Name: Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a editar o genoma de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando TALEN no locus AAVS1 para integração direcionada de GFP. Este protocolo permite gerar clones estáveis com expressão uniforme do marcador.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada pelo Fundo Comum do NIH e pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Artrite, Doenças Musculoesqueléticas e de Pele.

1. Preparação da Membrana Basal Matrix e Revestimento de Plasticware <ol><li> Colocar a membrana basal estoque matriz congelada de -20 ° C em gelo e descongelar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Após o descongelamento, pipeta 2 mg alíquotas de matriz da membrana basal em tubos Eppendorf de pré-refrigerados. Armazenar estes a -20 ° C até ser necessário. </li><li> Para preparar placas revestidas com matriz da membrana basal, descongelar uma alíquota sobre o gelo até o último pedaço de gelo nas desaparece tubo eppendorf (geralmente dentro de ~ 2 horas). </li><li> Após a descongelação, adicionar matriz da membrana basal para 12 ml de frio (4 ° C) DMEM / F12 para fazer a solução de revestimento de matriz de membrana basal. </li><li> Adicionar solução de matriz da membrana basal para o recipiente de cultura apropriado. Para uma placa de 6 poços, dispensar 1 ml por poço. Agitar a placa para garantir que a solução de matriz membrana basal cobre completamente cada poço. </li><li> Parafilm selar a membrana basal revestida de matriz placa / prato, e incubar a room temperatura durante 1 hora antes da utilização. Alternativamente, placas revestidas com matriz da membrana basal store / pratos a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de revestimento. NOTA: Adicionar DMEM adicional / F12 para a membrana basal revestida de matriz placa / recipiente para evitar a secagem. Antes de usar 4 ° C membrana basal armazenado revestido de matriz placa / prato, coloque-o em uma cabine de segurança biológica e deixe-o voltar à temperatura ambiente por pelo menos 30 min. </li><li> Aspirar matriz da membrana basal completamente antes da adição de meio e células. </li></ol> 2. Preparação de meio E8 <ol><li> Prepare E8 meio de cultura por degelo suplemento E8 durante a noite a 4 ° C. </li><li> Retirar 10 ml de E8 meio basal do estoque de 500 ml e descarte. </li><li> Pipeta todo o frasco de 10 ml de suplemento E8 diretamente em 490 ml de E8 meio basal. Do meio E8 completa não quente em um banho de água a 37 ° C, como flutuações de temperatura repetidas pode degradar a bFGF no complemédio te E8. </li><li> Use meio E8 completa dentro de 2 semanas de adição do suplemento. </li></ol> 3. O descongelamento de iPSCs <ol><li> Retire um frasco de iPSCs congelados de nitrogênio líquido e colocar no gelo seco. </li><li> Descongelar rapidamente o frasco num banho de água a 37 ° C; agite o frasco em banho-maria até que apenas um pequeno fragmento de restos de gelo. </li><li> Pulverizar o frasco com etanol 70% e transferência para uma cabine de segurança biológica. </li><li> Adicionar 1 ml da temperatura ambiente, gota a gota E8 forma directamente para o frasco. </li><li> Usando uma pipeta de 2 ml, gota a gota, transferir a suspensão de células em 9 ml de meio E8 em um tubo de 15 ml. Agitar o tubo de frequência para garantir que as células e o meio de misturar bem rapidamente. </li><li> Centrifuga-se as células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em um volume apropriado de E8 suplementado com 10 uM Y-27632. </li><li> Adicionar as células a um número apropriado de porão membranpoços e revestido matriz, e coloque em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante a noite. Recomenda-se para a chapa, pelo menos, 0,2 x 10 6 iPSC por poço de uma placa de 6 poços para permitir a recuperação rápida após a descongelação. </li></ol> 4. Manutenção e Passaging Rotina de iPSCs <ol><li> Refresque médio E8 diária. </li><li> Monitorar a morfologia e de confluência de células com um microscópio invertido. iPSCs de alta qualidade crescer em colónias planas com aréolas distintas; colónias individuais possuem uma aparência de &quot;paralelepípedos-like&quot;. </li><li> Passagem