Name: Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar metilação de CpG em regiões genômicas alvo usando sequenciamento de amplicons de bisulfito. Este método combina conversão de bisulfito com PCR e NGS para análise epigenética precisa.

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Os autores agradecem a Colleen Van Kirk pelas amostras de retina e cerebelo de camundongos e a Peter Gregory pela geração de figuras. Os autores também agradecem à Dra. Allison Gillaspy e ao núcleo do Laboratório de Pesquisa em Biologia Molecular e Citometria pelo acesso ao MiSeq. Este trabalho foi apoiado por doações do NIH DA029405, EY021716 e AG026607 e pela Fundação Donald W. Reynolds.

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Os autores não têm nada a divulgar.

BSAS permite focado, precisa quantificação metilação do DNA com recursos de alto rendimento, tanto em número de amostras e número de alvos. Adicionalmente, esta biblioteca utilizando geração tagmentation mediada por transposome requer menos ADN de entrada, é mais rápido e contém menos passos do que as técnicas de corte tradicional e adaptador de ligação subsequentes. Estas melhorias sobre os métodos existentes permitem-nível-base de análise de metilação do DNA precisa de qualquer alvo de interesse. Além disso, BSAS proporciona um novo método para a confirmação de regiões de interesse (regiões de metilação diferencialmente (DMRS), ilhas CpG, regiões reguladoras) que foram identificados por meio de todo o genoma bissulfito 22 ou capturar 23 abordagens. Utilizando as abordagens confirmação ortogonais e mais quantitativamente métodos precisos melhora o rigor analítico de estudos epigenômicos. A profundidade de leitura de alta alcançada com BSAS permite a quantificação precisa em um intervalo de confiança estreito, resulta na quantificação exacta 16. Além disso, a capacidade de executar muitas amostras em um único experimento pode aumentar o tamanho da amostra para confirmação de métodos de genomas inteiros, o que irá aumentar o poder estatístico; uma fraqueza de muitos estudos epigenéticos atuais. Importante, BSAS fornece uma quantificação metilação CpG base-específicos, que permite a geração de hipóteses testáveis ​​para pesquisa epigenética. Hipóteses, tais como o aumento da metilação a um elemento de resposta específica irá resultar numa diminuição da ligação de um factor de transcrição específico. BSAS, combinados com os dados de expressão de mRNA emparelhados, proporciona um método para a obtenção de ambos regulação epigenética e a expressão do mRNA dentro de um único pedaço de tecido ou população de células. Medidas pareadas de regulação e expressão também aumentar o rigor científico e impacto dos resultados. As etapas críticas no âmbito do protocolo BSAS incluem design primer, otimização amplicon, e geração de biblioteca /QC. Viés PCR é introduzida se primers não são projetados corretamente e amplificar em diferentes eficiências 8. O uso de padrões de metilação, tal como gerados enzimaticamente 100% e 0% de citosina metilados padrões, pode ser usada para determinar o grau, se houver, de viés metilação quantificação, e é um bom controlo metodológico para quantificar metilação 16. Da mesma forma, o cuidado deve ser tomado quando otimizando reações de PCR para a geração de um único fragmento amplificado de alta qualidade. Se nenhum amplicon está presente utilizando as diretrizes sugeridas detalhadas no protocolo, a passos de otimização incluem aumento do número de ciclos de PCR ou quantidade de entrada bsDNA. Se houver vários produtos de PCR, incluindo dimeros de iniciadores, a passos de otimização incluem diminuir quantidade de entrada bsDNA, diminuindo as concentrações de entrada molares PCR primers, o aumento da temperatura de recozimento, ou diminuindo PCR número ciclo. Um ou uma combinação destes procedimentos de optimização produz resultados suficientes para gerar uma única higamplicão h-qualidade. Alternativamente, redesenhando primers é uma boa abordagem para conjuntos de iniciadores que não produzem um único amplicon. Para as regiões onde redesign não é adequado ou possível, degenerar conjuntos de iniciadores incluindo ambos podem trabalhar de citosina e timina em locais de CpG em primers para a frente e de adenina e guanina em locais de CpG em primers reversos. No entanto, estes conjuntos de iniciadores necessitam ainda de optimização para garantir que não haja PCR polarização está a ocorrer, um processo fora do âmbito deste protocolo. Bibliotecas de qualidade são extremamente importantes para o sucesso. Certifique-se de que as medidas de QC são realizadas para determinar o tamanho, qualidade e quantidade de bibliotecas antes de seqüenciamento. As reacções de sequenciação são propensos a falhas com o contributo das bibliotecas de baixa qualidade. Viés de metilação quantificação pode ser atenuado através da garantia de que as frequências de metilação estão presentes em ambos frente e verso, sequenciamento lê. Além disso, dezenas de bases alinhando aos locais CpG de qualidade deve ser ≥Q30 em alta confidence na quantificação. Enquanto outros têm mostrado anteriormente pouco ou nenhum viés em reações tagmentation de DNA convertido bissulfito 19, garantindo as métricas acima descritas permite a confirmação da baixa quantificação viés metilação. BSAS atualmente mede a metilação em locais CpG, no entanto, futuras expansões deste método permitirá medidas pareadas de CpG 5-HMC com a adição de medidas experimentais, distinguindo entre 5-MC e 5-HMC como a introdução de perrutenato de potássio antes da conversão bissulfito 24. Isto irá aumentar o impacto de utilidade BSAS, permitindo metilação emparelhados, tanto os dados de expressão 5-mC e 5-HMC, e em ordem para determinar a expressão do gene papéis reguladores de metilação do ADN. Preparação biblioteca transposome-mediada de amplicons de PCR não resultam na diminuição da profundidade de sequenciação nas extremidades de regiões amplificadas. Portanto, regiões de grande interesse deve ser projetado para residir no meio de amplicons. Comosempre, porque BSAS gera sequenciamento ler profundidades de&gt; 1.000 X, a precisão quantitativa de 5-MC medições perto das extremidades das regiões amplificadas permanece elevado.

