In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da atividade de neurônios entéricos e glia em preparações de intestino inteiro vivo usando corantes indicadores de cálcio fluorescentes. Isso é feito primeiro extirpando uma parte do intestino do animal e colocando-a em um meio pré-aquecido. O segundo passo é abrir o intestino ao longo da borda mesentérica e fixá-lo sob leve tensão com uma superfície mucosa voltada para cima.

As preparações de montagem inteira do plexo mioentérico são preparadas por microdissecção e colocadas em placas de imagem. Em seguida, todas as preparações de montagem são carregadas com um corante indicador fluorescente gripe oh quatro em uma incubadora. Nas etapas finais, as preparações carregadas são fotografadas usando um microscópio de imagem fluorescente equipado com uma câmera de alta resolução controlada por software de aquisição e análise de imagem para registrar a atividade da linha de base.

Em seguida, os medicamentos sob investigação são adicionados e os transientes de cálcio nos neurônios e glia são registrados. Em última análise, in situ. A imagem de cálcio do sistema nervoso entérico é usada para estudar como a atividade celular nos neurônios e na glia contribui para a regulação das funções fisiológicas intestinais e da disfunção do sistema nervoso entérico na fisiopatologia intestinal.

As implicações desta técnica se estendem ao estabelecimento de uma compreensão da fisiologia e fisiopatologia dos distúrbios intestinais funcionais e da doença inflamatória intestinal através do uso de um método simples e robusto para examinar a complexa interação entre neurônios e glia entérica usando imagens de cálcio NC dois, demonstrando que este procedimento será gratuito para os cientistas do meu laboratório. Os seguintes procedimentos envolvendo tecidos de animais de laboratório são consistentes com as diretrizes do A VMA para a eutanásia de animais de 2013 e foram aprovados antecipadamente pela Michigan State University I-A-C-U-C Após a eutanásia do animal de acordo com os procedimentos aprovados, coloque o animal em decúbito dorsal e limpe a pele sobre o abdômen com etanol a 70%. Use uma pinça para beliscar a pele abdominal na linha média e, em seguida, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão medial de seis centímetros ao longo do cotovelo linear para expor os órgãos digestivos internos.

Em seguida, use uma pinça romba para localizar e expor o cólon dentro do peritônio. Corte o mesentério do cólon ileal com uma tesoura e comece a desvendar o intestino. Uma vez que o comprimento do intestino esteja adequadamente desvendado, corte o cólon distal ao ceco e proximal ao reto para uma preparação do intestino grosso, que será mostrada neste vídeo.

Em seguida, remova rapidamente o segmento intestinal e coloque-o em um béquer contendo DM EMF 12 Meio suplementado com três cloridrato de nicardipina micromolar e um cloridrato micromolar de escopolamina de S no gelo. A adição desses inibidores facilita a microdissecção e a imagem subsequente, paralisando o músculo liso intestinal. Remova um pequeno segmento de quatro a seis centímetros do segmento intestinal desejado e coloque em uma placa de Petri revestida com syl guard cheia de meio suplementado resfriado.

Em seguida, prenda as extremidades proximal e distal do segmento intestinal com alfinetes de insetos e abra o tubo intestinal fazendo um corte reto longitudinalmente ao longo da borda mesentérica. Agora prenda o tecido sob leve tensão com o lado da mucosa para cima e disseque cuidadosamente a camada mucosa levantando a mucosa com uma pinça fina número cinco e cortando por baixo com uma tesoura de mola muito fina. Corte o tecido em preparações menores de aproximadamente 0,5 centímetros quadrados e coloque cada peça em uma placa de imagem cheia de mídia suplementada e coloque no gelo.

Prenda cada preparação nos quatro cantos com uma camada muscular circular voltada para cima. Disseque cuidadosamente o músculo circular, separando-o com uma pinça fina. Para expor o plexo mioentérico, evite alongamento excessivo, coloque as placas de imagem de volta no gelo e substitua a solução em cada placa por meio suplementado fresco.

Em seguida, retire os pratos do gelo e adicione dois mililitros de mistura enzimática a cada prato e incube em temperatura ambiente com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 15 minutos. Finalmente, lave as preparações de tecido com meio três vezes e controle os cantos enquanto trabalha em condições de luz limitada para evitar fotobranqueamento a 1,5 mililitros de meio suplementado e 1,2 microlitros de um estoque probit de 250 milimolares para um estoque de 1,5 microlitro Eloqua de quatro milimolares Fluro quatro estoque a aproximadamente 1,5 mililitros de solução de carregamento de gripe oh quatro para os pratos de imagem e incube em uma incubadora escura a 37 graus Celsius por 45 ata. Depois de retirar a louça da incubadora, lave as preparações três vezes com meios.

