Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

O objetivo geral deste procedimento é gerar um AA isolado versus um porto seguro, células-tronco pluripotentes induzíveis direcionadas ou clones IPSC que expressam GFP. Isso é feito primeiro entregando um AAVs uma garra e um plasma doador A VS um C-A-G-E-G-F-P Na segunda etapa, as células-alvo A a vs um são selecionadas por pur micina em células alimentadoras embrionárias de camundongos.

Em seguida, os clones individuais de GFP expressando um AA vs um são escolhidos em uma placa de 96 poços revestida com matrigel. Na etapa final, os clones AA VS G-F-P-I-P-S-C são expandidos com E oito técnicas de cultura IPSC médias e padrão. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência e a citometria de fluxo são usadas para mostrar a expressão uniforme e robusta de GFP em clones de IPSC humanos direcionados a AA VS um.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de colheita de colônias envolvem microdissecação de clones direcionados usando ferramentas especiais de coleta de colônias sob um microscópio, o que é difícil de aprender durante a instrução lado a lado. Comece lavando as culturas IPSC uma vez cada com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de reagente de dissociação celular suave a 37 graus Celsius a cada poço e incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos quando mais de 50% das células se dissociarem do vaso de cultura.

Use uma pipeta P 1000 para interromper mecanicamente quaisquer aglomerados de células remanescentes ou células anexadas. Em seguida, adicione dois mililitros de meio E oito a cada poço e use uma pipeta de 10 mililitros para desagregar ainda mais as culturas em suspensões de células únicas. Agora junte as células colhidas em um tubo cônico de 15 mililitros e gire-as para baixo.

Suspenda novamente o pellet em uma quantidade mínima de E oito meios para contagem. Então, depois de confirmar a viabilidade das culturas por exclusão de azul trian, bem como sua dissociação suficiente, transferiu 3 milhões de células para cada um dos dois tubos cônicos de 15 mililitros, enquanto as células de centrifugação definiram o sistema de eletroporação para o programa específico do tipo de célula para a linha de células-tronco embrionárias humanas H nove. Em seguida, adicione 10 microgramas do doador de recombinação homóloga sozinho a um pellet para a amostra de controle e 10 microgramas do plasmídeo doador de recombinação homóloga, juntamente com cinco microgramas de cada plasmídeo de garra para a amostra experimental.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução completa de transfecção de células primárias P três à temperatura ambiente a cada um dos pellets de controle e experimentais e ressuspenda as células. Transfira as amostras para cubetas individuais e, em seguida, coma as amostras imediatamente após a transfecção. Adicione 500 microlitros de meio E oito à temperatura ambiente a cada veterinário Q e, em seguida, transfira as amostras IPSC transfectadas gota a gota para pratos individuais de 10 centímetros contendo DR quatro fibroblastos embrionários de camundongo Antes de escolher as colônias, co-ensine bem uma placa de 96 poços com 50 microlitros de solução de matriz de membrana basal e, em seguida, armazene a placa durante a noite a quatro graus Celsius na manhã seguinte.

Quando a placa atingir a temperatura ambiente, aspirar o excesso de solução e carregar cada poço com 100 microlitros de meio E oito suplementado com 10 micromolares Y 2 7 6 3 2. Em seguida, coloque um microscópio invertido em um gabinete de segurança biológica e esterilize-o com um leve spray de etanol a 70%. Em seguida, coloque uma pipeta de pastagem de vidro sobre um bico de bunsen para criar uma ferramenta de coleta de colônias com um pequeno gancho na ponta após a esterilização com 70% de etanol.

Coloque o gancho no capô para secar e, em seguida, coloque a cultura IPSE no microscópio para colher os clones. Localize uma colônia adequada sob uma ampliação baixa e use a ferramenta de seleção de colônias para rastreá-la e dividi-la em quartos. Em seguida, raspe suavemente a colônia esquartejada do vaso de cultura e use uma pipeta P 200 ajustada para aproximadamente 30 microlitros para coletar os IPCs flutuantes que remetem as células diretamente para a matriz da membrana basal.

À medida que são colhidos, os IPCs devem se fixar dentro de duas a quatro horas após o revestimento. Finalmente, incube as colônias colhidas durante a noite a 37 graus Celsius e refresque as células com meio E oito completo na manhã seguinte. É importante transfectar apenas PSCs I de alta qualidade durante todo o experimento.

As culturas IPSC devem conter principalmente colônias distintas com uma morfologia semelhante a paralelepípedos, pois as células vistas aqui e as células diferenciadas não devem ser superiores a 10% da cultura, a capacidade de transfecção dos IPCs pode ser avaliada e otimizada usando o pequeno vetor PAX GFP, pois a transfecção com PAX GFP normalmente representa a eficiência máxima alcançável devido ao seu pequeno tamanho. A expressão transitória de um A VS VS um C-A-G-E-G-F-P intel e IPCs transfectados atinge o pico em 48 a 72 horas após a transfecção, o que pode ser confirmado com uma pequena porção de células transfectadas por citometria de fluxo. A eficiência da transfecção pode variar muito.

Mesmo em experimentos com uma fração positiva de GFP é de apenas 10% Os clones individuais que exibem uma fluorescência uniforme devem ser grandes o suficiente para a coleta de colônias após a seleção de micina pura. Além disso, uma vez no formato de 96 poços, os clones IPSC direcionados expandidos devem exibir uma expressão estável e uniforme de GFP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar I PSCs de forma eficiente por afecção nuclear e como isolar AV um porto seguro.

Clones IPSE direcionados usando ferramentas de seleção de colônias.