Já faz mais de meio século desde o primeiro relatório de ocorrência natural modificações no DNA na forma de metilação da citosina 1. Metilação da citosina é uma base de citosina nucleótido modificado em que o 5 th de carbono no anel de base tem um grupo metil (5-MC), que ocorre mais frequentemente no motivo dinucleótido CpG em genomas de mamíferos. A presença funcional de 5-mC em promotores de genes está geralmente associada com a repressão transcricional, enquanto que a ausência está associada com a actividade de transcrição 2. Tremendos avanços têm sido feitos em nossa compreensão do papel da metilação do DNA no desenvolvimento 3, propagação transgeracional de perfis epigenéticos 4, a patogênese do câncer de 5,6, e uma série de outras áreas de pesquisa. Muitos desses avanços vieram nos últimos anos, como novas metodologias têm sido desenvolvidas ao perfil de metilação do DNA 7. Com o advento epopularização da próxima geração de técnicas de sequenciamento (NGS) há agora uma série de métodos para o perfil de metilação do DNA através de um genoma inteiro ou grandes regiões do genoma 8. Estas abordagens em aberto a possibilidade de estudos de descoberta que quantificam padrões de metilação de DNA e as diferenças na metilação do DNA. Em adição a estas abordagens hipótese de geração, existe uma necessidade significativa de / ADN alvo testes de hipóteses metilação métodos de quantificação. Pyrosequencing, PCR específica de metilação e sequenciamento Sanger de DNA convertido bissulfito têm sido os métodos mais utilizados para a análise de regiões-alvo (ou seja, uma região promotora de um único gene ou uma ilha CpG) 9-12. Todos estes métodos baseiam-se na conversão de bissulfito, uma reacção química em que a desaminação de citosina não metilados de são convertidos em uracilo de, enquanto citosina metilados de permanecer intacta 13,14. A amplificação por PCR de bisulfite-resultados de ADN convertidas em substituição de uracila de timina com 15 permitindo que a metilação diferencial para ler como uma diferença de base. Embora muito útil, às limitações desses métodos incluem baixa precisão quantitativa, comprimento de leitura curta, e baixo rendimento da amostra. Para lidar com essas limitações, desenvolvemos um método que chamamos Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS) 16. O objectivo deste método é a de ser capaz de analisar regiões genómicas alvo de interesse por um grande número de amostras, com alta precisão quantitativa. BSAS usa elementos de métodos existentes (conversão bissulfito e amplificação PCR específicas da região) e combina-los com simples construção da próxima geração biblioteca (mediada por transposome) 17 e de bancada NGS 18 (Figura 1). Esta abordagem proporciona um método de transferência mais quantitativa e mais elevado para examinar a metilação da citosina em qualquer região de interesse. Aqui apresentamos ométodo em detalhes e descrever abordagens para a resolução de problemas e verificação da qualidade do processo de BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR Purificação</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Básica PowerPac</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech Placa PCR 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>semi-saia</td></tr><tr><td>Heatsealing Film</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Heatsealing Foil</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &#956; l Pontas</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956; l Pontas</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1.000 &#956; l Pontas</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Kit de preparação de amostra de DNA Nextera XT</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT Index Kit</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 índices</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq Desktop Sequencer</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">Kit de Reagentes MiSeq v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 ciclos</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Kit universal de qPCR</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de ensaio</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen Kit de ensaio de RNA</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR ProFlex de 96 poços</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td> Novex TBE de <td>10 poços</td></tr><tr><td>Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA</td><td>Ladder Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Brometo de Etídio</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Sistema de PCR em Tempo Real Rápido</td><td>Life Technologies 4329001</td><td></td><td>bloco de 384 poços</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Saia lateral</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multi-Mode Leitor de microplacas</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de aço inoxidável</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Software para tubulação de metilação</td></tr><tr><td>QIAQuick Kit de purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS cloridrato</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Placa NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>com 384 poços de saia completa, padrão</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Selo qPCR absoluto</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA Polimerase</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