as células IPSCs quando atingem ~ 70% de confluência. </li><li> Prepara-se uma solução de EDTA passaging adicionando 0,9 g de NaCl e 500 ul de EDTA 0,5 M a 500 ml de DPBS. Misture bem para dissolver de NaCl, e filtra-se sob vácuo para esterilizar. Aquecer-se uma alíquota da solução em uma passagem em 37 ° C num banho de água, antes da passagem em. </li><li> Para passagem, aspirado de meio de cultura gasto e lave as células uma vez com um volume igual de pas quentessolução Saging. Aspirar, e pipeta de EDTA suficiente de solução para revestir as passagens em células (1 ml por poço de uma placa de 6 poços). </li><li> Coloque as células em um microscópio invertido e observar as colônias da IPSC. O aparecimento de buracos dentro de colônias e bordas elevadas devem se manifestar dentro de 2 a 5 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente a solução EDTA passaging. </li><li> Utilizando uma pipeta de 10 ml, dispensar 4 ml de meio E8 (se usar uma placa de 6 poços), sob alta pressão directamente em cada cavidade a ser passadas. </li><li> Recolher os aglomerados IPSC, e dividida em um número adequado de poços, dependendo da razão de divisão de 1: 8 a 1:12. Não excesso de pipeta, como a desagregação de aglomerados de células resultará na viabilidade pobres. </li><li> Coloque a placa em uma incubadora, e balance a placa de volta-e-vem e lado-a-lado várias vezes para dispersar as células. </li></ol> 5. Preparação de MEFs e iPSCs para Tansfection <ol><li> 48 horas antes da transfection, iPSCs passagem em ~ 1: 6 em quatro ou mais poços de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços, de modo que será de 70% confluentes, portanto, dois dias. </li><li> No dia seguinte, descongelar DR4 MEFs em meio MEF consistindo de DMEM (alto teor de glucose) suplementado com 10% de FBS e 1x MEM-NEAA. </li><li> Placa DR4 MEFs em duas placas de 10 cm a 2 x 10 ~ 4 células / cm2 e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> No dia da transfecção, alterar forma MEF a E8 suplementado com 10 uM Y-27632 30 min antes de efectuar a transfecção em iPSCs. </li><li> Opcional: Se a análise de citometria de fluxo de iPSCs pós-transfecção é desejado, remover uma placa revestida com matriz de membrana basal a partir de 4 ° C e coloca à temperatura ambiente. </li><li> Opcional: 4 horas antes da transfecção, complementar pré-cultura iPSC transfecção com Y-27632 na concentração final de 10 uM. </li></ol> 6. delicado de células dissociação Reagente um tratamentond transfecção de iPSCs usando um sistema de electroporação <ol><li> Remoção da solução primária P3 transfecção de células a partir de 4 ° C e deixar que esta atinja a temperatura ambiente durante ~ 30 min. Adicionar todo o suplemento de 100 ul para a solução de transfecção antes da utilização. </li><li> Reagente dissociação Warm-célula suave em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Obter AAVS1 TALENS (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) e AAVS1-CAG-EGFP doador de -20 ° C. </li><li> Remover iPSCs da incubadora e lavar uma vez com DPBS. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente de dissociação de células por poço suave, e incubar iPSCs a 37 ° C durante 5 minutos, ou até maior do que 50% das células foram dissociadas a partir do vaso de cultura. </li><li> Pipeta as células para cima e para baixo algumas vezes usando uma pipeta P1000 dissociar as células restantes a partir do vaso de cultura, e para quebrar aglomerados da IPSC. </li><li> Adicionar 2 ml de meio a cada poço E8, e pipeta cima e para baixo várias vezes, utilizando uma pipeta de 10 ml de Further desagregar aglomerados de células em células individuais NOTA: A eficiência de transfecção declina significativamente se aglomerados de células não são suficientemente desagregada. </li><li> Recolhe iPSCs em um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 xg durante 3 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em uma quantidade mínima de meio E8. </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro, após aplicação de um corante vital, tal como 0,4% de azul de Tripano. Certifique-se de que as células são suficientemente dissociado durante a contagem (1-3 