Name: Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Aprenda a investigar a exocitose em mastócitos usando genes repórter fluorescentes e imagem confocal. Este método permite analisar a morfologia dos grânulos secretores em tempo real.

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Agradecemos ao Dr. U. Ashery pelo dom da NPY-MRFP cDNA. Agradecemos Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein para ajuda inestimável com microscopia e análise de imagem. Agradecemos também o Dr. Joseph Orly para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Israel Ciência, fundada pela Academia de Ciências de Israel (1139/12 a RS-e.).

1. Preparação de células RBL Meios de Cultura <ol><li> Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado de baixo teor de glucose de Dulbecco (DMEM) com 56 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 10% de FBS), e, em seguida, adicionar 5,5 ml de penicilina estreptomicina (isto faz ~ 1% PEST). </li><li> Filtrar a mídia usando 500-1.000 ml Bottle-Top Filtros de vácuo com 0,22 tamanho dos poros e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cultura de Células RBL <ol><li> Cultivar células RBL em uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C quer em placas ou frascos. Células RBL que estão crescendo em placas de 10 cm deve ser suplementado com 10 ml de meio e formar monocamada confluente de ~ 10 7 células / placa. </li><li> Quando a camada celular se aproxima confluência, replate a cultura a uma densidade inferior. <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / frasco, utilizando uma pipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37° C) de 0,25% de tripsina / EDTA, que cobre toda a monocamada (o volume depende do tamanho da placa de cultura / frasco; 2 ml para placa de 10 cm). Isto vai separar as células. </li><li> Alternativamente, lavar a monocamada de células com tampão de fosfato salino (PBS), remover o PBS e adicionar pré-aquecido (37 ° C) de tripsina / EDTA. Este passo separa as células mais rapidamente. </li><li> Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). </li><li> Inspecione as células ao microscópio óptico para verificar se eles têm destacado. Se as células não se separar após 10 min, bater suavemente na placa / balão. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume do meio deveria ser de pelo menos 2 vezes maior do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Agregar as células por centrifugação durante 3 minutos a 200 g a 25 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio. Dilui-se as células por 1:10 e sementes de uma nova placa de cultura. Incubar as células durante 48-72 horas, até que eles REACh aproximadamente 90% de confluência. </li><li> Repita o mesmo procedimento (seção 2.2.1-2.2.8) para até 3 meses (30 passagens). </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Transfection Mídia. <ol><li> Prepara-se uma solução 100 mM de K-Tubos de pH 7, de solução de 1 mM de Ca2 + de etilo e solução 100 mM de acetato de Mg 2+. </li><li> Dilui-se a solução 100 mM de K-pipes pH 7 em 20 mM utilizando meio DMEM, adicionar a solução de 1 mM de Ca2 + de etilo até uma concentração final de 10 uM e solução 100 mM de acetato de Mg 2+ para uma concentração final de 2 mM. </li><li> Pesar glutamato de potássio e adiciona-se à solução a uma concentração final de 128 mM, misturar bem e manter a 4 ° C até à sua utilização. Manter as soluções restantes (isto é., K-Tubos, Ca 2+ acetato, Mg 2+ de etilo) a -20 ° C. </li></ol> 4. transfecção de células RBL <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / balão usando umpipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37 ° C) tripsina / EDTA que devem cobrir todo o monocamada. Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). Verificar se as células terem separado utilizando o microscópio óptico. