A auto-montagem de formas bidimensionais complexos de ADN de cadeia simples Azulejos

O objetivo geral do seguinte experimento é formar nanoestruturas de DNA complexas com ladrilhos de fita simples. Isso é alcançado misturando cuidadosamente as fitas sintéticas de DNA projetadas em uma solução tampão desejada para formar a nanoestrutura de DNA desejada como segundo passo. A amostra é incubada, período durante o qual ocorre a automontagem da estrutura.

Em seguida, são realizadas eletroforese em gel de agarose nativa e imagem por microscopia de força atômica para verificar a formação bem-sucedida das nanoestruturas. Os resultados mostram nanoestruturas de DNA auto-montadas com base na eletroforese em gel de agarose nativa e na imagem por microscopia de força atômica. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque o preparo da amostra desse processo de auto-montagem parece ser complicado. Antes de iniciar este procedimento, obtenha as fitas de DNA com sequências especificadas dissolvidas em água livre de RNAses, provenientes de um fabricante de oligonucleotídeos, em placas de 96 poços Vbo; pipete um microlitro de cada um dos 362 poços para as 24 hélices por 28 voltas.

Adicione 100 micromolar por fita a um tubo de ensaio de dois mililitros. Em seguida, adicione 138 microlitros de água destilada e desionizada ao tubo de ensaio para preparar uma solução estoque com concentração de 200 nanomolar por fita.

Adicione 50 microlitros da solução estoque 200 ano molar, 10 microlitros do tampão de anelamento 10 x A e 40 microlitros de água destilada desionizada a um tubo PCR de 0,2 mililitro. Em seguida, incube a amostra por 17 horas em um ciclador térmico com resfriamento de 90 a 25 graus Celsius.

Após preparar um gel de agarose nativo a 2% pré-tingido com SYBR safe, eletroforese-o por duas horas a 100 volts em banho de gelo com água. Ao finalizar, visualize o gel utilizando um escâner de géis com filtro apropriado para a coloração SYBR safe em transiluminador de luz azul e recorte a faixa dominante com mobilidade semelhante à da faixa de 1.500 pares de bases da escada de DNA de um Kilobase utilizando uma lâmina de barbear limpa e afiada. Coloque os fragmentos desejados do gel em uma coluna de centrifugação e, em seguida, triture o gel em pedaços finos usando um triturador de microtubo, depois centrifugue a 438 ×g por três minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, meça a concentração do DNA utilizando um espectrofotômetro ultravioleta em 260 nanômetros. Neste momento, remova a mica presa a um disco metálico de amostra usando fita adesiva para obter uma superfície plana e coloque o disco da amostra na platina de imagem do microscópio.

Adicione 40 microlitros de um tampão x e agachamento A seguido por cinco microlitros da amostra purificada dos 24 HELOCs por 28 voltas retangulares à superfície recém-clivada de Micah. Deixe a mistura assentar por aproximadamente dois minutos. Instale um chip de cantiléver de nitreto de silício AFM em um suporte de cantiléver e imageie a amostra no modo de batida em fluido usando um tamanho de varredura de dois micrômetros com 1024 linhas para a resolução.

E uma taxa de varredura de 0,5 a um hertz para marcação interna ligada ao segmento de 17 nucleotídeos na extremidade 3' a oito ladrilhos internos e seis ladrilhos de borda do retângulo. Misture as 28 fitas com alças com o restante das fitas componentes dos 24 HELOCs em retângulo de 28 voltas para obter uma solução estoque de 200 nanomolares para marcação de borda. Misture as 14 fitas com alças com o restante das fitas componentes dos 24 heel seas em retângulo de 28 voltas para obter uma solução estoque de 200 nanomolares para marcação interna.

Para a marcação da extremidade, adicione 50 microlitros da solução estoque de 200 Nanomolar. 60 microlitros dos filamentos modificados com biotina e antiextremidade de 100 micromolar. 10 microlitros do tampão de anelamento 10 x A e 34 microlitros de água destilada desionizada a um tubo de PCR.