alvejado dna análise de metilação por sequenciação de próxima geração

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

O papel dos processos epigenéticos no controle da expressão gênica é conhecido há vários anos. A metilação do DNA em resíduos de citosina é de particular interesse para estudos epigenéticos, pois demonstrou ser um regulador dinâmico e duradouro da expressão gênica. Os esforços para examinar as mudanças epigenéticas na saúde e na doença foram prejudicados pela falta de métodos de alto rendimento e quantitativamente precisos. Com o advento e a popularização das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), essas ferramentas agora estão sendo aplicadas à epigenômica, além das metodologias genômicas e transcriptômicas existentes. Para investigações epigenéticas de metilação de citosina onde regiões de interesse, como promotores de genes específicos ou ilhas CpG, foram identificadas e há necessidade de examinar um número significativo de amostras com alta precisão quantitativa, desenvolvemos um método chamado Sequenciamento de Amplicon de Bissulfito (BSAS). Este método combina conversão de bissulfito com amplificação direcionada de regiões de interesse, construção de biblioteca mediada por transposoma e NGS de bancada. O BSAS oferece um método rápido e eficiente para análise de até 10 kb de regiões-alvo em até 96 amostras por vez que pode ser realizado pela maioria dos grupos de pesquisa com habilidades básicas de biologia molecular. Os resultados fornecem quantificação absoluta da metilação da citosina com especificidade de base. O BSAS pode ser aplicado a qualquer região genômica de qualquer fonte de DNA. Este método é útil para estudos de teste de hipóteses de regiões-alvo de interesse, bem como confirmação de regiões identificadas em análises de metilação de todo o genoma, como sequenciamento de bissulfito do genoma completo, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de imunoprecipitação de DNA metilado.