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume dos meios de comunicação deve ser, pelo menos, 2-maior mais do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Contar o número de células usando hemocitômetro. </li><li> Agregar 1,5 × 10 7 células por centrifugação durante 3 minutos a 200 xg a 25 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 280 uL de meio de transfecção. Transferir a mistura reaccional para dentro de 4 milímetros cuvete. </li><li> Adiciona-se 20 ug de plasmídeo MRFP NPY-e ou 30 ug de plasmídeo de controlo vazio ou um plasmídeo testado. O volume final da mistura de reacção deve ser de 300 uL. </li><li> Colocar imediatamente em gelo durante 10 min. Limpe a tina de água residual e proceed a electroporação a 300 V durante 9 ms. </li><li> Para as medições de exocitose, replate as células imediatamente em placas de 24 poços de cultura de tecidos contendo meio de 300 ul. Adicionar 8 ul da mistura reaccional (4 x 10 5 células) para cada poço. Adicionar células 4 × 10 5 não transfectadas para poços adicionais para o controle. Prepare poços suficientes para ter, pelo menos, poços duplicados para cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para a microscopia de lapso de tempo, replate as células imediatamente num sistema de câmara de lamela de borossilicato de 8 poços contendo 80 ul médio. Adicionar 1,5 mL da mistura de reacção (7,5 x 10 4 células) para cada câmara. (Tentar evitar o uso das câmaras na borda da lamela, as câmaras no centro da lamela são mais fáceis de imagem). NOTA: É importante ressaltar que nem todas as células envolvidas na resposta a um gatilho e, ocasionalmente, a microscopia de lapso de tempo é revogada devido à perda de foco e deriva do borosi câmara de 8 poçossistema lamela licate. Assim, preparam-se pelo menos oito câmaras de cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para sensibilizar as células para a activação mediada FceRI, adicionar 1 ug / ml de DNP de rato monoclonal IgE específica para os meios de comunicação (incubar as células com níveis de IgE durante pelo menos 2 horas). </li><li> Após 18-24 h usar um microscópio de fluorescência para confirmar que as células expressam os plasmídeos. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência são MRFP: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP deve aparecer em estruturas vesiculares que correspondem aos GV. Se o segundo gene de interesse é fundido com um marcador fluorescente usar um microscópio de fluorescência para confirmar a co-expressão de ambos os plasmídeos nas mesmas células. Por exemplo, se o gene testado é fundido a GFP, Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência da GFP são: λEx 488, λEm 507 nm. A proteína GFP tag deve aparecer nas mesmas células que expressam NPY-MRFP. </li><li> Para as medições de exocitose proceder to passo 5 e para a microscopia de lapso de tempo, vá para a etapa 6. </li></ol> 5. Medição NPY-MRFP Exocytosis <ol><li> Preparação de tampão de Tyrode: <ol><li> Prepara-se uma solução de KCl 54 mM, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl e 8 mM de NaH 2 PO 4 em DDW. Misturar bem e armazenar a 4 ° C. Este passo é para a preparação de 20x tampão de Tyrode. </li><li> Prepara-se uma solução de tampão Hepes 20 mM, pH 7, CaCl 2 1,8 mM, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose e 1 a 20 de Tyrode diluição 20x em DDW e misturar bem. Este passo é para a preparação de 1x tampão de Tyrode. </li><li> Alíquota da 1x tampão Tyrode e armazenar a -20 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura da placa de 24 poços e lava-se 3 vezes com tampão de Tyrode. Preparar as células não estimuladas por adição de tampão de Tyrode 200 ul a poços de controlo. </li><li> Preparar 10 ul / poço de reagente de activação concentrada 20X [(por exemplo, 1.000 ng / mL DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de ionóforo de Ca 2+ (por exemplo, A23187), e uma combinação de 20 uM de ionóforo de Ca 2+ e 1000 nM de 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)]. Se os reagentes são armazenados em DMSO, dilui-se os reagentes em 20x concentração em tampão de Tyrode contendo 1% de DMSO. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remove-se os sobrenadantes de cada poço cuidadosamente para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. (Os sobrenadantes contêm o péptido quimérico NPY-MRFP que foi libertado a partir das células). </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de Tyrode contendo 0,5% de Triton X-100 a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. (Este passo é importante para a preparação de lisados ​​de células que contêm o restante do NPY-MRFP que não foi libertado das células). Recolher os lisados ​​de células e transferir para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. </li><li> Medir a fluorescência das células sobrenadantes e os lisados ​​de células utilizando um fluoresleitor de placas cia, utilizando um 590-, 20 nm de largura de banda de excitação