células por &quot;moita&quot;). </li><li> Dispensar 3 x 10 6 células em cada um de dois tubos de 15 mL cónico, e girar para baixo outra vez a 100 xg durante 3 min. NOTA: centrifugação a baixa velocidade reduz o estresse celular e permite fácil re-suspensão de iPSCs antes eletroporação. </li><li> Ajuste o sistema de eletroporação para o programa específico para o tipo de célula para a linha de células-tronco embrionárias humanas H9 (Programa CB-150). </li><li> Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante do cell peletes. Para uma pastilha, adicionam-se 10 ug do doador RH como amostra de controlo. Para o outro sedimento adicionar 10 ug do doador HR, juntamente com 5 ug de cada TALEN (PZT-AAVS1-L1 e PZT-AAVS1-R1) como amostra experimental. </li><li> Ressuspender cada pelete de células em 100 ul de solução de transfecção de células primárias P3, e transferir para uma cuvete. </li><li> Realize a transfecção e imediatamente adicionar 500 mL de meio E8 temperatura ambiente em cada cubeta. </li><li> Transfira o iPSCs gota a gota a uma transf 10 cm prato contendo MEFs DR4 preparados no passo 5.4. </li><li> Opcional: Adicionar várias gotas de cada experiência para um poço de uma membrana basal revestida de matriz placa de 6 poços se citometria de fluxo anaylsis de eficiência de transfecção é desejado. </li><li> Repita os passos de 6,15-6,17 para terminar ambas as amostras. No dia seguinte, lavar as células duas vezes com DPBS e alternar o meio de cultura para NutriStem, que parece apoiar cultura iPSC em alimentadores melhor do que E8. </li><li> Trpicos de expressão EGFP Ansient em 48-72 horas pós-transfecção; avaliar a eficiência de transfecção quanto desejado. </li></ol> 7. A puromicina Selecção de iPSCs alvejados <ol><li> Comece a selecção de puromicina 72 h após a transfecção, quando as iPSCs alcançar 70% de confluência. </li><li> Para NCRM5 iPSCs, começam selecção puromicina a 0,5 ug / ml de puromicina (1/2 da dose completa) diluída em meio de cultura NutriStem. A concentração óptima pode variar puromicina 0,25-1 ug / MLL para algumas linhas de IPSC. </li><li> IPSCs Cultura em NutriStem + 0,5 ug / ml ï¿½puromicina durante 3 dias, refrescando o meio dia. </li><li> Após 3 dias, aumentar a concentração de puromicina a 1 ug / ml. </li><li> IPSCs Cultura nos termos de 1 mg / ml seleção ï¿½puromicina por mais 7-8 dias, ou até colônias distintas aparecem grande o suficiente para colônia de picking. </li></ol> 8. Colony Picking e Expansão das iPSCs Targeted <ol><li> Membrana basal Usematriz para revestir uma placa de 96 poços por dispensar 50 ul de solução de revestimento de matriz de membrana basal (2 mg de matriz de membrana basal diluídos em 12 ml de DMEM / F12) para cada poço. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite antes da utilização. </li><li> Depois de se deixar a placa revestida com matriz de membrana basal para voltar à temperatura ambiente, aspirar a matriz da membrana basal e dispensar 100 ul E8 suplementado com 10 uM Y-27632 para cada poço. </li><li> Coloque um microscópio invertido em uma cabine de segurança biológica, e pulverizar levemente com etanol 70% para esterilizar. </li><li> Retire uma pipeta de Pasteur de vidro ao longo de um bico de Bunsen para obter uma ferramenta ideal colónia-colheita que tem um pequeno &quot;gancho&quot; na ponta. Esterilizar com etanol 70%, e coloque na capa para secar. </li><li> Remova a placa contendo as colónias IPSC orientadas a partir do incubador, e colocar dentro do capuz sob o microscópio. </li><li> Escolha iPSCs traçando um círculo em torno da fronteira colônia com a ferramenta de colheita colônia.