Name: In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio in situ no sistema nervoso entérico usando preparações de intestino e corantes fluorescentes. Este método permite estudar a atividade neuronal e glial em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado por doações da Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (para B. Gulbransen), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) e fundos iniciais da Michigan State University (B. Gulbransen).

NOTA: Os procedimentos a seguir que envolvem o tecido de animais de laboratório são consistentes com as Diretrizes AVMA para a eutanásia de animais para 2013 e foram aprovados com antecedência pela Michigan State University IACUC. 1. Preparação do Tecido <ol><li> Anestesiar pesquisa animal numa câmara contendo 2,5% de isoflurano em oxigénio ou colocando 3-5 ml de isoflurano líquido sobre um material absorvente sobre o chão da câmara, assegurando que uma barreira física impede os animais de um contacto directo com o isoflurano. Teste para a profundidade da anestesia, apertando a pata. NOTA: A profundidade da anestesia é considerado apropriado quando não há reflexo de retirada do membro posterior. Uma vez devidamente anestesiados, sacrificar o mouse por deslocamento cervical </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal e limpar a pele abdominal com etanol 70%. Use uma pinça para beliscar a pele abdominal na linha média e usar uma tesoura cirúrgica para fazer uma media 6 centímetrosl incisão ao longo da linha alba para expor órgãos digestivos internos. </li><li> Use uma pinça sem corte para localizar e expor o íleo dentro do peritônio. Corte o mesentério ileal / cólon com uma tesoura e começar a desvendar o intestino. </li><li> Uma vez que o comprimento do intestino delgado é adequadamente desvendados, cortar o intestino distai para o estômago e proximal do ceco para uma preparação de íleo. Para uma grande preparação intestino, cortar o cólon distai ao ceco e proximal ao recto. </li><li> Remover rapidamente o segmento intestinal e colocá-lo num copo com meio DMEM / F12 suplementado com cloridrato nicardipine 3? M e 1 PM cloridrato de escopolamina (doravante referida como &quot;media&quot;) em gelo. A adição destes inibidores facilita microdissection e imagem posterior por paralisar o músculo liso do intestino. </li><li> Cortar segmento de interesse (por exemplo, jejuno, íleo, cólon distai ou proximal) com base em marcadores anatómicos estabelecidos. Normalmente utilize tecido do íleo terminal ou o cólon distai. No entanto, utilize o mesmo procedimento básico para isolar, de carga e de imagem neurônios mioentéricos e glia em todas as regiões intestinais. </li><li> Retirar um pequeno segmento (4-6 cm) do segmento de intestino desejada e coloque em uma placa de Petri Sylgard revestido preenchido com media gelada. </li><li> Fixar as extremidades proximal e distal do segmento intestinal com os pinos de insetos e abrir o tubo intestinal, por fazer uma sequência no sentido do comprimento cortado ao longo da fronteira mesentérica. </li><li> Tecido Pin plana sob tensão luz com o lado mucosa e dissecar cuidadosamente afastado camada mucosa usando uma pinça fina (# 5 e # 5/45 trabalho melhor) e tesoura primavera muito finas. NOTA: A remoção da mucosa pode ser bastante traumático para o ENS se não for feita correctamente. Para as preparações de qualidade, tome cuidado para limitar a remoção abrupta da mucosa por descamação ou raspagem. A melhor prática é para levantar a mucosa e cortar por baixo com uma tesoura fina. </li><li> Corte o tecido em preparação menors (aproximadamente 0,5 cm 2) e pinos em placas de imagem (4 cantos com camada muscular circular voltada para cima) colocados no gelo com meio fresco. </li><li> Dissecar cuidadosamente afastado músculo circular por provocando distante com uma pinça fina para expor o plexo mioentérico. Evitar o alongamento excessivo. </li><li> Coloque imaging prato de volta no gelo e na mudança solução por meio fresco. </li><li> Prepare a 2 ml de mistura de enzima por prato [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), colagenase tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) em meio]. </li><li> Retirar pratos de gelo e adicione a mistura de enzimas a partir do passo 1.13. </li><li> Incubar pratos à TA durante 15 min com 5% de CO2 / 95% ar. </li><li> Preparações de tecido lavar com mídia 3 vezes e cantos re-pin. </li></ol> 2. Carregando Fluo-4 Dye NOTA: Evite a fotodegradação, trabalhando com luz limitada durante o manuseio de corantes fluorescentes e tecidos carregados com corantes indicadores. <ol><li> Prepare 4 uM Fluo-4 solução de carregamento. <ol><li> Adicionar 1,5 ml de mídia e 1,2 l de um estoque probenecida 250 mm a uma alíquota de 1,5 mL de 4 mM Fluo-4 estoque. 