do filtro e 635-, 35 nm, filtro de emissão de largura de banda. </li><li> Calcular a percentagem de NPY-MRFP lançado: NOTA: A medida leitor fluorescência unidades de fluorescência arbitrárias (AFU). AFU valores dependem da máquina e a sua sensibilidade e a eficácia de transfecção. <ol><li> Defina a autofluorescência de células RBL não transfec- em branco. Divida a AFU de cada sobrenadante para a fluorescência total (AFU do sobrenadante + AFU do ligado correspondente) e multiplicar por 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse Microscopia de Exocytosis <ol><li> Semente de 7,5 x 10 4 a de células / câmara num sistema transfectadas lamela de borosilicato câmara de 8 poços. Após 18-24 h, remover o meio de cultura a partir das câmaras e lavar 3 vezes com tampão de Tyrode </li><li> Adicionar 72 ul de tampão de Tyrode para cada câmara. Dilui-se os reagentes de activação em tampão de Tyrode a 10X a concentração. </li> &lt;li&gt; Use um microscópio confocal de fluorescência equipado com uma câmara aquecida (37 ° C) e CO 2 controlador (4,8%) e uma objectiva de 40X ou 63X. Ligue os sistemas de microscopia: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Certifique-se de que a câmara aquecida está na temperatura certa antes do início do experimento. </li><li> Coloque a câmara na câmara aquecida e certificar-se de que a câmara está instalada corretamente e estável. </li><li> Ligar a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo em causa e visualizar as células transfectadas. Desligue fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade. É importante que este campo irá conter cerca de 2-3 células transfectadas. As células transf deve ser bem espalhado, mas não tocar o outro. </li><li> Ajustar a potência do laser (dependendo do microscópio) para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e definir o ganho e deslocamento para modificar a relação sinal-ruído. Digitalização rápida ouder a minimizar a duração de exposição a laser (média de 2). </li><li> Ajustar o tamanho do furo de pino para um máximo, isto capaz de reduzir a potência do laser e para manter as imagens focadas por um longo período de tempo. Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para reconstruir a imagem em três dimensões, ajustar o tamanho pinhole a 1 unidade arejado (UA), que dá a melhor relação sinal-ruído e adquirir digitalização sucessiva de fatias ópticos confocal bidimensionais no -axes z com fatias ópticos ≤0.7 mm. </li><li> Defina o tempo de intervalo entre cada aquisição de 15-30 seg e a duração de aquisição total para 15 min e começar a aquisição de imagens. Após 5 min de aquisição pausa da série histórica. Adicionar 8 mL da trigger 10x e continuar imediatamente a aquisição. </li><li> Salve as imagens, execute deconvolution usando um software deconvolution e reconstruir as pilhas de imagens tridimensionais e um filme usando software Imaris. </li></ol><ol><li> Importar os dados a partir das imagens da série deconvoluídos vez que foram obtidos pela microscopia de fluorescência confocal para software Imaris. Este software lê mais de 40 arquivos de microscopia. Se o software não consegue ler os arquivos; converter os arquivos para arquivos tif e importação. </li><li> Para adicionar pontos de tempo para o fim de um conjunto de dados aberto pressione editar -&gt; Adicionar pontos no tempo e importar o novo conjunto de dados. </li><li> Criar superfície do canal MRFP usando opção de assistente de superfície. Escolha o algoritmo padrão. Escolha o canal de NPY-MRFP. Marque a opção de suavização para reduzir o ruído. Para evitar a perda de pequenos detalhes reduzir o nível de detalhe área de 0,05 um. </li><li> Defina o limite de intensidade. New superfície cinzenta será exibida. Vá em &quot;Configurações&quot; e mude o estilo do &quot;ponto Center&quot; para &quot;Surface&quot;. </li><li> Vá até a aba estatística nas propriedades do objeto selecionado, selecione a guia detalhado e o suc valor específicoh como intensidade de fluorescência, volume, etc. </li><li> Analisar os dados e confirmar que os valores são compatíveis com as imagens. Por exemplo, dois ou mais grânulos adjacentes pode ser medido como um grânulo maior. Para quantificar o tamanho médio de grânulo de dividir o tamanho dos grânulos fundidos para o número real de grânulos. </li><li> Exportar os conjuntos de dados desejados para arquivos do Excel e analisar os dados. </li></ol> f