</li><li> Usar o &quot;gancho&quot; da ferramenta colónia-colheita para raspar suavemente e remover a colónia iPSC da superfície da placa. Para grandes colônias, desenhando um X com a ferramenta de colheita colônia de trimestre a colônia irá facilitar o crescimento das células após a re-regulamentação. </li><li> Uma vez que aglomerados de células são separadas e livremente flutuante, use uma pipeta p200 definido para ~ 30 ul para recolher as iPSCs. Células directamente para a placa de 96 poços de placa. </li><li> Opcional: utilizar uma pipeta de p20 definida como ~ 5 mL para recolher as iPSCs para um tubo eppendorf, em seguida, adicionar 50 ul de reagente de dissociação de células suave para digerir durante 5 min a 37 ° C. Após a digestão, adicionar 500 ul meio E8 para dentro do tubo eppendorf para diluir o reagente de dissociação de célula suave e girar para baixo as células a 200 xg numa microcentrífuga de bancada padrão durante 5 min. Em seguida, aspirar a maior parte do meio e deixar ~ 30 ul para ressuspender as células e transferir para a placa de 96 poços. NOTA: Esteabordagem facilitará a dissociação do aglomerado de células e rápida expansão da colônia colhidos. </li><li> Continuar colónia colheita até que um número suficiente de colónias IPSC foram recolhidos (aproximadamente 20-30 colónias por experimento é recomendado). </li><li> Após a colheita de colónias, colocar a placa de 96 poços numa incubadora durante a noite. Refresque-se com meio completo E8 no dia seguinte, e da cultura até ~ 70% confluentes. </li><li> Células de passagem de 96 poços em um de 24 poços, em seguida, em um de 6 poços, como descrito nos passos 4,5-4,10. NOTA: os volumes de solução de EDTA e meio E8 deve ser proporcionalmente reduzida ao utilizar poços mais pequenos do que uma placa de 6 poços. </li><li> Avaliar segmentação sucesso por junção PCR e Southern blot para confirmar a integração cassete alvejado e ausência de vetores inseridas aleatoriamente 16. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+and+the+safety+of+embryonic+stem+cell-derived+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts.</a> Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust%2C+persistent+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+is+achieved+with+AAVS1-targeted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration.</a> Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+tailoring+of+cassette+design+for+sustainable+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer.</a> Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).</li>
<li>Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+insulator+in+AAVS1%2C+a+preferred+region+for+integration+of+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA.</a> J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+for+Lesch-Nyhan+disease+by+gene+targeting+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+a+disease-related+gene+in+human+induced+pluripotent+stem+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activator-like+effector+toolbox+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering.</a> Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein+Expression+After+Differentiation+and+Transplantation+of+Reporter+Human%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+by+AAVS1+Transcription+Activator-Like+Effector+Nucleases.+Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human.</a> Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).</li>
<li>Zou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidase-deficient+neutrophils+from+X-linked+chronic+granulomatous+disease+iPS+cells%3A+functional+correction+by+zinc+finger+nuclease-mediated+safe+harbor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting.</a> Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).</li>
<li>Luo, Y., Rao, M., Zou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+GFP+Reporter+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+AAVS1+Safe+Harbor+Transcription+Activator-Like+Effector+Nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).</li>
<li>Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.stembook.org/node/1438">http://www.stembook.org/node/1438</a> (2008-2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para a geração bem sucedida de AAVS1 porto seguro alvejado iPSCs humanos são: (1) a entrega eficiente TALEN e doadores plasmídeos em iPSCs por transfecção; (2) optimização de dissociação iPSCs em células individuais antes da transfecção e chapeamento densidade após transfecção; (3) a optimização da dose e do tempo de selecção de droga com base no crescimento da linha iPSC; (4) cuidadosamente dissecar e escolhendo colônias direcionados e transferindo a nova placa / poço. Em comparação com métodos ...

