Name: Imagem local Ca 2+ Sinais em células de mamíferos em cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a capturar sinais locais de Ca²⁺ mediados por IP3 em células de mamíferos intactas usando microscopia de fluorescência e algoritmo automatizado. Este método permite analisar dinâmica de cálcio com alta resolução.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede GM 100201 para IFS e GM 048071 e GM 065830 para IP

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca 2+ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca 2+ intracelular sinais em muitos tipos de células 8-10. 1. Preparação de células <ol><li> Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor. </li><li> Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco de cultura de tecidos com 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (2-3 min). Após separação, adicionar um volume igual de meio de cultura para inactivar a tripsina. </li><li> Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro e as células em pratos de semente de imagem de fundo de vidro, a uma densidade de 3-7 x 10 4 culas por prato. Selecione as células para experimentos com imagens quando chegar a 60% de confluência (2-3 dias). </li></ol> 2. Preparação de Soluções e Reagentes <ol><li> Prepare uma CA 2+ molecular contendo tampão HEPESsolução de sal de (Ca 2+ -HBSS) composto por (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, e 10 de glucose; pH = 7,4 à temperatura ambiente (TA) com NaOH. Prepare Ca 2+ -HBSS sem a adição de glicose e armazenar a 4 ° C; adicionar a solução de glicose imediatamente antes da utilização. </li><li> Solubiliza-se formas de membrana permeante do Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520 (1 mM), ci-IP 3 (200 uM), e EGTA (100 mM) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) contendo 20% de Pluronic F-127. Alíquota estes reagentes em tubos Eppendorf e armazenamento, protegido da humidade e da luz, à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 3. Carregando Cells com uma membrana de permeant Cal-520, ci-IP 3 e EGTA <ol><li> Preparar o &quot;tampão de carga&quot; diluindo soluções de reserva de permeante da membrana Cal-520 e ci-IP 3 até uma concentração final de 5 uM e 1 uM, respectivamente, em Ca 2+ -HBSS. </li><li> Aspirar cumedia LTURE e lavar as células através da substituição de mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. </li><li> Remover Ca 2+ -HBSS e incubar as células em tampão de carga, durante 60 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Remover tampão de carregamento e enxaguar células, substituindo mídia com Ca 2+ -HBSS três vezes. <ol><li> Se desejado, nesta etapa, as células de carga com EGTA / AM por diluição da solução de reserva até uma concentração final de 5 uM em Ca 2+ -HBSS e, em seguida, as células incubar durante 30-60 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após esta incubação, lavar as células três vezes com Ca 2+ -HBSS antes de prosseguir para o passo 3.5. </li></ol></li><li> Incubar as células em Ca 2+ -HBSS durante 30 min para permitir a desesterificação de reagentes carregados. </li><li> Imediatamente antes de imagem, substitua Ca 2+ -HBSS com &quot;fresco&quot; Ca 2+ -HBSS, a fim de remover qualquer corante que pode ter vazado para o banho durante a incubação final. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Aquisição de Imagem <ol><li> Coloque uma pequena gota de óleo de imersão para o objetivo 100X APO TIRF (NA 1,49). </li><li> Montar o prato de imagem na fase do microscópio invertido e trazer as células em foco utilizando luz transmitida. É importante proteger o prato de imagem para impedir o movimento durante a gravação. </li><li> Iluminar as células com um laser de 488 nm, a fim de excitar Cal-520 e recolher a fluorescência emitida (λ&gt; 510 nm) usando uma câmara EMCCD alta velocidade. NOTA: O pacote de software que opera o microscópio permite ao utilizador para traduzir uma lente de focagem, permitindo que o feixe de laser a ser introduzido quer no bordo extremo da abertura traseira objectivo (por excitação TIRF) ou mais centralmente (para a excitação &quot;WF&quot;). </li><li> Usando o software EMCCD, reduzir o campo de imagem a partir da plena 512 x 512 pixels, a fim de coletar dados na resolução temporal necessário para capturar Ca 2+ eventos locais. NOTA: Por exemplo, quad centeraquisição de 256 x 256 pixels acelera a taxa de aquisição de 66 fps. Também é possível aumentar ainda mais