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Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.

Descrevemos uma estratégia inovadora que combina quantificação de MCs exocitose e quatro (x, y, z, t) quantificações de dimensão por imagiologia tridimensional tempo decorrido dos SGs em células vivas, utilizando um gene repórter para a exocitose. Esta técnica permite a triagem das famílias de proteínas para o seu impacto sobre a função MC como SGs de monitoramento a partir tão cedo quanto a sua saída do Golgi através de sua maturação, a aquisição de competências exocitose e degranulação. A combinação de medições de exo...

Mastócitos (MC) são células imunes que são melhor conhecidas pelo seu envolvimento em reacções alérgicas e inflamatórias tais como artrite, asma, esofagite eosinofílica, dermatite crónica e choque anafilático 1,2 bem como outras patologias, incluindo doença da artéria coronária e 3,5 cancro 3,4. Além disso, MCs desempenham importantes papéis na imunidade inata e adaptativa, tanto na defesa do hospedeiro contra as bactérias e os parasitas e por supressão de respostas imunológicas, por exemplo, induzir tolerância do enxerto 5,6. MCs originam a partir da medula óssea, o desenvolvimento de células CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. Medula óssea Committed progenitores MC são liberados na corrente sanguínea e migram para os tecidos periféricos que localizam predominantemente no interior de tecidos conjuntivos e superfícies epiteliais 8. Maturação e diferenciação terminal, eventualmente, são alcançados sob a influência of citocinas no meio circundante 8,9. MCs pode ser activado por um alergénio (antigénio, Ag), cujo encontro resultou na geração de imunoglobulina E (IgE) digite anticorpos. A ligação de IgE a receptores de tais FceRI do MC, seguido por ligação cruzada de IgE ligada à célula após re-exposição ao mesmo Ag, resulta em agregação FceRI e iniciação de uma cascata de sinalização que culmina na desgranulação celular [revisto em 10,11] . MCs também são ativadas, independentemente de IgE, por neuropeptídeos 5,12, toxinas 13, bacteriana e antígenos virais 14,15, uma série de peptídeos carregados positivamente colectivamente referidos como secretagogues básicos, células do sistema imunológico e citocinas 5,13,12,16 , 17. MCs também são activadas por muitos dos seus próprios mediadores libertados, que desenvolvem ainda mais a resposta inflamatória. MCs são embalados com grânulos de secreção (SGs) que contêm imunomediadores reguladoras, incluindo aminas vasoactivas, tais como histamina e serotonina (em roedores), proteoglicanos, proteases, tais como triptase e quimase, factor de crescimento endotelial vascular e várias citocinas e quimiocinas 8,9. Estes mediadores são &quot;pronto para ir&quot; e uma vez MCs são ativados por um estímulo adequado, esses mediadores são liberados das células por exocitose regulada (desgranulação) em questão de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial é seguido pela síntese de novo e libertação de uma grande variedade de substâncias biologicamente potentes, incluindo metabolitos de ácido araquidónico, várias citocinas e quimiocinas 20,21,22. Lançamento de produtos recém-sintetizados ocorre independentemente da liberação SG. Coletivamente, esses mediadores iniciar precoces e fase tardia respostas inflamatórias e alérgicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos responsáveis ​​por ativação MC e degranulação são ambos de imp teórico e clínicoortance. A dificuldade de manipular geneticamente MCs primárias e cultivadas tem dificultado as tentativas para elucidar os mecanismos subjacentes MC degranulação, que continuou mal resolvidos. Para superar este problema foi desenvolvido um ensaio baseado repórter por co-transfecção da linha de células da mucosa do mastro, leucemia basofílica de rato (RBL) -2H3 (aqui referidos como RBL) ou da medula óssea derivadas MCs (BMMCs) 30 com um gene de interesse e O neuropeptídeo Y (NPY) fundido a RFP monomérica (MRFP), como um repórter SG. NPY foi anteriormente mostrado para recapitular o comportamento dos marcadores SG endógenos em outros sistemas. Além disso, porque MRFP fluorescência é insensível pH, a expressão do NPY-MRFP permite a visualização dos GV de ácidos, bem como a avaliação quantitativa de exocitose, utilizando placas de 96 poços e um leitor de placas de fluorescência. Mostrámos que o NPY-MRFP é entregue aos SGs ácidas de células RBL e BMMCs e é libertado a partir das célulasde uma forma regulada juntamente com a carga SG endógenos (isto é, β-hexosaminidase e serotonina) 30, 32. Este protocolo prevê uma metodologia baseada em imagens de alta resolução que permite que genes de triagem de interesse para a sua fenotípica e funcional impacto sobre as características de SG e desgranulação em células RBL 32. Especificamente, este protocolo permite o acompanhamento em tempo real do MC SG e quantificação da sua área ou tamanho do volume, o seu número, a cinética de montagem, o seu movimento ao longo do citoesqueleto da célula e a sua fusão definitiva com a membrana do plasma sob diferentes condições. Por exemplo, sensibilizar as células com DNP-IgE específica e desencadear as células com um Ag multivalente (DNP conjugado a albumina do soro) sob diferentes perturbações (isto é, o knockdown de genes de interesse, sobre a expressão de genes wt ou mutantes, ou manipulações farmacológicas) e comparação com células de controlo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>GE cuidados de saúde Ciências da Vida</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana de acetato de celulose, tamanho do poro 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning placas de cultura tratadas com cultura de tecidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina / EDTA (TE)</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>R001100</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>TUBOS sal dipotássico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de cálcio hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnésio tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sal de potássio de ácido L-glutâmico monohidratado (glutamato de potássio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mm projetos de células de cubetas de eletroporação</td><td></td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>PULSADOR DE GENES COM CONTROLADOR DE PULSO & CAPACITÂNCIA</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínula com câmara</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 poços, fundo plano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning placas de 96 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 ou CLS390</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de fluorescência de placa de 96 poços - Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo de cálcio A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>Evite a exposição direta à luz</td></tr><tr><td>12-O-tetradecanoil-13-acetato (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoclonal</td><td>IgE Sigma-Aldrich</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Evite a exposição direta à luz</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente confocal:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 invertido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel ou Prism ou outro software</td><td></td><td></td><td></td>de análise</tr><tr><td>Outro reagente:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio&nbsp;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino albumina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monossódico&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td></td><td>estéril</td></tr></tbody></table>