4 mM de Fluo-4 é preparada por adição de 11,4 ul de Pluronic F-127 (20% em DMSO; suplementado com 0,25% cremaphor-EL) a 50 ug de Fluo-4, AM. </li></ol></li><li> Incubar preps em Fluo-4 solução de carga durante 45 min numa incubadora de escuro a 37 ° C. </li><li> Remover da incubadora e lave preparações à mídia 3 vezes. </li><li> Meios de troca para meio contendo 200 uM de probenecid e incubar 15 min a 37 ° C antes de imagem. NOTA: Probenecid é uma droga que inibe transportadores multirresistência em neurônios. A adição desta droga inibe a capacidade dos neurónios para extrudir corantes e aumenta a marcação neuronal. -Carregamento a granel de Ca 2+ corantes indicadores na ausência de probenecida produz célula de carga, principalmente glial. A adição de probenecid permite a visualização das respostas neuronais e gliais. </li><li> Prepare Modificado Kretampão bs. <ol><li> Adicione um tampão de Krebs modificada de tal modo que as concentrações finais (em mm) dos componentes são como se segue: 121 de NaCl, 5,9 de KCl, 2,5 de CaCl2, 1,2 de MgCl2, 1,2 de NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO3, 1 pirúvico e ácido 8 glicose (pH ajustado para 7,4 com NaOH). Adiciona-se 3 uM de nicardipina e 1 uM escopolamina para inibir as contracções musculares durante Ca 2+ imagiologia e todo o monte dissecações. </li></ol></li></ol> 3. Imagem e Análise NOTA: Utilize pelo menos um equipamento básico de imagem com uma fonte de luz fluorescente, microscópio, uma câmera CCD qualidade e software de aquisição apropriado. Variar a adição de outros componentes, dependendo da fonte de luz e da aplicação específica. A roda de filtros e do obturador deve ser usado com uma fonte de luz xenon arco tradicional. No entanto, fontes de luz LED e sistemas de iluminação não requerem esses componentes. <ol><li> Posicione o recording câmara sob o microscópio e utilizando um sistema de perfusão de escoamento por gravidade, com vários reservatórios de seringas aquecidas estabelecer uma taxa de perfusão contínua de 2-3 ml / min de 37 ° C tampão de Krebs. Certifique-se para impedir a formação de bolhas de ar em ambas as linhas de entrada e de sucção ligada a um sifão de vácuo. </li><li> Traga o plexo desejados em foco sob iluminação de campo claro. Evitar overexposing tecido, o que pode levar a foto branqueamento. </li><li> Examine o Fluo-4 loading dentro de gânglios e selecione gânglios saudável para a imagem latente. / Gânglios danificadas insalubres irá apresentar autofluorescência ou pontuada morfologia e não deve ser usada para imprimir. </li><li> Uma vez gânglio é selecionado, desviar a trajetória da luz para a câmera e obter uma imagem ao vivo com software de aquisição de imagem. Certifique-se de que gânglio está em foco e definir a taxa de aquisição de imagens e tempos de exposição. NOTA: as taxas de aquisição de imagem e tempos vão variar de acordo com os eventos investigadores deseja gravar. Para a maioria dos experimentos, imagenssão tradicionalmente adquiridas a 0,5-1 Hz para as células gliais e até 10/02 Hz para os neurônios, porque as respostas glial Ca 2+ não são tão rápido como Ca 2+ transientes em neurônios. </li><li> Comece a experiência e estabelecer actividade de base por 30 s. </li><li> Aplicar drogas pré-aquecidas de interesse, tais como agonistas e antagonistas utilizando o sistema de perfusão de fluxo por gravidade a um caudal de 2-3 ml / min. Siga aplicação de agonistas / antagonistas de retorno a uma perfusão de tampão normal e permitir um período de lavagem / recuperação de pelo menos 10 min. NOTA: Os tempos de aplicação de drogas pode variar dependendo do composto individual e desenho experimental. Em geral, uma aplicação de 20-30 seg agonista é suficiente para activar a proteína G de receptores acoplados em neurónios e células gliais. Entretanto, os canais iónicos dependentes de