a taxa de quadros da câmera EMCCD para 500 fps usando uma função Modo de recorte isolado. </li><li> Configure o software para gravar automaticamente alguns segundos de atividade basal, entregar um flash UV para as células e continuar a gravação para outra 10-30 seg. NOTA: Um lampejo de UV é entregue utilizando uma fonte de luz de arco de xénon introduzido através de um espelho dicróico UV reflectindo na porta traseira do microscópio. A duração e intensidade do lampejo de UV é ajustado empiricamente para evocar uma frequência desejada de Ca 2+ acontecimentos locais. </li><li> Salvar arquivos como imagem pilhas para análise off-line. </li></ol> 5. Automated Ca 2+ Análise Imagem NOTA: É possível visualizar, processar e analisar dados capturados usando muitos pacotes de software comerciais. No entanto, temos desenvolvido um algoritmo para automatizar rapidamente uma identificaçãod análise de Ca 2+ sinais locais. Uma descrição detalhada dos filtros espaciais e temporais utilizados neste algoritmo, a geração dos Af / F 0 e identificação / rotinas de análise pode ser encontrado em 11. Este algoritmo foi desenvolvido para rodar na plataforma Python software open-source, e pode ser obtido, juntamente com a amostra de dados experimentais e instruções detalhadas de usuários, pelo autor correspondente e-mails (ismith@uci.edu). <ol><li> Converta arquivos a serem importados para o algoritmo escrito sob medida para o formato de arquivo multi-plano .tiff. </li><li> Localize a pasta que contém o algoritmo de análise e dê um duplo clique no run.exe. </li><li> Selecione o arquivo .tiff a ser analisado. </li><li> Escolha os parâmetros de análise na caixa de diálogo aberta. Veja a Figura 2A para parâmetros padrão para os dados de exemplo. </li><li> Determinar o nível de preto para ser deslocada da pilha pela imagem seja movendo o cursor para uma parte do campo de visão que n fazot conter uma célula (ver Figura 2B) ou digitando manualmente um nível de preto usando o prompt de &#39;Black Nível Definir&#39;. </li><li> Observe quatro janelas na tela seguinte análise pelo software (Figura 2C-F). C é uma imagem monocromática de descansar fluorescência a partir de células que está sendo analisado. Quadrados brancos sobrepostos na imagem são os locais de evento, determinados como as posições centróide funções de Gauss bidimensionais que equipam os eventos. </li><li> Clique em cada local do evento ou pressione as teclas do cursor para navegar entre os eventos. Ao fazê-lo a subtracção do fundo, Gaussian alisou mudanças de relação de fluorescência (Af / F 0) em cada um desses sites de atualização na janela D. NOTA: Red destacou os acontecimentos estão determinados a se originam de que determinado site e não de &quot;sangrar-through &#39;de atividade localizada para locais adjacentes. O traço azul mais baixo indica que o sinal de fluorescência no local seleccionado excedeu a detecçãolimiar, enquanto que a linha preta identifica eventos provenientes desse local particular (que corresponde ao vermelho eventos realçado). </li><li> Clique sobre um evento vermelho destaque para actualizar a janela E que mostra a evolução temporal do evento, e a janela F, que mostra o perfil espacial do evento, calculados sobre o curso de tempo, em conjunto com o perfil espacial da função de Gauss ajustada. </li><li> Manualmente todos os eventos que foram identificados para que os artefatos podem ser rejeitada de análise. Excluir tais eventos clicando o botão direito no vermelho destacou os acontecimentos. NOTA: Em nossas mãos, fluxo de Ca2 + através dos canais individuais IP 3 R evoca sinais com Af / F 0 cerca de 0,11, então é provável que sejam falsos positivos quaisquer &#39;eventos&#39; detectados sensivelmente menores do que isso. </li><li> Exportar dados Ao selecionar &#39;Salvar em Excel &quot;ou exportação de dados em uma base por célula desenhando em torno da célula de interesse e selecionando&quot; Salvar CellR17 ;. NOTA: Os dados são salvos na mesma pasta que a pilha de imagem original. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
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<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
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<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca 2+ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca 2+ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 + sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficientemente ...