A capacidade de reprogramar células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas semelhantes a células-tronco embrionárias (iPSCs) foi descoberto pela primeira vez por Takahashi et al., Em 2007 1. Fibroblastos dérmicos humanos transduzidas com retrovírus expressando quatro fatores de transcrição (The Yamanaka assim apelidado fatores OCT3 / 4, Sox2, foram mostradas c-Myc, e KLF4) ser altamente semelhante às células estaminais embrionárias humanas (hESCs) com base na morfologia, a proliferação, a expressão do gene, e estado epigenética; crucialmente, iPSCs também são capazes de se diferenciarem em células de todas as três camadas germinais 1. A capacidade potencial e diferenciação proliferativa das iPSCs torna ferramentas muito atraentes; reprogramando as células de pacientes que sofrem de doenças específicas, iPSCs pode ser utilizado tanto como em sistemas modelo in vitro da doença e como potenciais agentes terapêuticos. Para este último efeito, várias questões devem ser abordadas antes de todo o potencial das iPSCsem um ambiente clínico pode ser realizado; o potencial tumorigénico de hESCs cultivadas in vitro e iPSCs, o uso de derivados de xenogénicas durante reprogramação e manutenção de células, e a necessidade de rastrear células transplantadas in vivo de todos os obstáculos cruciais para a aplicação clínica de células estaminais pluripotentes (Avaliado por Hentze et al. 2). Uma solução ideal para a necessidade de rastrear células diferenciadas pós-transplante envolveria um marcador visualmente detectável que resiste ao silenciamento e variegação, independentemente da aplicação. Expressão robusta e sustentada de transgenes integrados é o mais prontamente possível quando DNA exógeno é introduzido no porto seguro loci; isto é, locais genómicos que permitem a transcrição de um vector suficiente integrado, enquanto ao mesmo tempo atenuar as perturbações de expressão de genes vizinhos 3. Um tal local que tem sido muito bem caracterizada, desde a sua descoberta, é a integr vírus adeno-associadoção local 1 (AAVS1), no primeiro intrão 1 do regulador 12C subunidade (PPP1R12C) do gene da proteína fosfatase. Este local foi mostrado não só para permitir sustentada e expressão robusta de transgenes integrados através do tempo estendido na cultura e na diferenciação vitro 3, mas também para proteger circundante genes de perturbação da transcrição 4; ambas as características são provavelmente devido à presença de elementos isoladores de cromatina endógenas que flanqueiam o local AAVS1 5. Os avanços na engenharia ferramentas genoma durante apenas a última década, têm muito facilitada a facilidade e eficiência com que as manipulações genéticas em qualquer tipo de célula pode ser conseguido. Embora experiências bem sucedidas iniciais invocado extremamente baixos níveis de recombinação homóloga endógena (RH) com um doador introduzidas para se abordagem selectiva de genes em 6,7 CES, o uso de nucleases específicas do local, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs), que signivamente induzir a recombinação homóloga através da geração de uma quebra de cadeia dupla de DNA tem aumentado consideravelmente a eficiência de tais experiências 8,9. O reaproveitamento de ambos os ativadores de transcrição-como efetoras (contos) da planta patogênica xanthomonas gêneros e os procariotas cluster regularmente interspaced repete palindrômicas curtas (CRISPR) system / Cas9 em eficientes nucleases grife específicas do local fez gene alvo em células-tronco pluripotentes uma acessível e metodologia praticável 10-13. Um artigo recente descreveu um método eficiente para a integração estável de uma cassete repórter fluorescente no AAVS1 porto seguro locus iPSCs humanos utilizando nucleases Tale (TALENS) 14. Essas iPSCs direcionados mantiveram sua fluorescência mesmo após a diferenciação direcionado para cardiomiócitos e transplante em um modelo de rato de infarto do miocárdio (MI), proporcionando uma forte evidência para a utilidade de talestavelmente células estaminais pluripotentes fluorescente 14. Para obter colónias específicas, um método gene armadilha foi utilizado em que um aceitador de splicing (SA), 2A sequência do péptido de auto-clivagem coloca a puromicina N-acetil-transferase gene (PAC) sob o controlo do promotor endógeno PPP1R12C; assim, apenas iPSCs que tenham incorporado o ADN dador no locus AAVS1 expressar PAC, tornando-os selecionáveis ​​baseado em puromicina-resistência; (Figura 1, 15). Este protocolo detalha os procedimentos de geração de AAVS1-GFP iPSCs relatado no recente documento 14, incluindo o processo de transfecção de iPSCs com TALENS e um doador de 9,8 kb para integrar um fragmento de DNA 4.2kb no locus AAVS1 porto seguro, a seleção de iPSCs com base em picking colônias para a expansão clonal ï¿½puromicina-resistência, e. As técnicas aqui descritas podem ser aplicadas a diversos experimentos de engenharia genoma.

