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DOI: 10.3791/52505-v
Nurit P. Azouz1,2, Mitsunori Fukuda3, Marc E. Rothenberg2, Ronit Sagi-Eisenberg1
1Department of Cell and Developmental Biology,Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics,Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences,Graduate School of Life Sciences, Tohoku University
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O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.
O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento de mastócitos, grânulos secretores e citose. Isso é feito pela primeira transecção de mastócitos com um gene repórter para exocitose, bem como um gene de interesse. O segundo passo é avaliar o efeito do gene testado na exocitose, estimulando as células e monitorando o sinal fluorescente do gene repórter durante a exocitose.
Em seguida, o efeito do gene testado na geração e desenvolvimento de grânulos secretores de mastócitos é avaliado por imagens confocais do gene repórter localizado nos grânulos secretos. A etapa final é realizar a análise morfométrica dos grânulos secretores. Em última análise, a marcação de fluorescência de grânulos secretores de mastócitos usando um gene repórter é usada para mostrar alteração nos mastócitos, desenvolvimento de grânulos secretores e sua exocitose.
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