Os íons de cálcio (Ca 2+) ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica 1. Uma maneira através da qual Ca 2+ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca 2+ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca 2+] contração gatilho no tecido muscular liso 2 Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca 2+ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória 3 gene. Citosólico livre [Ca 2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 + no citosol através de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 + a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3 R), que forma um canal de Ca2 + de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos IP3 e Ca 2+ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R 3 se abre para libertar o Ca2 + sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 + pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP 3 Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 + (Ca2 + sopro 4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP 3 Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 + induzida por Ca2 + -release (CICR) 5,6. A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca 2+ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien 7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca 2+ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca 2+ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em&gt; 500 quadros seg -1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca 2+ eventos canal 8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos. 2+ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca 2+ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de Ca2 + eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI 3 -generated Ca 2+ sinais, eles são facilmente recuperáveis ​​para estudar alterações locais na citosólica [Ca 2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 + de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares 8-10.

<table><tbody><tr><td>Células SH-SY5Y de neuroblastoma humano</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-isopropilideno-6-O-(2-nitro-4,5-dimetoxi)benzil-mio-inositol 1,4,5-trifosfato-hexakis(propionoximetil) Éster</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% plurônico F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de imagem com fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem local ca<sup&gt; 2+</sup&gt; sinais em células de mamíferos em cultura

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Citossólica Ca 2+ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca 2+ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca 2+ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca 2+ microdomínios (Ca 2+ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de 2+ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros&gt; 500 s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca 2+ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local 3 mediada por Ca 2+ sinais em células de mamíferos intactos carregados com Ca2 + indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca 2+ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca 2+ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP 3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP 3 suscitou transientes de Ca2 + puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP 3 ...

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a aquisição, detecção e análise de sinais de cálcio mediados por IP três locais em células mamíferas intactas, utilizando imagem baseada em câmera. Isso é realizado primeiramente cultivando as células em placas de cultura com fundo de vidro e carregando-as com as formas permeáveis à membrana celular do indicador fluorescente de cálcio. CAL cinco 20 e IP três fotocofreado.O segundo passo é posicionar o lamínula sobre a platina de um microscópio invertido e iluminar a amostra com luz de 488 nanômetros para excitar o corante fluorescente sensível ao cálcio Cal five 20. Em seguida, sinais locais de cálcio são induzidos expondo as células a um breve pulso de luz UV. Esta foto-libera IP três a partir de um precursor "caged", permitindo que ele agora se ligue ao receptor de acetil trisfosfato e media a liberação de cálcio do retículo endoplasmático.O passo final consiste em importar a pilha de imagens para o algoritmo desenvolvido especificamente para iniciar a análise automatizada dos dados registrados. Em última instância, o algoritmo localiza rapidamente os locais de liberação de cálcio com resolução subpixel, permite a revisão dos dados

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

As propriedades e funções dos sinais intracelulares de Ca2+ dos astrócitos no estriado permanecem incompletamente exploradas. Descrevemos métodos para expressar indicadores de cálcio geneticamente codificados em astrócitos estriados usando vírus adeno-associados do sorotipo 2/5 (AAV2/5), bem como procedimentos para obter imagens confiáveis de sinais de Ca2+ em astrócitos estriados in situ.

Imagens intracelular Ca 2+ Sinais em estriado astrócitos de ratos adultos, através de indicadores de cálcio geneticamente codificados

Este artigo descreve um protocolo para a detecção de um ou mais plasma e/ou proteínas de membrana intracelular usando microscopia de super-resolução depleção do estado fundamental (GSD) em células de mamíferos. Aqui, vamos discutir os benefícios e as considerações do uso de tais abordagens para a visualização e a quantificação de proteínas celulares.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

Ca2 + indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca2 + imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca2 + é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca2 + sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca2 + sinalização em Situ

Aqui nós apresentamos um protocolo para Ca2 + imagem em neurônios e células gliais, que permite que a dissecação de Ca2 + sinais em resolução subcellular. Este processo é aplicável a todos os tipos de células que permitem a expressão de geneticamente codificado Ca2 + indicadores.

Dissecação de locais de Ca2 + sinais em pilhas cultivadas pelos indicadores de membrana-alvo Ca2 +

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para resolver sinais locais iniciais de Ca2+ , conhecidos como microdomínios de Ca2+ , em células T murinas e humanas primárias usando microscopia de fluorescência. Este protocolo serve como um recurso valioso para pesquisadores que examinam as vias de sinalização de Ca2+ dentro das células imunes e para desvendar ainda mais sua função.

Imagem de microdomínios iniciais de Ca2+ em células T primárias

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

Aprenda a capturar sinais locais de Ca²⁺ mediados por IP3 em células de mamíferos intactas usando microscopia de fluorescência e algoritmo automatizado. Este método permite analisar dinâmica de cálcio com alta resolução.

Imagem local Ca

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