<table><tbody><tr><td>Matriz de membrana basal com fator de crescimento reduzido (TFG) Matrigel, *sem LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Armazene a -20 °C.</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Loja em 4 ° C.</td></tr><tr><td>Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente Costar</td> 6 <td>Well Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Armazene o meio basal a 4 °C. Armazene o suplemento a -20 °C.</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Armazenar em temperatura ambiente. Uma vez dissolvido em H2O, conservar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Armazene em nitrogênio líquido.</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal definido, origem americana</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar a 4 °C; C durante a noite e alíquota. Armazene alíquotas em -20 &deg; C até que seja necessário.</td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Unidade de núcleo 4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>parte do sistema de eletroporação</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>parte do sistema de eletroporação</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>Ao chegar, remova a solução de célula primária e suplemente e armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular Accutase StemPro</td> Life <td>Technologies</td><td>A1110501</td><td>Armazenar a -20 &deg;C. Descongele durante a noite a 4&deg; C e aqueça uma alíquota em um 37 &deg; C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Meio de Cultura</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Armazene a -20 &deg;C. Descongele durante a noite a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 e pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 e 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Doador de recombinação homóloga</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Armazenar a -20 >C. Preparar alíquotas de trabalho de 1 mg/ml em ddH2O.</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro borossilicato descartáveis Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (refrigerado), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &times; rotor de balde oscilante de 750 ml</td> Solução <td>azul de 75003607</td><td></td><td>Trypan</td></tr><tr><td>da Thermo Scientific, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection, seleção e colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes células-tronco talen-alvo com um gene gfp no aavs1 safe harbor

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

A adição de transgene direcionada pode fornecer expressão gênica persistente enquanto contorna o silenciamento de genes e a mutagênese insercional causada pela integração aleatória mediada por vetores virais. Este protocolo descreve uma plataforma de adição direcionada a transgenes universal e eficiente em iPSCs humanas com base na utilização de TALENs de código aberto validados e um doador semelhante a uma armadilha de genes para entregar transgenes em um locus de porto seguro. É importante ressaltar que a edição gênica eficaz é limitada pela eficiência de entrega dos vetores de edição de genes. Portanto, este protocolo se concentra primeiro na preparação de iPSCs para transfecção para alcançar alta eficiência de entrega nuclear. Quando as iPSCs são dissociadas em células únicas usando um reagente de dissociação de células suaves e transfectadas usando um programa otimizado, >50% das células podem ser induzidas a absorver os grandes vetores de edição de genes. Como o locus AAVS1 está localizado no íntron de um gene ativo (PPP1R12C), um gene resistente à puromicina (PAC) ligado ao aceitador de splicing (SA) foi usado para selecionar iPSCs direcionados, excluindo células somente de integração aleatória e não transfectadas. Essa estratégia aumenta muito a chance de obter clones direcionados e também pode ser usada em outros experimentos de direcionamento de genes ativos. Duas semanas após a seleção da puromicina na dose ajustada para a linha específica de iPSC, os clones estão prontos para serem colhidos por dissecação manual de colônias grandes e isoladas em pedaços menores que são transferidos para meio fresco em um poço menor para maior expansão e triagem genética e funcional. Pode-se seguir este protocolo para obter prontamente várias linhas de iPSC repórter GFP que são úteis para imagens in vivo e in vitro e isolamento celular.