BSAS lê correctamente alinhado com a sequência de referência convertido será semelhante Figura 5. Dinucleótidos CpG podem ser claramente identificadas e estados de metilação pode ser estimado por observação chamadas de base nos locais de CpG na mapeado lê. Por exemplo, com controles de metilação, 0% de metilação resultará em toda a lê mapeados para locais contendo CpG (Figura 5A) do T. Os controlos 100% de metilação resultará em todo o lê lê mapeados para locais de CpG que contêm de C (Figura 5B). A determinação quantitativa da frequência de citosina (C / C + T) nos locais CpG produz a frequência de metilação na amostra original. Um representante curva padrão gerada a partir de controlos de metilação do genoma inteiro (n = 3 / relação de metilação) mostra linearidade da metilação, bem como a quantificação de precisão na quantificação em cada proporção de metilação (Figura 6). Como um exemplo deste método, no total, RNA e DNA foram co-iso<html> lada do cerebelo e da retina do rato (n = 4 / grupo). Expressão rodopsina, selectivamente expressa em tecido da retina, foi medida utilizando qPCR. A expressão foi detectada apenas em retina (Figura 7A). Usando BSAS, os níveis de metilação de CpG foram quantificados na região do promotor da rodopsina. Níveis de metilação cumulativos em toda a região do promotor foram&gt; 80% no cerebelo em comparação com &lt;15% na retina (p &lt;0,001, t-teste paramétrico) (Figura 7B). BSA benefícios metilação de quantificação de metilação específico do local, e quantificação dos níveis de metilação podem ser comparadas com base na CpG-específica em qualquer dada região genómica. Níveis de metilação de CpG em todo o promotor rodopsina foram significativamente mais elevadas em amostras de cerebelo quando comparado com as amostras de retina (p &lt;0,001, t-teste paramétrico em cada sítio CpG) (Figura 7C). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemática do método BSAS Neste método, o ADN genómico é o bissulfito convertido para modificar as citosinas unmethylation para uracilos. Posteriormente, durante a PCR estes uracilos são alterados para timinas. Amplificação PCR está orientado para as regiões de interesse e altamente enriquece por apenas essas sequências. Os amplicons de PCR resultantes são transformados em bibliotecas de dupla indexação por meio de um processo simples tagmentation. Posteriormente, as bibliotecas são sequenciados em um sequenciador de bancada próxima geração eo seqüenciamento leituras são mapeados para o in silico convertido sequência de referência e por cento de metilação da citosina do é determinado de um modo específico-base. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Em silico conversão bissulfito de região de interesse Qualquer região de interesse de qualquer referência genômica pode ser selected para in silico conversão bissulfito. Citosinas não CpG são substituídos com timina da sequência de referência. Citosinas CpG permanecem citosinas na bissulfito convertido referência. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Primers colocação Primer Bisulfite PCR são projetados contra um in silico bissulfito convertido sequência de referência. Primers devem ser concebidos de modo que não se sobreponham dinucleï¿½idos CG ou concebidas ao lado dinucleï¿½idos CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Exemplos de amplicons altas e pobres PCR qualidade e bibliotecas de sequenciamento vestígios electroferograma representativos e show de gel (A) amplicon ideal para a geração de biblioteca mediada por transposome com um único alto.concentração do produto. (B) da biblioteca gerada a partir deste amplicão mostra alta concentração e distribuição uniforme de tamanho. (C) Fraca amplicons de PCR de qualidade pode ser baixo em tamanho, concentração, e contêm vários produtos e / ou dimeros de iniciadores. Estes amplicons de má qualidade vai levar a (D) falhou geração biblioteca com baixa concentração e baixa distribuição de tamanho. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Exemplos de saídas de sequenciamento de controles de metilação. (A) Em silico convertido sequenciamento de referência com locais CpG destacadas em vermelho. 0% de controle de metilação mapeados lê à região, demonstrando timinas selecionados (realce ganância) de mapeamento em sites CpG. Controle (B) 100% metilação mapeados lê mostrar (no destaque azul) mapeamento da citosina em locais CpG. Figura 6:. A metilação quantificação através de uma série de controlos de metilação controlos de metilação do genoma inteiro misturados em proporções de metilação (n = 3 / razão) entre 0% e 100% foram quantificadas usando BSAS. Traçando quantificação de espera em relação quantificada demonstra linearidade de controle de metilação quantificação. Em todos os controles, houve alta precisão na metilação quantificação. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Exemplo de metilação do DNA e a expressão do gene análise emparelhado a partir de amostras de tecido. (A) A rodopsina expressão relativa de ARNm a partir do cerebelo de rato e tecido da retina. (B) A rodopsina metilação média promotor quantificada por BSAS entre cerebelo e da retina ADN (*** p &lt;0,001, t-teste paramétrico). &lt;strong&gt; níveis de metilação C) específicas do local CpG em todo promotor rodopsina (-244 a 6, em relação ao local de início da transcrição [TSS]) no cerebelo mouse e DNA retina.