ligante (como receptores nicotínicos de acetilcolina) exigem épocas de aplicação de, no máximo, 5-10 seg. As exposições da duração causará canais iônicos ligando fechado para dese rapidamentensitize. Antagonistas deve ser aplicada durante aproximadamente 3-15 minutos para assegurar o bloqueio completo das vias do receptor. No entanto, esta é uma generalização grosseira e os investigadores devem sempre otimizar qualquer droga experimental em seu paradigma particular. </li><li> Parar a gravação e exibição de filme de lapso de tempo do experimento. Selecionar cuidadosamente regiões de interesse (de ROI) usando o software de análise de imagem adequada. </li><li> Use software para normalizar e comparar ROI intensidade de fluorescência contra o seu valor fluorescente linha de base inicial. Alterações na fluorescência normalizada são directamente proporcionais às variações na [Ca 2+]. <ol><li> Utilize uma modificação de um método descrito anteriormente 26 utilizando Af / F = ((F 1 - 0 F) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / 0 F) do fundo, em que F1 é a fluorescência em qualquer ponto e F0 é a fluorescência de base, para melhorar a precisão de avaliação. Isso ajuda a modificaçãona redução do ruído a partir de alterações de fluorescência em preparações de tecidos que apresentam movimento da camada muscular subjacente ao plexo mioentérico. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As metodologias descritas neste manuscrito fornecem uma abordagem consistente para estudar efetivamente neurônios e glia entérica no ENS. Embora a imagem de neurônios e glia entérica em cultura tenha produzido uma riqueza de informações sobre a função de células individuais, estudar essas células em seu ambiente multicelular nativo é crucial para nossa compreensão de sua fisiologia e fisiopatologia. A microscopia de fluorescência é uma técnica crucial para avaliar as interações multidirecionais das células no SNE. O carregamento de células do SNE com marcadores fluorescentes seletivos e a aquisição de imagens com microscopia de alta resolução permitem observações quantitativas da atividade celular no SNE. A imagem de amostras de tecido vivo do ENS é realizada de forma relativamente rápida e gera grandes quantidades de dados funcionais e espaciais aprofundados. As preparações de plexo mioentérico e submucoso de camundongos usadas nesses experimentos permitem abordagens de manipulação molecular e genética. A imagem de Ca2+ em preparações de montagem completa fornece uma ferramenta útil para a avaliação das interações neurônio-glia.
Em paradigmas experimentais avançados, várias sondas podem ser combinadas para obter informações sobre diferentes eventos dentro das células. A microscopia de fluorescência pode registrar imagens com contraste aprimorado de moléculas específicas, se um rótulo fluorescente apropriado for usado. O Fluo-4 foi escolhido porque possui uma grande faixa dinâmica. Tempo de incubação suficiente é vital ao usar os corantes AM no ENS. A concentração do corante e o método de carregamento podem precisar ser ajustados para obter melhores resultados. As preparações ideais devem ser carregadas com corante suficiente para visualizar as mudanças na fluorescência, mas não tanto que o corante quele os íons alvo e interfira na sinalização intracelular. A exposição à luz fluorescente deve ser limitada para evitar fototoxicidade nas células e fotobranqueamento de corantes. 
Os investigadores devem ter cuidado com várias etapas deste experimento, especialmente a solução e a preparação do tecido. Cuidados especiais devem ser tomados durante o processamento e dissecção do tecido ENS para manter as funções celulares. O trato gastrointestinal contém várias camadas e variedades de tecidos, o que representa desafios para a dissecção e a qualidade da imagem nessas preparações de montagem total 27. Além disso, os tratos de fibra de interconexão do MP são mais largos e os gânglios são maiores que os do SMP 2. A densidade neuronal do plexo mioentérico é maior em comparação com a do plexo submucoso 28. Dissecções lentas e imprecisas terão efeitos prejudiciais na qualidade das preparações do plexo e, portanto, no sucesso geral dos experimentos. Portanto, ferramentas limpas/não danificadas, prática e destreza manual são essenciais para este procedimento. 