Para a marcação interna, adicione 50 microlitros da solução estoque de 200 nanomolar. Três microlitros da fita interna anti-handle modificada com biotina a 100 micromolar. 10 microlitros de tampão de anelamento 10 x A e 37 microlitros de água destilada desionizada a um tubo de PCR.

Em seguida, pese 0,06 gramas de formiato de uranila em três mililitros de água destilada. Para preparar uma solução aquosa de corante a 2% de formiato de uranila, filtre a solução de corante utilizando um filtro de 0,2 microlitros acoplado à seringa. Adicione cinco microlitros de hidróxido de sódio cinco normal a um mililitro da solução de corante filtrada.

Após agitar brevemente a solução em vórtex, centrifugue a 20.000 G. Descarregue as grades revestidas com carbono com o lado revestido voltado para cima usando as seguintes configurações. Quando terminar, pipete 3,5 microlitros da amostra sobre a grade tratada com descarga por ionização. Após quatro minutos, use um pedaço de papel de filtro para remover a amostra, encostando o papel de filtro na grade lateralmente.

A seguir, adicione imediatamente 3,5 microlitros da solução de corante sobre a grade. Após um minuto, remova o corante com papel-filtro e mantenha o papel contra a grade por um a dois minutos. Transfira a grade para um suporte de amostra de MET.

Uma imagem utilizando o A-J-E-O-L GM 1400, operado a 80 quilovolts com aumento variando de 10 K a 80 K. Uma vez identificada a forma, selecione as fitas que correspondem à forma na tela molecular. Substitua o domínio exposto por um segmento poli T, com 10 a 11 nucleotídeos de comprimento, ou adicione um protetor de borda complementar ao domínio exposto e termine-o com um segmento poli T de 10 a 11 nucleotídeos de comprimento. Para evitar agregação, crie uma biblioteca de fitas para a tela molecular de 310 pixels, que inclui o espartilho.

Defina um conjunto estrela, conjunto dois estrelas, três estrelas e conjunto quatro estrelas para fornecer um total de 1.344 protetores de borda. Após centrifugar as placas de 96 poços para os diferentes conjuntos, pipete um microlitro de 206 filamentos do conjunto principal, zero do conjunto um estrela, zero do conjunto dois estrelas, zero do conjunto três estrelas e 24 filamentos do conjunto quatro estrelas em um tubo de centrífuga de dois mililitros. Adicione 20 microlitros de água destilada e desionizada ao tubo para preparar uma solução estoque de 400 nanomolar dos filamentos de DNA.

Em seguida, adicione 50 microlitros da solução estoque de 400 nanomolar, 10 microlitros do tampão de anelamento 10 x B e 40 microlitros de água destilada e desionizada a um tubo PCR de 0,2 mililitro e incube a mistura no ciclador térmico por 17 horas conforme descrito anteriormente. Após purificar a amostra e medir a concentração de DNA, imageie a amostra usando um MF da mesma maneira que antes e, finalmente, construa retângulos de diferentes tamanhos alterando simplesmente o número de heoc paralelos e o número de voltas helicoidais.

A auto montagem de ladrilhos de fita simples produzirá um retângulo de 24 HELOCs por 28 voltas; as sequências de DNA para os diferentes ladrilhos de fita simples podem ser modificadas e otimizadas para permitir divisão por strep e marcação, bem como a transformação de um retângulo em um tubo. A auto montagem programável de ladrilhos de fita simples para formar tubos e retângulos de tamanhos variados e a construção de formas arbitrárias bidimensionais utilizando a tela molecular foram testadas; o design por substituição de domínio e o design por protetor de borda foram avaliados como soluções para agregação em domínios expostos de formas arbitrárias. Ambos os designs apresentam rendimento em gel e integridade estrutural comparáveis, mas o design com protetor de borda é mais econômico, pois requer menos espécies auxiliares.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir nanoestruturas de DNA complexas com base em ladrilhos de fita simples.