investigando mastócito secretory grânulos; de biossíntese de exocytosis

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mastócitos (MC) são células secretoras do sistema imunitário que realizam as suas funções fisiológicas e patológicas através da libertação de mediadores alérgicos, inflamatórios e imuno pré-formada e recém-sintetizadas. Mediadores MCs &#39;afetar vários tecidos e órgãos, culminando em respostas alérgicas e imunológicas. A síntese, armazenamento e liberação dos mediadores MC são altamente regulamentados. Os mediadores pré-formados são embalados em grânulos secretores citoplasmáticos (SG) que se fundem com a membrana plasmática e libertam o seu conteúdo por exocitose regulada. Apresenta-se um protocolo, com base na co-expressão de um gene de interesse com um gene repórter que está voltado para as SG e é libertada de um modo regulado com os mediadores de SG endógenos. O protocolo permite alta resolução quatro confocal dimensional análises do MC GV e monitorização da sua linha do tempo a partir de biogênese a exocitose disparada. Assim, usando esse protocolo para a triagem de genes entreest por sua fenotípica e funcional impacto permite decifrar os mecanismos moleculares que governam a biogênese e exocitose do MC GV e identificar os reguladores envolvidos. Assim, devem ser fornecidos mais insights sobre os mecanismos celulares que respondem por função MCs na saúde e na doença.

Devido à baixa eficiência de transfecção de MCs, as manipulações genéticas são susceptíveis de deixar um impacto sobre as leituras de secreção média medidos por mediadores endógenos SGs. No entanto, mediante o estabelecimento de co-expressão completa do gene repórter NPY-MRFP e o plasmídeo de co-transfectados nas mesmas células, a monitorização dos resultados NPY-MRFP exclusivamente no controlo da população de células que expressa o gene de interesse. Portanto, a vantagem deste ensaio em comparação com métodos convencio...

