Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a metilação do CPG em regiões específicas de interesse fora do DNA genômico, isoladas de tecidos ou células de interesse. Isso é feito primeiro projetando primers de PCR específicos para sulfito para amplificar regiões de interesse do DNA genômico convertido em bissulfito. Na segunda etapa, a região de interesse convertida em bissulfito é amplificada e o sequenciamento de próxima geração ou bibliotecas NGS são gerados a partir dos amplicons cons.

Em seguida, as bibliotecas são sequenciadas e os arquivos FASTQ são gerados para análise. Na etapa final, as leituras de sequenciamento são alinhadas à sequência-alvo de referência convertida em bissulfito, e os cinco mc por cento são calculados em última análise por sequenciamento de amplicon de sulfito ou BS a s pode ser realizado para quantificar com precisão e precisão a metilação do CPG em qualquer região de interesse de qualquer organismo modelo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o sequenciamento de Sanger, é que o BS A S fornece quantificação de metilação CPG precisa e precisa de maneira rápida e de alto rendimento, proporcionando a oportunidade de testar várias regiões em um grande número de amostras.

Depois de identificar o alvo e projetar o primer, monte a reação para a otimização da amplificação do alvo de um único amplicon e, em seguida, sele uma placa de PCR com filme selado a quente para visualizar os amplicons por eletroforese de página. Em seguida, carregue os poços apropriados com 30 microlitros de reações de PCR ou escada e, em seguida, execute o gel a 200 volts por aproximadamente 45 minutos. Quando o primeiro corante atingir o final do gel, pare a reação e cubra todo o gel com cinco microgramas por mililitro de brometo de AUM recém-preparado.

Após cinco minutos, obtenha imagens do gel por meio de um transiluminador UV em um comprimento de onda de excitação de 482 nanômetros. Use a escada para dimensionar os AMPLICONS de PCR para determinar a especificidade da reação. Procure várias bandas diferentes do tamanho esperado do amplicon para determinar o tamanho médio dos picos de biblioteca detectados e uma estimativa da molaridade.

Em seguida, execute as bibliotecas em um chip de dimensionamento de DNA de eletroforese capilar com um ensaio de DNA de alta sensibilidade de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar as bibliotecas por QPCR. Use primers projetados contra as sequências de adaptadores nas bibliotecas e padrões gerados com uma concentração conhecida em um instrumento em tempo real, usando as configurações de quantificação absoluta de acordo com as instruções do fabricante.

Em seguida, use o tamanho das bibliotecas e a quantificação molar do QPCR para calcular as concentrações molares das bibliotecas. Após o sequenciamento, importe os arquivos Q rápidos compactados para o pipeline de análise de sequenciamento apropriado, selecione importar e, em seguida, selecione o método de sequenciamento usado para gerar as leituras para reter as pontuações Q para os aplicativos de corte de leitura. Importe os arquivos de leitura rápida Q compactados apropriados e, em opções gerais, desmarque descartar pontuações de qualidade.

Selecione um local para as leituras importadas e clique em concluir. Em seguida, em Ferramentas principais do NGS, selecione sequências de corte. Realce as leituras a serem cortadas, mantendo apenas as leituras que contenham pontuações maiores ou iguais a Q 30.

Em seguida, selecione o corte usando índices de qualidade e defina o limite como 0,001. Para selecionar ainda mais apenas as palhetas contendo menos ou igual a um nucleotídeo ambíguo. Selecione cortar nucleotídeos ambíguos e defina o número máximo de ambiguidades para um.

Em seguida, selecione um local para salvar as leituras aparadas e clique em concluir para mapear a resolução aparada para a referência de gene convertido in silico por sulfito. Em Ferramentas principais do NGS, selecione leituras de mapa. Para fazer referência, selecione as leituras cortadas a serem mapeadas e clique em Avançar.

Em seguida, em mascaramento de referência, selecione a sequência de referência convertida e selecione sem mascaramento. Clique em Avançar e atribua uma pontuação de três para incompatibilidades, inserções e exclusões. Atribua uma pontuação de um para a fração mínima do mapa de comprimento de leitura à referência e atribua uma pontuação de 0,9 para a fração mínima de identidade entre o mapa, a leitura e a referência em manipulação de correspondência não específica, selecione, ignore e clique em Avançar em opções de saída.

Em seguida, selecione Criar mapeamentos de leitura autônomos. Em seguida, em manipulação de resultados, clique em salvar. Selecione um local para salvar o mapeamento de leitura e clique em concluir para executar a variante chamando as leituras mapeadas.

Em análise de resequenciamento, selecione a detecção de variante de baixa frequência e escolha o mapeamento de leitura a ser analisado. Clique em Avançar e, em seguida, no parâmetro de variante de baixa frequência, insira 0,01% e clique em Avançar. Em filtros gerais, defina a cobertura mínima como 1000 para garantir que a sequência esteja em uma profundidade maior ou igual a 1000 x.

Por fim, clique em Avançar e, em seguida, em Opções de saída, selecione criar tabela anotada e selecione um local para salvar o arquivo da tabela variante, clique em concluir e use as frequências variantes nos locais CPG anotados na região de interesse do arquivo da tabela variante para calcular a frequência da metilação da citosina em uma citosina de referência no contexto CG por leituras de sequenciamento de amplicon de sulfito devidamente alinhadas à sequência de referência convertida serão semelhantes às ilustradas na figura. Os dinucleotídeos CPG podem ser claramente identificados e os estados de metilação podem ser estimados observando as chamadas de base nos locais CPG. Nas leituras mapeadas, 0% de metilação resultará em leituras mapeadas contendo timina mapeadas para os locais CPG.

Os controles de 100% de metilação resultarão em leituras mapeadas contendo citosinas mapeadas para locais de CPG. Neste experimento, RNA e DNA foram co-isolados de um camundongo, cerebelo e retina. A expressão de opsina expressa seletivamente no tecido retiniano foi então medida usando QPCR conforme esperado.

O RNA da opsina foi detectado apenas na retina após a quantificação dos níveis de metilação do CPG na região promotora da opsina por sequenciamento de amplificação de bissulfito. No entanto, os níveis cumulativos de metilação em toda a região promotora foram superiores a 80% no cerebelo em comparação com menos de 15% na retina. A quantificação de metilação B SAS se beneficia da quantificação de metilação específica do local, permitindo a comparação dos níveis de metilação em uma base específica de CPG em qualquer região genômica.

De fato, neste experimento, os níveis de metilação do CPG no promotor de opsina foram significativamente mais altos nas amostras cerebelares quando comparados às amostras de retina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a metilação do CPG em regiões específicas de interesse fora do DNA genômico, isoladas de tecidos ou células.