A visualização do protocolo é fornecido na Figura 2, com períodos em que iPSCs são cultivados em meio diferente destaque por qualquer verde para E8 ou azul para NutriStem. É importante para transfectar apenas iPSCs de alta qualidade; examinar placas de cultura em toda a manutenção de rotina e verificar que as culturas IPSC conter colônias principalmente distintos portadores de uma morfologia de paralelepípedos-like (Figura 3A); células diferenciadas não deve ocupar mais do que 10% da cu...

A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um isolado AA versus um local seguro, clones de células-tronco pluripotentes induzíveis ou IPSCs direcionados expressando GFP. Isso é realizado primeiramente por meio da entrega eficiente de plasmídeos doadores AAVs um talons e um A VS um C-A-G-E-G-F-P nas IPSCs por nucleofecção. Na segunda etapa, as células direcionadas A a vs um são selecionadas com puromicina em células de apoio embrionárias de camundongo.Em seguida, os clones individuais de A A VS um que expressam GFP são isolados e transferidos para uma placa de 96 poços revestida com Matrigel. Na etapa final, os clones de A A VS um G-F-P-I-P-S-C são expandidos com meio E oito e técnicas padrão de cultivo de IPSCs. Por fim, a microscopia de imunofluorescência e a citometria de fluxo são utilizadas para demonstrar a expressão uniforme e robusta de GFP em clones de IPSCs humanos direcionados ao A A VS um.A demonstração visual deste método é essencial, pois as etapas de seleção de colônias envolvem a microdissecção de clones-alvo utilizando ferramentas especiais de seleção de colônias sob microscópio, o que é difícil de aprender durante instruções lado a lado. Comece lavando as culturas de IPSC uma vez com PBS. Em seguida, adicione um mililitro do reagente de dissociação celular suave a 37 graus Celsius a cada poço e incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos, quando mais de 50% das células tiverem se dissociado do recipiente de cultura.Use uma pipeta P1000 para disruptar mecanicamente quaisquer agregados celulares remanescentes ou células aderidas. Em seguida, adicione dois mililitros de meio E8 a cada poço e utilize uma pipeta de 10 mililitros para desagregar ainda mais as culturas em suspensões de células isoladas. Agora, reúna as células colhidas em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue-as.Re-suspenda o pellet em uma quantidade mínima de meio E eight para contagem. Em seguida, após confirmar a viabilidade das culturas pelo teste de exclusão com trian blue, bem como sua dissociação adequada, transfira 3 milhões de células para cada um de dois tubos cónicos de 15 mililitros, enquanto as células estão sendo centrifugadas, configure o sistema de eletroporação para o programa específico do tipo celular para a linhagem de células-tronco embrionárias humanas H nine. Em seguida, adicione 10 microgramas do doador de recombinação homóloga sozinho a um pellet para a amostra controle e 10 microgramas do plasmídeo doador de recombinação homóloga, juntamente com cinco microgramas de cada plasmídeo talon para a amostra experimental.Em seguida, adicione 100 microlitros de solução completa de transfeção de células primárias P3 à temperatura ambiente a cada um dos pellets controle e experimentais e ressuspenda as células. Transfira as amostras para cubetas individuais e, em seguida, ate as amostras imediatamente após a transfeção. Adicione 500 microlitros de meio E8 à temperatura ambiente a cada cubeta e, então, transfira as amostras de iPSC transfectadas gota a gota para placas individuais de 10 centímetros contendo fibroblastos embrionários de camundongo DR4. Antes de selecionar as colônias, recubra bem uma placa de 96 poços com 50 microlitros de solução de matriz da membrana basal e, em seguida, armazene a placa durante a noite a quatro graus Celsius na manhã seguinte.Quando a placa atingir a temperatura ambiente, aspire a solução em excesso e adicione 100 microlitros de meio E eight suplementado com 10 micromolar de Y 2 7 6 3 2 em cada poço. Em seguida, coloque um microscópio invertido dentro