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a metilação de CPG em regiões-alvo de interesse a partir de DNA genômico isolado de tecidos ou células de interesse. Isso é realizado primeiramente projetando primers específicos para PCR com bisulfito, para amplificar as regiões de interesse a partir de DNA genômico convertido com bisulfito. Na segunda etapa, a região de interesse convertida com bisulfito é amplificada e bibliotecas de sequenciamento de nova geração ou NGS são geradas a partir dos amplicons cons.Em seguida, as bibliotecas são sequenciadas e arquivos FASTQ são gerados para análise. Na etapa final, as leituras de sequenciamento são alinhadas à sequência alvo de referência convertida por bisulfito, e a porcentagem de 5mC é calculada, por fim, por meio de sequenciamento de amplicons de bisulfito ou BS A S, que pode ser realizado para quantificar com precisão e exatidão a metilação de CPG em qualquer região de interesse de qualquer organismo modelo. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o sequenciamento de Sanger, é que o BS A S fornece quantificação precisa e exata da metilação de CPG de maneira rápida e de alto rendimento, oferecendo a possibilidade de analisar múltiplas regiões em um grande número de amostras.Após identificar o alvo e projetar o iniciador, monte a reação para a otimização da amplificação do alvo de um único amplicon e, em seguida, feche uma placa de PCR com filme termosselado para visualizar os amplicons por eletroforese em gel. Em seguida, carregue os poços apropriados com 30 microlitros das reações de PCR ou marcador molecular, e então execute o gel a 200 volts por aproximadamente 45 minutos. Quando o primeiro corante atingir o final do gel, interrompa a corrida e cubra completamente o gel com brometo de AUM recém-preparado a cinco microgramas por mililitro.Após cinco minutos, visualize o gel por meio de um transiluminador UV com comprimento de onda de excitação de 482 nanômetros. Utilize o marcador para dimensionar os AMPLICONS de PCR e determinar a especificidade da reação. Observe a presença de múltiplas bandas além do tamanho esperado do amplicon para determinar o tamanho médio dos picos da biblioteca detectados e uma estimativa da molaridade.Em seguida, execute as bibliotecas em um chip de eletroforese capilar para análise de tamanho de DNA com um ensaio de DNA de alta sensibilidade, conforme as instruções do fabricante. Para quantificar as bibliotecas por qPCR, utilize primers projetados contra as sequências de adaptador nas bibliotecas geradas e padrões com concentração conhecida em um instrumento em tempo real, usando as configurações de quantificação absoluta conforme as instruções do fabricante.Em seguida, utilize o tamanho das bibliotecas e a quantificação molar proveniente da QPCR para calcular as concentrações molares das bibliotecas. Após o sequenciamento, importe os arquivos fastQ compactados para o pipeline apropriado de análise de sequenciamento, selecione importar e, em seguida, selecione o método de sequenciamento utilizado para gerar as leituras, a fim de manter os escores Q para aplicações de corte das leituras. Importe os arquivos de leitura fastQ compactados apropriados e, em seguida, nas opções gerais, desmarque descartar escores de qualidade.Selecione um local para as leituras importadas e clique em concluir. Em seguida, em ferramentas principais de NGS, selecione cortar sequências. Destaque as leituras a serem cortadas, mantendo apenas as leituras com pontuações maiores ou iguais a Q 30.Em seguida, selecione o corte usando as pontuações de qualidade e defina o limite em 0,001. Para selecionar ainda mais apenas as leituras contendo menos de ou igual a um nucleotídeo ambíguo, escolha cortar nucleotídeos ambíguos e defina o número máximo de ambiguidades como um.Em seguida, selecione um local para salvar as leituras recortadas e clique em finalizar para mapear as leituras recortadas na referência gênica convertida in silico por sulfito. Em ferramentas principais de NGS, selecione mapear leituras. Como referência, selecione as leituras recortadas a serem mapeadas e clique em próximo.Em seguida, na máscara de referência, selecione a sequência de referência convertida e selecione nenhuma máscara. Clique em próximo e, depois, atribua uma pontuação de três para desajustes, inserções e deleções. Atribua uma pontuação de um para a fração mínima do comprimento da leitura mapeada na referência e atribua uma pontuação de 0,9 para a fração mínima de identidade entre o mapeamento, a leitura e a referência; em tratamento de correspondência