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar os mecanismos que regulam o desenvolvimento dos mastócitos, dos grânulos secretórios e da citose. Isso é realizado primeiramente por meio da transfecção simultânea dos mastócitos com um gene repórter para exocitose, bem como com um gene de interesse. O segundo passo consiste em avaliar o efeito do gene testado sobre a exocitose, estimulando as células e monitorando o sinal fluorescente do gene repórter durante a exocitose.Em seguida, o efeito do gene testado na geração e desenvolvimento dos grânulos secretórios de mastócitos é avaliado por meio de imagem confocal do gene repórter localizado nos grânulos secretórios. O passo final consiste em realizar a análise morfométrica dos grânulos secretórios. Em última instância, a marcação por fluorescência dos grânulos secretórios de mastócitos utilizando um gene repórter é usada para demonstrar alterações nos mastócitos, no desenvolvimento dos grânulos secretórios e em sua exocitose.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a medição da liberação de mediadores endógenos, beta haase ou histamina, é que ela se baseia na coexpressão do gene de interesse junto com um mutante tipo ou S-H-R-N-A, além de um repórter para exocitose. A coexpressão permite então monitorar a secreção exclusivamente a partir de células geneticamente manipuladas, superando assim o problema da alta relação ruído-sinal que surge ao se medir a liberação de mediadores endógenos devido à baixa capacidade de transfeção das células mastocitárias, o que dificulta a interpretação dos resultados. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia celular das células mastocitárias, como a identificação dos mecanismos moleculares que controlam o processo de formação de grânulos secretórios, incluindo seleções de calgo, empacotamento dos grânulos e sua competência para exocitose.Este método também auxilia na identificação dos mecanismos moleculares que controlam o processo de exocitose regulada em massa de células, mediante a avaliação do envolvimento de quinases, fosfatases e outras famílias de proteínas nesse processo. Para começar, prepare células de leucemia basofílica de rato e o meio de cultura conforme descrito no protocolo textual para realizar a transfeção. Primeiramente, remova o meio de cultura da placa utilizando uma pipeta Pasteur estéril conectada a um vácuo.Lave a monocamada de células com tripsina pré-aquecida, um A DTA que cubra toda a monocamada. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por não mais de 10 minutos. Em seguida, verifique se as células se desanexaram utilizando o microscópio óptico.Uma vez destacadas, adicione meio à placa de cultura para suspender as células em um volume de pelo menos duas vezes o volume da solução de tripsina. Após contar o número de células utilizando um hemocitômetro, pelote 15 milhões de células por centrifugação durante três minutos a 200 ×g e 25 °C. Descarte o sobrenadante e adicione 280 microlitros de meio de transfeção.Em seguida, transfira a mistura de reação para um vete de quatro milímetros. Adicione 20 microgramas de plasmídeo contendo neuropeptídeo Y-M-R-F-P, também conhecido pelo seu nome abreviado N-P-Y-M-R-F-P, e 30 microgramas de plasmídeo controle vazio ou um plasmídeo testado. O volume final da mistura de reação deve ser de 300 microlitros.Após colocá-lo no gelo por 10 minutos, limpe o vial livre de água residual. Em seguida, prossiga com a eletroporação a 300 volts por nove milissegundos. Para medições de exocitose, reponha imediatamente as células em placas de cultura de tecido de 24 poços contendo 300 microlitros de meio.Adicione oito microlitros da mistura de reação a cada poço. Em seguida, adicione células não transfectadas a poços adicionais para o controle. Prepare um número suficiente de poços para ter poços em duplicata para cada tratamento, para cada transfeção; para microscopia de tempo real, replaque imediatamente as células em um sistema de câmara de oito poços com lamínulas de vidro de borossilicato contendo 80 microlitros de meio.Adicione 1,5 microlitros da mistura de reação a cada câmara para sensibilizar as células à ativação mediada por FC épsilon R um. Adicione um micrograma por mililitro de IgE monoclonal específico para DNP de camundongo ao meio. Incube as células com IgE por pelo menos duas horas.Após 18 a 24 horas, utilize um microscópio fluorescente para confirmar que as células expressam os plasmídeos. O MRFP possui um comprimento de onda de excitação de 584 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 607 nanômetros. O N-P-Y-M-R-F-P deve aparecer em estruturas vesiculares que correspondem aos grânulos secretórios.Para medir a exocitose de N-P-Y-M-R-F-P, remova o meio de cultura. Da placa de 24 poços, lave três vezes com tampão tyro. Prepare células não estimuladas adicionando 200 microlitros de tampão tyro aos poços controle.Em seguida, adicione os reagentes ativadores e o tampão tyro diluído antes de incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes S de cada poço para uma placa de 96 poços. Coloque a placa sobre gelo e proteja da luz.Os sobrenadantes S contêm o peptídeo quimérico N-P-Y-M-R-F-P que foi liberado das células. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão tyro contendo 0,5% de Triton X-100 a cada poço e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Esta etapa é importante para a preparação de lisados celulares que contêm o restante do N-P-Y-M-R-F-P que não foi liberado das células.Colete os lisados celulares e transfira para uma placa de 96 poços antes de colocar no gelo. Na ausência de luz, meça a fluorescência dos sobrenadantes celulares e dos lisados celulares utilizando um leitor de placas com fluorescência equipado com um filtro de excitação de 590 nanômetros com largura de banda de 20 nanômetros e um filtro de emissão de 635 nanômetros com largura de banda de 35 nanômetros. Semee 1,5 microlitros de células transfectadas em um sistema de cobertura de vidro de borossilicato com oito câmaras.Incube as células por 18 a 24 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius. Remova o meio de cultura das câmaras e lave três vezes com tampão tireoide. Em seguida, adicione 72 microlitros de tampão tireoide a cada