Em preparações de tecidos de montagem total, deve-se considerar cuidadosamente ao desenhar as regiões de interesse (ROI) para avaliar corretamente a cinética e o grau de mudança observada na intensidade de fluorescência do tipo de célula desejado. Como os gânglios estão localizados em uma camada muscular contrátil, os artefatos de movimento causados pela motilidade intestinal são uma preocupação primária durante a imagem in situ . Assim, suprimir esses distúrbios de movimento por meio da refixação de preparações de tecido após a incubação com enzimas e a adição de inibição farmacológica (nicardipina / escopolamina) aos tampões permite uma aquisição de imagem clara e confiável. Além da farmacologia e abordagens mecânicas para prevenir o movimento do tecido, estudos recentes ilustram a aplicação de metodologias avançadas de software e características de resposta do tipo de célula para corrigir o movimento do tecido residual nas gravações e melhorar a precisão da análise 29. Salvo esses obstáculos técnicos, este método fornece condições fisiologicamente relevantes para avaliar as características morfológicas e quantitativas dos neurônios e da glia entérica no SNE.

O sistema nervoso entérico (ENS) está organizado em dois plexos ganglionados embutidas na parede do trato digestivo 1. Estes circuitos neurais intramusculares, o plexo mientérico (MP) e plexo submucosa (PMS), são compostas de neurónios e células da glia entérico (Figura 1) 2. O MP e SMP regular gastrointestinais (GI) funções tais como a motilidade intestinal e absorção epitelial e secreção, respectivamente 3. Glia Entérico estão localizados em estreita proximidade com os neurônios dentro gânglios mas populações de glia entérico também existem dentro interligando tratos de fibras e porções extra-ganglionares da parede do intestino 3,4. Glia entéricos foram originalmente acreditado para fornecer apenas suporte nutritivo para os neurônios. No entanto, estudos recentes sugerem fortemente que as interações neurônio-glia são essenciais para ENS funciona 5,6. Por exemplo, os dados mostram que as células da glia entérico &quot;ouvir&quot; a actividade neuronal 7e modulam circuitos neuronais 6,8, proteger os neurônios entéricos de estresse oxidativo 9 e são capazes de gerar novos neurônios entéricos em resposta à lesão 10,11. O protocolo apresentado nesta revisão técnica fornece um método simples e robusta para examinar a complexa interação entre neurônios e células gliais entéricas usando in situ Ca2 + intracelular de imagem. Ca 2+ é uma molécula de sinalização onipresente em células excitáveis ​​e desempenha um papel essencial em eventos de sinalização sináptica no sistema nervoso 12. Excitação de neurônios ou células gliais entéricas provoca uma elevação na concentração citoplasmática de Ca2 + ou pelo influxo através de canais de Ca2 + -permeable ou Ca 2+ liberação dos estoques intracelulares de cálcio. Imagem Ca 2 + transientes em neurônios e células gliais com corantes fluorescentes é uma técnica amplamente utilizada para estudar a organização funcional e dinâmica do estabelecido ea 13-17 ENS. Ca 2+ de imagem tem se mostrado uma ferramenta importante no estudo de segmentos de tecido GI intactas para elucidar a propagação da excitabilidade por meio de redes de marcapasso ICC 18 e intestino músculo liso 19,20. Ele permite que os pesquisadores para investigar um amplo espectro de parâmetros fisiológicos e fornece informação sobre as sua distribuição espacial e dinâmica temporal. As células podem ser eficientemente manchado de forma minimamente invasiva por meio de indicadores fluorescentes à membrana permeável e protocolos de coloração otimizados 21. Isto oferece a oportunidade de monitorizar um grande número de neurónios e células da glia entérico em preparações funcionalmente conservados 14-16,22, bem como in vivo 23. Whole mount-preparações de tecido são granel carregado com um corante indicador de afinidade elevada de Ca 2+, tais como Fluo-4 que aumenta a sua fluorescência quando ligados a Ca 2+. Mudanças na fluorescência são registradas por uma câmera CCD e analisadas digitalmente 6. O advento da Ca 2+ proporcionou a oportunidade de acompanhar de neurônios e células glia interações, a capacidade de resposta a vários estímulos, e o envolvimento desses tipos de células em processos gastrointestinais em tempo real. In situ Ca 2+ imaging rendeu grande visão sobre os mecanismos de sinalização de neurônios entéricos e glia e possui diversas vantagens em relação aos modelos de cultura de células 6,24. Primeiro, in situ preparações manter o ambiente da matriz nativa de neurônios e células gliais e deixar a maior parte de suas conexões para atingir tecido intacto. Em segundo lugar, a genética e morfologia da glia entérico culta é significativamente alterada em comparação com in vivo 6,24. Terceiro, muitas interacções heterotípicos são perdidos em cultura de células primárias e estabelecer limites, que avaliam as interacções célula-célula. Embora as células cultivadas são bem adequados para a investigação de propriedades fundamentais, a sua usefulness para o estudo de interações complexas entre glia e neurônios entéricos é limitado. Investigando interação neurônio-glia utilizando uma abordagem in situ é mais fisiologicamente relevante como as vias sinápticas permanecem intactos 25. Em comparação com as abordagens de cultura de células, uma abordagem em situ oferece melhores condições para compreender sistematicamente as interações complexas entre neurônios e glia entérico. Além disso, a organização planar do plexo ganglionados em preparações inteiras de montagem é ideal para imagens fluorescentes de Ca 2+ intracelular transientes e esta técnica fornece uma abordagem simples para avaliar a atividade do neurônio-glia na ENS.

