Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a metilação de CPG em regiões-alvo de interesse a partir de DNA genômico isolado de tecidos ou células de interesse. Isso é realizado primeiramente projetando primers específicos para PCR com bisulfito, para amplificar as regiões de interesse a partir de DNA genômico convertido com bisulfito. Na segunda etapa, a região de interesse convertida com bisulfito é amplificada e bibliotecas de sequenciamento de nova geração ou NGS são geradas a partir dos amplicons cons.

Em seguida, as bibliotecas são sequenciadas e arquivos FASTQ são gerados para análise. Na etapa final, as leituras de sequenciamento são alinhadas à sequência alvo de referência convertida por bisulfito, e a porcentagem de 5mC é calculada, por fim, por meio de sequenciamento de amplicons de bisulfito ou BS A S, que pode ser realizado para quantificar com precisão e exatidão a metilação de CPG em qualquer região de interesse de qualquer organismo modelo. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o sequenciamento de Sanger, é que o BS A S fornece quantificação precisa e exata da metilação de CPG de maneira rápida e de alto rendimento, oferecendo a possibilidade de analisar múltiplas regiões em um grande número de amostras.

Após identificar o alvo e projetar o iniciador, monte a reação para a otimização da amplificação do alvo de um único amplicon e, em seguida, feche uma placa de PCR com filme termosselado para visualizar os amplicons por eletroforese em gel. Em seguida, carregue os poços apropriados com 30 microlitros das reações de PCR ou marcador molecular, e então execute o gel a 200 volts por aproximadamente 45 minutos. Quando o primeiro corante atingir o final do gel, interrompa a corrida e cubra completamente o gel com brometo de AUM recém-preparado a cinco microgramas por mililitro.

Após cinco minutos, visualize o gel por meio de um transiluminador UV com comprimento de onda de excitação de 482 nanômetros. Utilize o marcador para dimensionar os AMPLICONS de PCR e determinar a especificidade da reação. Observe a presença de múltiplas bandas além do tamanho esperado do amplicon para determinar o tamanho médio dos picos da biblioteca detectados e uma estimativa da molaridade.

Em seguida, execute as bibliotecas em um chip de eletroforese capilar para análise de tamanho de DNA com um ensaio de DNA de alta sensibilidade, conforme as instruções do fabricante. Para quantificar as bibliotecas por qPCR, utilize primers projetados contra as sequências de adaptador nas bibliotecas geradas e padrões com concentração conhecida em um instrumento em tempo real, usando as configurações de quantificação absoluta conforme as instruções do fabricante.

Em seguida, utilize o tamanho das bibliotecas e a quantificação molar proveniente da QPCR para calcular as concentrações molares das bibliotecas. Após o sequenciamento, importe os arquivos fastQ compactados para o pipeline apropriado de análise de sequenciamento, selecione importar e, em seguida, selecione o método de sequenciamento utilizado para gerar as leituras, a fim de manter os escores Q para aplicações de corte das leituras. Importe os arquivos de leitura fastQ compactados apropriados e, em seguida, nas opções gerais, desmarque descartar escores de qualidade.

Selecione um local para as leituras importadas e clique em concluir. Em seguida, em ferramentas principais de NGS, selecione cortar sequências. Destaque as leituras a serem cortadas, mantendo apenas as leituras com pontuações maiores ou iguais a Q 30.

Em seguida, selecione o corte usando as pontuações de qualidade e defina o limite em 0,001. Para selecionar ainda mais apenas as leituras contendo menos de ou igual a um nucleotídeo ambíguo, escolha cortar nucleotídeos ambíguos e defina o número máximo de ambiguidades como um.

Em seguida, selecione um local para salvar as leituras recortadas e clique em finalizar para mapear as leituras recortadas na referência gênica convertida in silico por sulfito. Em ferramentas principais de NGS, selecione mapear leituras. Como referência, selecione as leituras recortadas a serem mapeadas e clique em próximo.

Em seguida, na máscara de referência, selecione a sequência de referência convertida e selecione nenhuma máscara. Clique em próximo e, depois, atribua uma pontuação de três para desajustes, inserções e deleções. Atribua uma pontuação de um para a fração mínima do comprimento da leitura mapeada na referência e atribua uma pontuação de 0,9 para a fração mínima de identidade entre o mapeamento, a leitura e a referência; em tratamento de correspondência inespecífica, selecione ignorar e clique em Próximo nas opções de saída.

Em seguida, selecione Criar mapeamentos de leituras independentes. Depois, em manipulação dos resultados, clique em salvar. Selecione um local para salvar o mapeamento de leituras e clique em concluir para executar a chamada de variantes nas leituras mapeadas.

Na análise de resequenciamento, selecione a detecção de variantes de baixa frequência e escolha o mapeamento de leituras a ser analisado. Clique em próximo e, em seguida, nos parâmetros de variante de baixa frequência, insira 0,01% e clique em próximo. Nos filtros gerais, defina a cobertura mínima como 1000 para garantir que a sequência tenha uma profundidade maior ou igual a 1000 x.

Por fim, clique em avançar e, em seguida, nas opções de saída, selecione criar tabela anotada e escolha um local para salvar o arquivo da tabela de variantes, clique em concluir e utilize as frequências das variantes nas regiões CPG anotadas na região de interesse a partir do arquivo da tabela de variantes para calcular a frequência da metilação de citosina em uma citosina de referência no contexto CG. As leituras de sequenciamento por amplicon de sulfito alinhadas corretamente à sequência de referência convertida se assemelharão às ilustradas na figura. Os dinucleotídeos CPG podem ser claramente identificados e os estados de metilação podem ser estimados observando-se as chamadas de bases nos sítios CPG. Nas leituras mapeadas, 0% de metilação resultará em leituras mapeadas contendo timina mapeada nos sítios CPG.

Controles de metilação a 100% resultarão em leituras mapeadas contendo citosinas mapeadas para sítios CPG. Neste experimento, RNA e DNA foram coisolados de um camundongo, cerebelo e retina. A expressão de opsinas, expressa seletivamente no tecido retiniano, foi então medida por QPCR, conforme esperado.

O RNA da opsina foi detectado apenas na retina após a quantificação dos níveis de metilação de CPG na região promotora da Opsina por sequenciamento após amplificação com bissulfito. No entanto, os níveis cumulativos de metilação ao longo da região promotora foram superiores a 80% no cerebelo, comparados a menos de 15% na retina. A quantificação de metilação por B SAS se beneficia da quantificação específica por sítio, permitindo a comparação dos níveis de metilação com base em CPG específico em qualquer região genômica dada.

De fato, neste experimento, observou-se que os níveis de metilação de CPG em todo o promotor da opsinina eram significativamente mais altos nas amostras cerebelares em comparação com as amostras de retina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a metilação de CPG em regiões-alvo de interesse a partir de DNA genômico isolado de tecidos ou células.