Imagem local Ca ²⁺ Sinais em células de mamíferos em cultura

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a aquisição, detecção e análise de sinais de cálcio mediados por IP três locais em células de mamíferos intactas usando imagens baseadas em câmeras. Isso é feito primeiro cultivando as células nos pratos de cobertura com fundo de vidro e carregando-as com as formas permeáveis à membrana celular do indicador de cálcio fluorescente. CAL cinco 20 e IP enjaulado três.

O segundo passo é posicionar a lamínula no palco de um microscópio invertido e iluminar a amostra com luz de 488 nanômetros para excitar o corante fluorescente sensível ao cálcio Cal five 20. Em seguida, os sinais locais de cálcio são induzidos pela exposição das células a um breve pulso de luz ultravioleta. Esta foto libera o IP três de um precursor enjaulado, de modo que agora pode se ligar ao receptor de acetol trifosfato e mediar a liberação de cálcio do retículo endoplasmático.

A etapa final é importar a pilha de imagens para o algoritmo escrito personalizado para iniciar a análise automatizada dos dados registrados. Em última análise, o algoritmo localiza rapidamente os locais de liberação de cálcio com resolução de subpixel, permite a revisão de dados pelo usuário e emite sequências temporais de sinais de razão fluorescente junto com dados de amplitude e cinética em um formato compatível com Excel. Essa abordagem permite a geração de imagens de centenas de canais ou eventos simultaneamente, mas produz muito mais dados do que as abordagens tradicionais e a enorme quantidade de dados gerados renderiza processamento manual, identificação visual e análise.

Impraticável demonstrar esse procedimento será Jeff Locke, um pós-doutorado do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare o tampão de carga diluindo as soluções de estoque de CAL cinco 20 e CI IP três até uma concentração final de cinco micromolares e um micromolar, respectivamente, em HBSS de cálcio. Em seguida, aspire os meios de cultura e lave as células com cálcio HBS S3 vezes.

Em seguida, remova o HBSS de cálcio e incube as células em tampão de carregamento por 60 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, remova o tampão de carregamento e enxágue as células com HBS S3 de cálcio vezes para facilitar o estudo dos sinais locais de cálcio, bloqueando as ondas de cálcio. Incubar as células com cinco EGTA micromolares am em HBSS de cálcio no escuro por 30 a 60 minutos à temperatura ambiente.

Após esta incubação, enxágue as células três vezes com HBSS de cálcio. Em seguida, incube as células em HBSS de cálcio por 30 minutos para permitir a esterificação D dos reagentes carregados imediatamente antes da imagem. Substitua o HBSS de cálcio por HBSS de cálcio fresco para remover qualquer corante que possa ter vazado para o banho durante a incubação final.

Neste procedimento, coloque uma pequena gota de óleo de imersão na objetiva 100 XAPO para grama. Em seguida, monte a placa de imagem no palco do microscópio invertido. Traga as células em foco usando luz transmitida.

Em seguida, ilumine as células com a luz de um laser azul. Para excitar o CAL cinco 20, colete a fluorescência emitida usando uma câmera EMCC de alta velocidade. Usando o software E-M-C-C-D.

Reduza o campo de imagem do total de 512 por 512 pixels para coletar dados na resolução temporal necessária para capturar eventos locais de cálcio. Configure o software para registrar automaticamente alguns segundos de atividade de linha de base e, em seguida, forneça um flash UV às células para evocar uma frequência desejada de eventos locais de cálcio e continue gravando por mais 10 a 30 segundos. No final, salve os arquivos como pilhas de imagens para análise offline.

Neste procedimento, converta os arquivos de imagem para o formato de arquivo TIFF multiplano. Localize a pasta que contém o algoritmo de análise escrito personalizado e clique duas vezes em executar exe. Em seguida, selecione o arquivo TIFF a ser analisado.

Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Determine o nível de preto a ser deslocado da pilha de imagens movendo o cursor para uma parte do campo de visão que não contenha uma célula ou inserindo manualmente um nível de preto usando o prompt definir nível de preto. Em seguida, o algoritmo executará quatro janelas na tela que aparecem após a análise pelo software.

C é uma imagem monocromática da fluorescência em repouso das células que estão sendo analisadas. Os quadrados brancos sobrepostos a esta imagem são locais de eventos determinados como as posições OID de funções gaussianas bidimensionais ajustadas aos eventos. Use a tecla do cursor para frente ou para trás para percorrer os locais de atividade de sopro na janela C.Ao fazer isso, a atividade em cada local apresentada como fundo subtraída A taxa de fluorescência suave gaussiana muda, atualiza na janela D.Em seguida, clique em um evento destacado em vermelho para atualizar a janela E que exibe a evolução temporal do evento.

Em seguida, clique na janela F, que exibe o perfil espacial do evento calculado ao longo de seu curso de tempo. Juntamente com o perfil espacial da função gaussiana ajustada, revise manualmente os eventos que foram identificados para que os artefatos possam ser rejeitados da análise. Exclua esses eventos clicando com o botão direito do mouse nos eventos destacados em vermelho.

Exporte os dados selecionando salvar no Excel ou exporte dados por célula desenhando ao redor da célula de interesse e selecionando salvar célula. Aqui é mostrada uma imagem monocromática de fluorescência Cal five 20 em repouso na qual os locais dos sinais de cálcio mediados por IP local três foram sobrepostos e são indicados pelos círculos brancos. Estes são os traços correspondentes que ilustram os sopros evocados em três locais diferentes.

Em resposta à liberação da foto do IP três de seu precursor enjaulado, os eventos destacados em vermelho são os sopros identificados como tendo se originado desse local específico. Os traços sobrepostos dos sopros de cálcio representativos são alinhados e mostrados em uma escala expandida, e esta figura mostra a imagem da pegada de grama monocromática da fluorescência cal cinco 20 em SH SY cinco células Y carregadas com CI IP três e círculos brancos EGTA denotam as origens do local do sopro. Os traços ilustram sopros evocados em três locais diferentes, que correspondem aos círculos brancos na imagem.

Os traços sobrepostos de sopros de cálcio representativos são alinhados e mostrados em uma escala expandida. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens de sinais locais de cálcio em células intactas de mamíferos e também usar nosso algoritmo para automatizar a análise de dados registrados. A natureza de alto rendimento do algoritmo para automatizar a identificação e análise de eventos locais de cálcio é altamente útil para obter imagens de canalopatias de cálcio em estados de doença por meio de modelos de célula única, como doença de Alzheimer e transtorno do espectro do autismo.