<table><tbody><tr><td>Aquecedor de Seringa BubbleStop</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Colgenase, Tipo II, pó</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de estágio fixo DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td>&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM corante</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de insetos</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td> iQ Software de imagem de células vivas <td></td></tr><tr><td></td><td>Andor Andor</td><td>iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo câmera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipina</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td> <td>de perfusão</td> Bomba peristáltica personalizada <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>Modelo 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sondas Moleculares Probenecidas Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Escopolamina</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td>Controlador de Temperatura <td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca 2+ imagem do sistema nervoso entérico

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Os comportamentos reflexos do intestino são controlados pelo sistema nervoso entérico (ENS). O ENS é uma rede integrativa de neurônios e glia em dois plexos ganglionares alojados na parede intestinal. Os neurônios entéricos e a glia entérica são os únicos tipos de células dentro dos gânglios entéricos. A atividade dos neurônios entéricos e da glia é responsável pela coordenação das funções intestinais. Este protocolo descreve métodos para observar a atividade de neurônios e glia dentro do ENS intacto por meio de imagens de transientes de cálcio intracelular (Ca2+) com corantes indicadores fluorescentes. Nossa discussão técnica se concentra em métodos para imagens de Ca2+ em preparações de montagem total do plexo mioentérico do intestino de roedores. O carregamento em massa de montagens inteiras ENS com um indicador de Ca2+ de alta afinidade, como o Fluo-4, permite medições de respostas de Ca2+ em neurônios individuais ou células gliais. Essas respostas podem ser evocadas de forma repetida e confiável, o que permite estudos quantitativos usando ferramentas farmacológicas. As respostas de Ca2+ nas células do ENS são registradas usando um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) resfriada. As medições de fluorescência obtidas usando imagens de Ca2+ em preparações de montagem inteira oferecem um meio direto de caracterizar os mecanismos e as possíveis consequências funcionais das respostas de Ca2+ em neurônios entéricos e células gliais.

A utilização adequada desta técnica permite aos investigadores para medir com precisão de Ca2 + intracelular [Ca2 +] i transientes em neurônios entéricos e glia em todo o monte preparações de tecido. Um exemplo representativo de um evocou-agonistas Ca 2+ respostas em glia dentro de um gânglio myenteric do cólon do rato é mostrado no vídeo 1. Os resultados a seguir são destinadas a ilustrar alguns resultados representativos temos obtidos utilizando este método. Em primeiro lugar, a Figura 2 ilustra os resultados de uma experiência de medição da glia entérico [Ca 2+] i alterações em resposta à estimulação por ATP dentro do cólon de cobaia longitudinal do plexo mientérico do músculo (PMLM preparações). Especificamente, esta figura mostra o método de análise apropriada do protocolo experimental listadas acima, incluindo o contorno do gânglio e asteriscos denotam a localização dos neurónios entéricos mientérico analisados. Estes resultados também illustrate a dose ideal de cem ATP micromolar sobre a mobilização de [Ca2 +] i em cobaias glia myenteric. Esta resposta pode ser utilizado para calibrar a estimulação da glia entérico e normalizar as respostas a estímulos testar. A seguir, a figura 3 elucida como seleccionar adequadamente as regiões de interesse (ROI) que envolve as células gliais, mostrado com circundante círculos amarelos. Estes resultados também mostram que as alterações de fluorescência desejadas em condições basais e em resposta a estímulos farmacológicos. Finalmente, a Figura 4 mostra as considerações espaciais para a escolha de glia entérico e neurônios para [Ca2 +] i respostas em preparações Todo-mount. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Figura 1. Organização das ENS. A ENS contém dois principais plexos ganglionados. O plexo mioentérico está localizado entre o lcamadas musculares ongitudinal e circulares. O plexo submucosa está situado entre a mucosa e da camada muscular circular. A ENS é exclusivamente composta de neurônios e células gliais entérico. Tratos de fibras do nervo conectar os gânglios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Figura 2. Entérico glia na cobaia colônica plexo mioentérico respondem ao ATP in situ. (A) Fluo-4 fluorescência em um gânglio myenteric (delineado pela linha tracejada) em condições basais. As setas apontam para feixes de fibras interganglionic espessura. (B) Após a estimulação com 100 mmol / L ATP, as células gliais, mas não neurônios, aumentar rapidamente Fluo-4 fluorescência indicando um aumento da [Ca 2+] <sub&gt; i. Note-se que as células que respondem são pequenos e rodear os neurónios muito maiores (espaços escuros marcados por asteriscos). (C) glia entérico responder ao ATP de um modo dependente da dose com 1 mmol / L eliciar respostas máximas de 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ler um versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Figura 3. Murino células S-100-GFP + no cólon respondem plexo mientérico de ATP in situ. (A) células gliais (verde) em um rato do cólon gânglio mientérico S-100-GFP + (descritos pela linha tracejada). Seis regiões de interesse (ROI) que envolve as células gliais dentro do gânglio são mostrados como círculos amarelos. As setas indicam tratos de fibras grossas que levam até o gânglio. Os asteriscos dlocalização enote de 2 neurônios entéricos. (B) Same gânglio mostrando Rhod-2 de fluorescência em condições basais. (C) Após a estimulação com 100 mmol / L ATP, as células gliais responder com aumento [Ca2 +] i, como mostrado pelo aumento Rhod- 2 de fluorescência. (D) Traces correspondente a cada ROI mostrado na A-C. (E) resposta média (média ± SEM) das 6 ROIs mostrados na D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Figura 4. Em imagiologia in situ de comunicação entérico neurónio-glia-a. (A) (Imagens representativas pseudocolored) a partir de uma experiência de imagem Ca 2+ onde um todo-mountpreparação de plexo mientérico foi desafiado com o agonista do receptor P2X7 neuronal BzATP (100 pM, 30 s). Note-se que o agonista neuronal provoca um aumento na fluorescência Fluo4 no neurónio (A &#39;), antes de as células gliais circundantes entéricos (A &quot;). (B) Análise da alteração na fluorescência ao longo do tempo em células da glia (azul) e os neurónios (vermelho ) após a aplicação do agonista neuronal, BzATP. (C) neuronal e da glia respostas de BzATP em tampão normais (linhas sólidas) e em tampão com baixo Ca 2+ e Mg 2+ (linhas tracejadas) para potenciar receptores P2X7 neuronais 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1. evocada pelo agonista Ca 2+ em resposta glia entéricositu. Este vídeo mostra um gânglio myenteric do cólon distal do rato carregado com o Ca 2+ corante indicador, Fluo-4. O agonista de células da glia, ADP, é adicionado ao banho, quando indicado. ADP provoca um aumento intracelular de Ca2 + em glia entérico como observado pela elevação transitória em Fluo-4 fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens da atividade de neurônios e gliócitos entéricos em preparações inteiras vivas de intestino utilizando corantes fluorescentes indicadores de cálcio. Isso é realizado primeiramente removendo uma porção do intestino do animal e colocando-a em um meio pré-aquecido. O segundo passo consiste em abrir o intestino ao longo da borda mesentérica e afixá-lo plano sob leve tensão, com a superfície mucosa voltada para cima.Preparações em lâmina inteira do plexo mioentérico são preparadas por microdissecação e colocadas em placas para imagem. Em seguida, as preparações em lâmina inteira são carregadas com um corante fluorescente indicador flu oh four em um incubador. Nas etapas finais, as preparações carregadas são visualizadas usando um microscópio de imagem fluorescente equipado com uma câmera de alta resolução controlada por software de aquisição e análise de imagens para registrar a atividade basal.Em seguida, adicionam-se as drogas em estudo e registram-se os transientes de cálcio em neurônios e gliócitos. Em última instância, in situ. A imagem de