câmara.Utilize um microscópio de fluorescência confocal equipado com câmara aquecida, controlador de dióxido de carbono e objetiva de 40 x ou 63 x. Ligue os sistemas do microscópio, incluindo a lâmpada de mercúrio, o computador e os lasers. Certifique-se de que a câmara aquecida está na temperatura adequada.Antes de iniciar o experimento, coloque o sistema de lamínula de vidro de borossilicato com oito poços na câmara aquecida e certifique-se de que a câmara está instalada corretamente e está estável. Ligue a luz de fluorescência de acordo com o andar relevante quatro e visualize as células transfectadas, desligando a fluorescência assim que uma célula de interesse estiver no campo. A fim de minimizar o desbotamento e a citotoxicidade, este campo deve conter cerca de duas a três células transfectadas, de modo que fiquem bem distribuídas, mas sem tocar umas nas outras.Neste caso, as células são cotransfectadas com o gene repórter, N-P-Y-M-R-F-P e um mutante de RAB cinco constitutivamente ativo marcado com GFP. Ajuste a potência do laser para minimizar o ruído, a sobressaturação e a toxicidade, e configure o ganho e o deslocamento para modificar a relação sinal-ruído. Realize a varredura rapidamente para minimizar a duração da exposição ao laser.Em seguida, defina os parâmetros para o Zack reconstruir a imagem em três dimensões. Ajuste o tamanho do pinhole para uma unidade de área para obter a melhor relação sinal-ruído e realize a aquisição sequencial de cortes ópticos confocais bidimensionais no eixo Z com cortes ópticos menores ou iguais a 0,7 micrômetros. Agora, defina o intervalo de tempo entre cada aquisição como 30 segundos e a duração total da aquisição como 15 minutos, iniciando a aquisição de imagens após cinco minutos de aquisição.Pare a série temporal, adicione oito microlitros do gatilho 10 x e continue a aquisição imediatamente. Por fim, salve as imagens. Realize a desconvolução utilizando software de desconvolução e reconstrua as pilhas em imagens tridimensionais e um vídeo para realizar a análise de imagem.Importe os dados das imagens da série temporal desconvoluídas obtidas por microscopia de fluorescência confocal para um software de análise científica de imagens, como o MRS. Esse software lê mais de 40 tipos de arquivos de microscopia. Para adicionar pontos de tempo ao final de um conjunto de dados aberto, selecione editar, adicione pontos de tempo e importe o novo conjunto de dados.Ajuste o contraste e a tonalidade de cor para obter a visualização ideal da imagem. Os arquivos que foram baixados criam a superfície do canal MRFP. Usando a opção assistente de superfície.Escolha o algoritmo padrão e marque a opção de suavização no canal N-P-Y-M-R-F-P para reduzir o ruído. Para evitar a perda de pequenos detalhes, reduza o nível de detalhe da área para entre 0,05 e 0,1 mícron. Em seguida, defina o limiar de intensidade.Uma nova superfície cinza é exibida. Em seguida, acesse as configurações e altere o estilo do ponto central para superfície. Vá até a guia de estatísticas nas propriedades do objeto selecionado.Em seguida, selecione a guia detalhada e o valor específico, como fluorescência, intensidade ou volume. Revise os dados e confirme se os valores são compatíveis com as imagens. Por exemplo, dois ou mais grânulos adjacentes podem ser medidos como um único grânulo maior para quantificar o tamanho médio dos grânulos.Divida o tamanho dos grânulos secretórios pelo número real de grânulos. Como etapa final, exporte os conjuntos de dados desejados para arquivos do Excel e analise os dados. São mostradas aqui imagens representativas de grânulos secretórios gigantes de mastócitos formados pela expressão de RAB cinco constitutivamente ativo, bem como a cinética da exocitose e a resolução de um único grânulo secretório.Após a estimulação. Durante a exocitose dos mastócitos, os grânulos secretórios migram em direção à membrana plasmática e se fundem a ela. Os grânulos são revestidos pelo RAB cinco constitutivamente ativo, mostrado em verde.O cargo secretório, que neste experimento é N-P-Y-M-R-F-P e está colorido em magenta, é então liberado das células para o espaço extracelular. Os grânulos que foram fundidos pelo mutante constitutivamente ativo de RAB cinco mostrado em verde liberam. Seu cargo N-P-Y-M-R-F-P que neste experimento está colorido em magenta sai das células para o espaço extracelular.A liberação de N-P-Y-M-R-F-P durante a exocitose resulta em um aumento acentuado na intensidade de fluorescência de N-P-Y-M-R-F-P e na redução dos grânulos secretórios contendo N-P-Y-M-R-F-P, seguida pelo desaparecimento destes, bem como das intensidades fluorescentes dos grânulos secretórios. Após estimular as células com um ionóforo de cálcio, observa-se que os grânulos secretórios realizam exocitose em diferentes pontos de tempo. Enquanto um grânulo secretório não se fundiu com a membrana plasmática e sua intensidade de fluorescência permaneceu constante.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como monitorar os grânulos secretórios de mastócitos durante o desenvolvimento e exocitose, utilizando um gene repórter fluorescente que é direcionado aos grânulos secretórios e liberado por células estimuladas. Juntamente com os mediadores endógenos, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento dos grânulos secretórios de mastócitos e à exocitose podem ser identificados usando este procedimento por meio da análise simultânea de células com um gene repórter e um gene teste. O papel do gene teste no desenvolvimento dos grânulos secretórios de mastócitos pode ser avaliado realizando uma análise morfométrica dos grânulos secretórios de células que foram cotransfectadas com o gene de interesse em comparação com células controle.Além disso, o papel do gene testado na exocitose regulada pode ser identificado por meio do monitoramento da liberação do gene repórter.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para determinar a atividade de degranulação dos mastócitos. A enzima liberada pelos mastócitos hidrolisa o substrato e produz um produto colorido. A atividade de degranulação dos mastócitos foi medida como a porcentagem de liberação de enzimas fora da célula normalizada com o conteúdo total de enzimas na célula.

