Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como capturar com sucesso imagens de super-resolução das sinapses imunológicas de células natural killer ou NK na bicamada lipídica suportada. Isso é feito construindo uma bicamada lipídica planar suportada por vidro contendo anticorpos contra o receptor ativador de células NK CD 16 em lâminas de câmara. As células NK previamente isoladas são então adicionadas à bicamada lipídica incorporada no anticorpo planar, seguida pela coloração das células com f actina e perforina.

A etapa final é a imagem das sinapses de células NK resultantes usando o microscópio em vez de, em última análise, a imagem da sinapse NK na bicamada lipídica suportada. O uso de stead mostra a sinapse da célula NK em detalhes aprimorados, o que permite a visualização da ultraestrutura do citoesqueleto de actina e grânulos líticos positivos posicionados sobre regiões de baixa densidade de actina F. Portanto, a base dessa técnica é que a barreira lipídica simples de suporte de vidro pode imitar a membrana positiva da célula de dobra, a proteína dessa barreira lipídica simples.

Eles podem se mover lateralmente, o que pode recapitular melhor a formação de uma sinapse imunológica muito logicamente relevante. Esta mensagem pode ajudar a responder aos principais cristãos no campo da imunologia, permitindo que os investigadores visualizem a formação de sinapses de maneira controlada com detalhes, o que é inatingível usando abordagens comerciais e microscópicas. Um bolsista de pós-doutorado em pintura e uma bolsa de pós-graduação demonstrarão o procedimento para montar a bicamada lipídica planar suportada por vidro.

Primeiro, prepare 100 mililitros de solução de piranha misturando peróxido de hidrogênio a 30% com ácido sulfúrico na proporção de um para três em um béquer nesta solução. Coloque duas lamínulas retangulares número 1,5 por 20 a 30 minutos enquanto as lamínulas estão sendo limpas. Recupere um tubo de lipídios DOPC de 400 micromolares previamente preparados e um tubo de lipídios de PE de biotina de 80 micromolares previamente preparados.

Transporte-os em gelo para o tanque de argônio após desoxigenar um novo tubo de microcentrífuga com argônio. Adicione o DOPC e o PE de biotina na proporção de um para um. O volume específico varia de acordo com as necessidades experimentais, mas deve ser de no mínimo dois microlitros.

Cada desoxigena o tubo de mistura e os tubos de reagentes individuais antes de retornar a escada ao refrigerador. Após a limpeza completa, enxágue bem as lamínulas com água destilada. Coloque as lamínulas para secar ao ar por alguns minutos e, em seguida, retire 1,5 microlitros da mistura de lipossomas e alíquotas em uma única gota em uma das câmaras de pista de uma lâmina de câmara.

O uso de duas quedas por pista é típico, mas não necessário. Agora, de forma rápida e eficiente, coloque a lamínula seca sobre as gotículas, certifique-se de que as gotas estejam suficientemente espaçadas para que não se fundam depois que a lamínula for colocada. Além disso, certifique-se de que as gotas permaneçam circulares e bem definidas sem tocar nas bordas das paredes da câmara.

Pressione firmemente entre e ao redor de cada pista para garantir uma vedação estanque entre a tampa. Deslize e deslize para marcar as posições das gotas usando uma caneta marcadora. Em seguida, passe 100 microlitros de invólucro aquoso a 5% pela câmara para bloquear a bicamada.

Tente certificar-se de que não há bolhas na câmara de fluxo. Em seguida, injete 100 microlitros de strept adin a uma concentração de 333 nanogramas por mililitro em cada pista. Depois de incubar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, lave passando três mililitros de pilhas de solução salina tamponada com albumina sérica humana a 1% em cada pista.

Para remover o excesso de tritina, adicione 100 microlitros de anti CD 16 marcado com fluorescência biotinilada na concentração de proteína previamente determinada conforme descrito no protocolo de texto após incubação no escuro por 20 a 30 minutos. Lave novamente passando três mililitros de solução salina tamponada com albumina sérica humana a 1% em cada pista. Em seguida, flua 100 microlitros de D biotina a uma concentração de 25 nanomolares através da câmara para ligar qualquer excesso de tabina STR e, assim, eliminar a chance de ligação não específica da tabina STR às células.

