As sequências de DNA para as diferentes telhas de fita simples podem ser modificadas e otimizadas para permitir a divisão de estreptococos e rotular a transformação de um retângulo em um tubo. A automontagem programável de ladrilhos de fio simples para formar tubos e retângulos de tamanhos variados e a construção de formas arbitrárias bidimensionais usando o design de substituição de domínio de tela molecular e o design de protetor de borda foram testados como soluções para agregação ao longo de domínios expostos de formas arbitrárias. Ambos os projetos têm rendimento de gel e integridade estrutural comparáveis, mas o design do protetor de borda é mais econômico, pois requer menos espécies auxiliares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer nanoestruturas complexas de DNA com base em telhas de fita simples.