cálcio do sistema nervoso entérico é utilizada para investigar como a atividade celular em neurônios e gliócitos contribui para a regulação das funções fisiológicas intestinais e para a disfunção do sistema nervoso entérico na fisiopatologia intestinal.As implicações dessa técnica estendem-se para o estabelecimento de uma compreensão da fisiologia e da fisiopatologia dos distúrbios intestinais funcionais e da doença inflamatória intestinal por meio do uso de um método simples e robusto para examinar a complexa interação entre neurônios e gliócitos entéricos, utilizando a imagem de cálcio em duas células NC. O procedimento aqui demonstrado será disponibilizado gratuitamente aos cientistas a partir do meu laboratório. Os seguintes procedimentos envolvendo tecidos de animais de laboratório são compatíveis com as diretrizes da A VMA para eutanásia de animais de 2013 e foram aprovados previamente pelo comitê I-A-C-U-C da Michigan State University. Após a eutanásia do animal conforme os procedimentos aprovados, posicione o animal em posição supina e limpe a pele sobre o abdômen com etanol a 70%. Use pinça para pinçar a pele abdominal na linha média e, em seguida, use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão medial de seis centímetros ao longo da linha alba, expondo os órgãos digestivos internos.Em seguida, use pin&ccedil;as rombas para localizar e expor o c&oacute;lon dentro do perit&ocirc;nio. Corte o mesent&eacute;rio do c&oacute;lon &iacute;leo com tesoura e comece a desenrolar o intestino. Uma vez que o comprimento do intestino esteja adequadamente desenrolado, corte o c&oacute;lon distal ao ceco e proximal ao reto para um preparo do intestino grosso, o qual ser&aacute; mostrado neste v&iacute;deo.Em seguida, remova rapidamente o segmento intestinal e coloque-o em um béquer contendo meio DM EMF 12 suplementado com tr&ecirc;s micromolares de nicardipina hidrocloridrato e um micromolar de escopolamina hidrocloridrato, sobre gelo. A adi&ccedil;&atilde;o desses inibidores facilita a microdisseca&ccedil;&atilde;o e a subsequente imagem, paralisando o m&uacute;sculo liso intestinal. Remova um pequeno segmento de quatro a seis cent&iacute;metros do segmento intestinal desejado e coloque-o em uma placa de Petri revestida com Sylgard&reg;, preenchida com meio suplementado gelado.Em seguida, fixe as extremidades proximal e distal do segmento intestinal com alfinetes para insetos e abra o tubo intestinal fazendo um corte reto no sentido longitudinal ao longo da borda mesentérica. Agora, estenda o tecido plano sob leve tensão, com a mucosa voltada para cima, e dissecar cuidadosamente a camada mucosa levantando a mucosa com pinça fina número cinco e cortando por baixo com tesoura de mola muito fina. Corte o tecido em preparações menores de aproximadamente 0,5 centímetros quadrados e coloque cada pedaço em uma placa de imagem preenchida com meio suplementado, mantendo-a sobre gelo.Fixe cada preparação em quatro cantos com a camada de músculo circular voltada para cima. Disseque cuidadosamente o músculo circular separando-o com pinças finas. Para expor o plexo mientérico, evite alongamentos excessivos, coloque novamente as placas de imagem sobre gelo e substitua a solução em cada placa por meio suplementado fresco.Em seguida, retire os recipientes do gelo e adicione dois mililitros da mistura enzimática a cada recipiente, incubando em temperatura ambiente com 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 15 minutos. Por fim, lave as preparações teciduais com meio três vezes e reinsira os cantos enquanto trabalha em condições de luz limitada para evitar fotobranqueamento, utilizando 1,5 mililitro de meio suplementado e 1,2 microlitro de uma solução estoque de probit de 250 milimolar para uma Eloqua de 1,5 microlitro de uma solução estoque de Fluro quatro de quatro milimolar, adicionando aproximadamente 1,5 mililitro da solução de carregamento de flu oh quatro aos recipientes de imagem e incubando em um incubador escuro a 37 graus Celsius por 45 minutos. Após retirar os recipientes do incubador, lave as preparações três vezes com meio.Em seguida, adicione meio fresco contendo 200 micromolar de ácido propiônico para realçar a marcação neural e incubar novamente por 15 minutos. Durante a incubação, prepare um tampão de Krebs modificado de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo e adicione três micromolar de nicardipina e um micromolar de escopolamina para inibir contrações musculares. Durante a imagem de cálcio dois mais e dissecções em montagem inteira, posicione a câmara de gravação sob o microscópio de fluorescência e utilize um sistema de perfusão por gravidade com reservatórios de seringas aquecidos múltiplos.Estabeleça uma taxa de perfusão contínua de dois a três mililitros por minuto de tampão de Krebs a 37 graus Celsius. Certifique-se de prevenir a formação de bolhas de ar tanto na linha de entrada quanto na linha de sucção conectada a uma armadilha a vácuo. Coloque o plexo desejado em foco sob iluminação de campo claro.Evite a superexposição do tecido, o que pode levar ao fotoenvelhecimento. Examine a carga de flu oh quatro nos gânglios e selecione gânglios saudáveis para a imagem. Gânglios danificados e não saudáveis apresentarão autofluorescência ou morfologia pontuada e não devem ser usados para imagem.Uma vez que um gânglio é selecionado, desvie o trajeto da luz para a câmera e obtenha uma imagem em tempo real. Com o software de aquisição de imagens, certifique-se de que o gânglio esteja em foco e defina a taxa de aquisição de imagens e os tempos de exposição. As taxas e tempos de aquisição de imagens variarão dependendo dos eventos que os pesquisadores desejam registrar. Para a maioria dos experimentos, as imagens são tradicionalmente adquiridas entre 0,5 e um hertz para células gliais e até dois a 10 hertz.Para neurônios, como os transientes de cálcio gliais não são tão rápidos quanto os transientes de cálcio nos neurônios, inicie a gravação e estabeleça a atividade fisiológica de base do gânglio escolhido na ausência de estímulos experimentais durante 30 segundos. Em seguida, aplique os fármacos de interesse pré-aquecidos, como agonistas e antagonistas de receptores, utilizando o sistema de perfusão por gravidade a uma taxa de dois a três mililitros por minuto, de acordo com um protocolo otimizado para o seu fármaco. Pare a gravação e visualize o filme com lapso de tempo do experimento.Selecione cuidadosamente as regiões de interesse ou ROIs utilizando o software apropriado de análise de imagens. Por fim, utilize um software de imagem adequado para normalizar e comparar a intensidade fluorescente das regiões de interesse em relação ao seu valor inicial de linha de base. As alterações nos valores de fluorescência normalizada são diretamente proporcionais às alterações no cálcio. As três imagens a seguir demonstram que os gliócitos entéricos no porquinho-da-índia respondem a um TP in situ.Em condições basais, um baixo nível de fluorescência da fluoro quatro, conforme delimitado pela linha tracejada, é visível. As setas indicam os espessos tratos fibrilares interganglionares; após estimulação com 100 micromol por litro de ATP, as células gliais, mas não os neurônios, aumentam rapidamente a fluorescência da fluoro quatro, indicando um aumento no cálcio. Observe que as células responsivas são pequenas e envolvem os neurônios muito maiores, indicados pelos espaços escuros marcados por asterisco.Este histograma mostra que os gliócitos entéricos respondem a um TP de maneira dependente da dose, com um milimol por litro provocando respostas máximas. Este vídeo mostra um gânglio mioentérico do cólon distal de camundongo carregado com um corante indicador de cálcio dois mais, flu oh quatro. O agonista de células gliais ADP é adicionado ao banho quando indicado.Um DP induz um aumento no cálcio intracelular dois mais nos gliócitos entéricos, conforme observado pelo aumento transitório na fluorescência de flu oh quatro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como examinar com precisão a interação complexa entre neurônios e gliócitos utilizando imagem de cálcio. A caracterização dos mecanismos e das possíveis consequências funcionais das respostas de cálcio em preparações de montagem inteira exige dissecações precisas para obter uma qualidade ideal de imagem.O uso de marcação fluorescente e estímulos farmacológicos dentro dessa técnica baseada em microscopia permite uma avaliação aprimorada dessas células em seu ambiente multicitular nativo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Vídeo Imagem e Mapas espaço-temporais para analisar Motilidade Gastrointestinal em Ratos

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