de uma cabine de segurança biológica e esterilize-o com uma leve pulverização de etanol 70%. Depois, posicione uma pipeta de vidro do tipo pasture sobre uma chama de bico de Bunsen para criar uma ferramenta de coleta de colônias com um pequeno gancho na ponta, após esterilizá-la com etanol 70%.Coloque o gancho na capela para secar e, em seguida, posicione a cultura de IPSE sobre a platina do microscópio para colher as colônias. Localize uma colônia adequada em baixa ampliação e use a ferramenta de coleta para traçar e dividir a colônia em quatro partes. Em seguida, raspe suavemente a colônia dividida do recipiente de cultura e use uma pipeta P200 ajustada em aproximadamente 30 microlitros para recolher os IPCs flutuantes, semeando as células diretamente na matriz da membrana basal.À medida que são colhidos, os CIPs devem aderir entre duas e quatro horas após o plaqueamento. Por fim, incubar as colônias selecionadas durante a noite a 37 graus Celsius e renovar as células com meio E oito completo na manhã seguinte. É importante transfectar apenas CIPs de alta qualidade durante todo o experimento.As culturas de IPSC devem conter principalmente colônias distintas com morfologia semelhante a ladrilhos, como as células vistas aqui, e as células diferenciadas não devem representar mais de 10% da cultura. A capacidade de transfeção dos IPCs pode ser avaliada e otimizada utilizando o pequeno vetor PAX GFP, pois a transfeção com PAX GFP geralmente representa a eficiência máxima alcançável devido ao seu tamanho reduzido. A expressão transitória de um A VS one C-A-G-E-G-F-P intel nos IPCs transfectados atinge seu pico entre 48 e 72 horas após a transfeção, o que pode ser confirmado com uma pequena porção das células transfectadas por citometria de fluxo. A eficiência de transfeção pode variar bastante.Até mesmo em experimentos com A, uma fração positiva para GFP é de apenas 10%. Clones individuais que exibem fluorescência uniforme devem ser grandes o suficiente para a seleção de colônias após a seleção com micina. Além disso, uma vez no formato de 96 poços, os clones de iPSCs direcionados expandidos devem exibir expressão estável e uniforme de GFP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar iPSCs de forma eficiente por meio da nucleofecção e de como isolar o sítio seguro AV1.Clones de IPSE direcionados utilizando ferramentas de seleção de colônias.

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Este vídeo descreve uma técnica precisa de edição de genoma em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCs, usando TALENs para criar quebras de fita dupla em um locus direcionado, induzindo reparo direcionado por homologia para integração de genes de proteínas de fluorescência.

Integração de genes direcionados mediada por TALEN: usando nucleases específicas de sequência projetadas para a inserção precisa do gene da proteína fluorescente em hiPSCs

Descrevemos um protocolo para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de fatores reprogramadas e caracterizadas baseadas em lentivirais e conversão em condições putativas de grau clínico.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Aqui relatamos um método de edição gene rápida e eficiente com base em RMCE no locus AAVS1 de humanos pluripotentes células estaminais (hPSCs) que melhora a sistemas descritos anteriormente. Usando esta técnica, linhas isogênicas pode ser rápida e confiável gerada para estudos comparativos adequados, facilitar a investigação mediada por transgênese com hPSCs.

Geração rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes Recombinante Humana pela recombinase mediada troca cassete no<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

Aprenda a editar o genoma de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando TALEN no locus AAVS1 para integração direcionada de GFP. Este protocolo permite gerar clones estáveis com expressão uniforme do marcador.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor (Vídeo) | JoVE Journal

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Explorar mais vídeos