inespecífica, selecione ignorar e clique em Próximo nas opções de saída.Em seguida, selecione Criar mapeamentos de leituras independentes. Depois, em manipulação dos resultados, clique em salvar. Selecione um local para salvar o mapeamento de leituras e clique em concluir para executar a chamada de variantes nas leituras mapeadas.Na análise de resequenciamento, selecione a detecção de variantes de baixa frequência e escolha o mapeamento de leituras a ser analisado. Clique em próximo e, em seguida, nos parâmetros de variante de baixa frequência, insira 0,01% e clique em próximo. Nos filtros gerais, defina a cobertura mínima como 1000 para garantir que a sequência tenha uma profundidade maior ou igual a 1000 x.Por fim, clique em avançar e, em seguida, nas opções de saída, selecione criar tabela anotada e escolha um local para salvar o arquivo da tabela de variantes, clique em concluir e utilize as frequências das variantes nas regiões CPG anotadas na região de interesse a partir do arquivo da tabela de variantes para calcular a frequência da metilação de citosina em uma citosina de referência no contexto CG. As leituras de sequenciamento por amplicon de sulfito alinhadas corretamente à sequência de referência convertida se assemelharão às ilustradas na figura. Os dinucleotídeos CPG podem ser claramente identificados e os estados de metilação podem ser estimados observando-se as chamadas de bases nos sítios CPG. Nas leituras mapeadas, 0% de metilação resultará em leituras mapeadas contendo timina mapeada nos sítios CPG.Controles de metilação a 100% resultarão em leituras mapeadas contendo citosinas mapeadas para sítios CPG. Neste experimento, RNA e DNA foram coisolados de um camundongo, cerebelo e retina. A expressão de opsinas, expressa seletivamente no tecido retiniano, foi então medida por QPCR, conforme esperado.O RNA da opsina foi detectado apenas na retina após a quantificação dos níveis de metilação de CPG na região promotora da Opsina por sequenciamento após amplificação com bissulfito. No entanto, os níveis cumulativos de metilação ao longo da região promotora foram superiores a 80% no cerebelo, comparados a menos de 15% na retina. A quantificação de metilação por B SAS se beneficia da quantificação específica por sítio, permitindo a comparação dos níveis de metilação com base em CPG específico em qualquer região genômica dada.De fato, neste experimento, observou-se que os níveis de metilação de CPG em todo o promotor da opsinina eram significativamente mais altos nas amostras cerebelares em comparação com as amostras de retina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a metilação de CPG em regiões-alvo de interesse a partir de DNA genômico isolado de tecidos ou células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Um fluxo de trabalho simplificado para estudar a metilação do DNA e alterações de expressão gênica em início de vida estresse é mostrado. A partir de separação materno de ratos recém-nascidos e isolamento de tecidos cerebrais discretas, que representam um protocolo para simultaneamente isolar DNA e RNA de punções de tecido cerebral para a sequenciação bissulfito subsequente e RT-PCR.

Análise otimizado de metilação do DNA e expressão gênica de pequenas áreas anatomicamente definidos do Cérebro

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

Aqui, descrevemos o protocolo e a implementação de metil-Seq, uma plataforma de epigenomic, usando um modelo do rato para identificar alterações epigenéticas associadas com exposição de estresse crônico. Os resultados demonstram que a plataforma de metil-Seq rato é capaz de detectar diferenças de metilação que surgem a partir da exposição de estresse em ratos.

Uma plataforma de Metil-Seq de Rato para identificar alterações epigenéticas associadas à exposição ao estresse

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

Aqui, descrevemos um procedimento para análise genoma de metilação de DNA em cânceres gastrointestinais. O procedimento é de relevância para estudos que investigam relações entre padrões de metilação de genes e fatores que contribuem para a carcinogênese em cânceres gastrointestinais.

Análise genoma-em todo o DNA da metilação de DNA no câncer gastrointestinal

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Aprenda a quantificar metilação de CpG em regiões genômicas alvo usando sequenciamento de amplicons de bisulfito. Este método combina conversão de bisulfito com PCR e NGS para análise epigenética precisa.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

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