Em seguida, conte as células NK humanas e ressuspenda-as a uma concentração de 500.000 por mililitro em pilhas de solução salina tamponada com albumina sérica humana a 1%. Lave a biotina D para fora da câmara com mais três mililitros de pilhas de solução salina tamponada com albumina sérica humana a 1% por pista. Uma vez que as células tenham sido ressuspensas na concentração desejada, adicione 100 microlitros a cada pista.

Coloque a câmara em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius 5% por 30 a 60 minutos. Após este período de incubação, fixe as células com aldeído paraforme 4% à temperatura ambiente por 10 a 20 minutos. Lave passando três mililitros de solução salina tamponada com fosfato em cada pista para remover o aldeído paraforme.

Em seguida, adicione 400 microlitros de tampão de bloqueio antes de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, core a actina e a perforina adicionando dois microlitros de Phin diluído marcado com fluorescência e anticorpo monoclonal anti-perran marcado com fluorescência incube em temperatura ambiente por uma hora antes de lavar, passando três mililitros de solução salina tamponada com fosfato pela câmara. A câmara está pronta para o início da imagem.

Ligue todos os módulos de hardware necessários do microscópio de lugar. Inicie o software de análise de imagem e ative os módulos de varredura ressonante e de estabilidade. Depois de fazer essas seleções, aguarde cerca de três a cinco minutos para que o software seja iniciado.

Clique na guia de configuração na parte superior da tela, selecione configuração do laser. Em seguida, ligue a luz branca e os lasers de 592 nanômetros. Escolha a objetiva de 100 x e alinhe o feixe de laser de excitação com um laser de depleção de 592 nanômetros.

Selecione o módulo de configuração do laser, desligue o laser de depleção 592 e ligue o laser de depleção de 660 nanômetros. Coloque o slide sobre o palco sobre a lente. Focalize as células ligadas na região demarcada da bicamada, utilizando a lâmpada de luz branca e as oculares.

Em seguida, retorne à guia de aquisição diretamente à direita da guia de configuração. Clique na guia alternar para luz branca e, em seguida, ligue esse módulo e arraste a linha do laser de excitação para o comprimento de onda apropriado. Depois de selecionar o detector desejado e definir o intervalo de detecção, clique no botão sequencial na barra de ferramentas de aquisição à esquerda para abrir a caixa de diálogo de varredura sequencial na parte inferior da barra de ferramentas à esquerda.

Isso permite que o usuário adicione várias sequências, cada uma com um feixe de excitação diferente para uma cor diferente. Clique entre os quadros e defina o detector de frequência de excitação e a faixa de detecção para cada cor adicional. Depois que todas as configurações estiverem otimizadas, clique em iniciar para iniciar o processo de aquisição.

A imagem de estabilidade de cor tripla da sinapse de células NK na bicamada lipídica planar suportada por vidro mostra que o anticorpo anti CD 16 mostrado em vermelho se acumula na bicamada lipídica desencadeando a formação de actina F e a polarização e penetração da perforina mostrada em azul através da malha de f actina no painel focal. Usando essa abordagem combinada, pode-se observar de forma limpa os microaglomerados de anti CD 16 marcados com fluorescência dentro da bicamada lipídica suportada por vidro, que espelha diretamente o agrupamento de CD 16 na célula NK. Em comparação com a imagem confocal convencional, a estrutura do anel do aglomerado central do CD 16 é mais facilmente discernida na imagem do lugar devido à fluorescência ambiente esgotada.

Além disso, a ultraestrutura do citoesqueleto de actina é vista com resolução significativamente melhorada. Consistente com observações anteriores, os grânulos líticos positivos para perina são vistos posicionados sobre regiões de baixa densidade de actina F. Na imagem em vez disso, um detalhe crucial que se perde principalmente na imagem confocal Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em torno de quatro horas se feita corretamente durante a execução.

É importante lembrar de manter sua amostra desoxigenada deslocando repetidamente o oxigênio com argona e, ao montar a câmara, colocando rapidamente a lamínula sobre a amostra e imergindo-a na solução de revestimento.