Ensaio de degranulação de mastócitos para estudar o efeito de um produto químico alvo

Este vídeo demonstra um método de lavagem peritoneal para isolar mastócitos maduros do tipo tecido conjuntivo da cavidade peritoneal de camundongos adultos. Ao isolar uma mistura de células imunes primárias da cavidade peritoneal, a proliferação seletiva de mastócitos é realizada em condições de cultura apropriadas.

Uma técnica para isolar mastócitos primários de uma cavidade peritoneal murina

Este vídeo demonstra a exocitose de mastócitos induzida por um reagente ativador que inclui um ionóforo de cálcio, iniciando a liberação de grânulos secretores contendo a proteína repórter fluorescente NPY-mRFP. Posteriormente, avaliamos quantitativamente a exocitose medindo o NPY-mRFP liberado usando um leitor de placa de fluorescência.

Medição da exocitose de mastócitos via liberação de proteína fluorescente vermelha monomérica do neuropeptídeo Y

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a exocitose em mastócitos. As células são incubadas com FITC-dextrano - um repórter fluorescente - que é absorvido pelas células dentro de grânulos secretores (SGs), onde o pH ácido extingue sua fluorescência. Após a estimulação da exocitose do grânulo, o pH mais alto do meio induz a fluorescência do repórter dentro dos SGs fundidos, que é visualizada usando um microscópio de fluorescência.

Uma técnica in vitro para visualizar a exocitose de grânulos secretores em mastócitos

Degranulação dos mastócitos, a liberação de mediadores alérgicos, é importante para alergia, asma e defesa do parasita. Aqui demonstramos uma técnicas para a avaliação dos efeitos de drogas e de substâncias tóxicas em desgranulação, a metodologia utilizada recentemente para expor o efeito inibidor potente do agente antibacteriano triclosano 2.

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Estresse osmótico afeta a exocitose e a quantidade de neurotransmissor liberado durante este processo. Demonstramos como combinando métodos eletroquímicos juntamente com microscopia eletrônica de transmissão pode ser usado para estudar o efeito da pressão osmótica extracelular na atividade de exocitose, vesículas quantal tamanho e a quantidade de neurotransmissor liberado durante a exocitose.

O efeito do estresse osmótico em vesículas secretoras e exocitose de monitoramento

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Aqui detalhamos um método para a imagem latente de célula viva de exocitose regulada. Este método utiliza FITC-dextrano, que acumula em organelas lisossoma-relacionados, como repórter. Este método simples também permite distinguir entre diferentes modos de exocitose regulada em células que são difíceis de manipular geneticamente.

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.

Quantificando parâmetros espáteris de exocitose celular em células micropatteradas

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando...

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

Aprenda a investigar a exocitose em mastócitos usando genes repórter fluorescentes e imagem confocal. Este método permite analisar a morfologia dos grânulos secretores em tempo real.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

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