Em seguida, adicione meio fresco contendo 200 micromolares prop acid para melhorar a marcação neuronal neural e incube como antes por 15 minutos. Durante a incubação, faça um tampão de Krebs modificado de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo e adicione três nicardipinas micromolares e uma escopolamina micromolar para inibir as contrações musculares. Durante a imagem de cálcio dois mais e dissecções de montagem inteira, posicione a câmara de registro sob o microscópio fluorescente e usando um sistema de perfusão por fluxo por gravidade com vários reservatórios de seringa aquecidos.

Estabeleça uma taxa de perfusão contínua de dois a três mililitros por minuto de tampão Krebs de 37 graus Celsius. Certifique-se de evitar a formação de bolhas de ar na entrada e na linha de sucção conectada a um coletor de vácuo. Traga o plexo desejado em foco sob iluminação de campo brilhante.

Evite expor demais o tecido, o que pode levar ao fotobranqueamento. Examine a gripe oh quatro carregando dentro dos gânglios e selecione gânglios saudáveis para imagem. Os gânglios danificados insalubres exibirão autofluorescência ou morfologia pontilhada e não devem ser usados para exames de imagem.

Depois que um gânglio for selecionado, desvie o caminho da luz para a câmera e obtenha uma imagem ao vivo. Com o software de aquisição de imagens, certifique-se de que o gânglio esteja em foco e defina a taxa de aquisição de imagens e os tempos de exposição As taxas e os tempos de aquisição de imagens variam de acordo com os eventos que os investigadores desejam registrar. Para a maioria dos experimentos, as imagens são tradicionalmente adquiridas a 0,5 a um hertz para células gliais e até dois a 10 hertz.

Para neurônios, porque transientes de cálcio glial não são tão rápidos quanto os neurônios transitórios de cálcio, Inicie a gravação e estabeleça a atividade fisiológica basal do gânglio escolhido na ausência de estímulos experimentais por 30 segundos. Em seguida, aplique medicamentos pré-aquecidos de interesse, como agonistas e antagonistas de receptores, usando o sistema de perfusão de fluxo por gravidade a uma taxa de dois a três mililitros por minuto, de acordo com um protocolo otimizado para seu medicamento. Pare a gravação e veja o filme de lapso de tempo do experimento.

Selecione cuidadosamente as regiões de interesse ou ROIs usando o software de análise de imagem apropriado. Finalmente, use o software de imagem apropriado para normalizar e comparar a intensidade fluorescente das regiões de interesse com sua linha de base inicial As alterações na fluorescência normalizada são diretamente proporcionais às mudanças no cálcio. As três imagens a seguir demonstram que a glia entérica na cobaia responde a um TP in situ.

Em condições basais, uma fluorescência fluorada de baixo nível, conforme delineado pela linha tracejada, é visível. As setas apontam para tratos de fibras interganglionares espessas após estimulação com células gliais de 100 micro mo por litro A TP, mas não neurônios aumentam rapidamente a fluorescência de quatro fluoro, indicando um aumento no cálcio. Observe que as células que respondem são pequenas e circundam os neurônios muito maiores indicados pelos espaços escuros marcados por asterisco.

Este histograma mostra que a glia entérica responde a um TP de maneira dependente da dose, com um milimol por litro provocando respostas máximas. Este vídeo mostra um gânglio mioentérico do cólon distal do camundongo carregado com um corante indicador de cálcio dois mais gripe oh quatro. O agonista das células gliais é adicionado ao banho quando indicado.

Um DP provoca um aumento no cálcio intracelular dois mais na glia entérica, conforme observado pela elevação transitória na fluorescência da gripe oh quatro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como examinar com precisão a complexa interação entre os neurônios e usar empiricamente imagens de cálcio. Caracterizar os mecanismos e as possíveis consequências funcionais das respostas de cálcio em preparações de montagem inteira requer dissecções precisas para uma qualidade de imagem ideal.

O uso de marcação fluorescente e estímulos farmacológicos dentro desta técnica baseada em microscopia permite uma melhor avaliação dessas células em seu ambiente multicelular nativo.