Name: Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma In Vitro Prion Conversão Protein Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprenda a avaliar barreiras de espécie em encefalopatias espongiformes transmissíveis usando um ensaio in vitro de conversão de proteína priônica. Este método substitui desafios em animais vivos.

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Agradecemos a John Olsen (Departamento de Recursos Naturais de Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O'Brien e Steve Schmitt (Departamento de Recursos Naturais de Michigan) e ao Dr. Daniel Walsh (Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem do USGS) pela assistência na aquisição de tecidos. Também agradecemos ao Laboratório de Higiene do Estado de Wisconsin pelos serviços de testes de diagnóstico e à Dra. Tonie Rocke e sua equipe (USGS National Wildlife Health Center) pelo uso do equipamento. Qualquer uso de nomes comerciais, de produtos ou de empresas é apenas para fins descritivos e não implica endosso do governo dos EUA.

Trabalho animal realizado no USGS Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem foi realizada de acordo com o Escritório de NIH diretrizes Laboratory Animal Welfare e sob cuidados com os animais institucional e comissão uso protocolo # EP080716. Os tecidos de animais colhidas-caçadores estavam presentes do Wisconsin ou Michigan Departamentos de Recursos Naturais. 1. Preparação de Solução NOTA: As soluções listados abaixo são necessários para a preparação do substrato ensaio CER na Seção 2 abaixo. Preparar cada uma destas soluções a partir de soluções de estoque de concentração mais elevados; concentrações recomendadas para soluções de estoque será dada entre parênteses após cada respectivo nome químico listado. Prepare todas as soluções frescas sobre a preparação do substrato e armazenar a 4 ° C até ser utilizado. <ol><li> Para tampão de lise, prepare uma solução de o seguinte em 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 solução estoque recomendado): 100 mm scloreto de ódio (NaCl, 1 M de solução de estoque), 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0, solução de estoque), NP-40 (solução de reserva a 10%) 0,5%, 0,5% de desoxicolato (DOC, solução estoque de 10% ). </li><li> Para conversão tampão, preparar uma solução de dodecil sulfato de sódio a 0,05% (SDS, solução de estoque a 10%) e 0,5% de Triton X-100 (solução a 10% de estoque) em solução salina tamponada com fosfato 1 (PBS, 10, pH 7,4 solução estoque). </li><li> Para soluções caotrï¿½icas, preparar dois 3 M soluções de guanidina (GdnHCl, 8 M de ações) em 1x PBS (solução estoque 10x). Ajustar o pH de uma das soluções a 3,5 ± 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado (HCl). Verificar se o pH da segunda solução se mantém a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar usando HCl concentrado ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário. </li></ol> 2. Prepare Pairs CER ensaio de substrato <ol><li> Obter, o tecido cerebral não-TSE-infectado saudável a partir de espécies de interesse e preparar um volume peso-por-10%(W / v) homogeneizado em tampão de lise utilizando qualquer um dos seguintes métodos: Dounce, grânulo-moinho, ou homogeneização almofariz e pilão. Refinar resultando homogeneizados submetendo-os a seringa e agulha homogeneização, utilizando agulhas de aumento de calibre até substrato pode ser aspirado e expulso com facilidade através de uma seringa de agulha 27 G. <ol><li> Para substratos preparados a partir de roedores e outros pequenos mamíferos, homogeneizar cérebro inteiro (s); para substratos preparados a partir de mamíferos maiores, usar óbex (tronco cerebral) para preparar homogenatos de tecido. Ao seleccionar a quantidade de homogenato de cérebro, preparar não mais do que 50% da capacidade da centrifugadora usada para a precipitação de proteína no passo 2.6. </li><li> Se a qualidade do tecido cerebral adquirida é questionável, avaliar os níveis de PrP C por SDS-PAGE e imunotransferência 16 17 antes da preparação do substrato. </li></ol></li><li> Divida homogeneizado de cérebro em dois volumes iguais em tubos cônicos separados rotulados de plástico. Adicionar GdnHCl (3 M em soluções de 1 PBS) a pH 3,5 ou 7,4 ou a cada tubo em uma proporção de 1: 1 de volume de homogenato de cérebro. </li><li> Verificar os valores de pH das duas soluções. Ajustar o pH a pH 3,5 ± substrato a pH 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado. Certifique-se de que o pH do outro substrato permanece a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar o pH, se necessário, com HCl ou NaOH, conforme necessário. Evite ultrapassar os valores de pH pela adição criterioso de ácido ou base. </li><li> Rodar soluções em um misturador de extremidade-a-extremidade, à temperatura ambiente (TA) durante 5 h. </li><li> Precipitar a proteína por adição de quatro volumes de metanol para as soluções de substrato em cada tubo cónico, vortex para misturar bem e incuba-se a -20 ° C durante 16-18 horas. </li><li> As amostras de sedimento por centrifugação a 13.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Cuidadosamente decantar e descartar os sobrenadantes e permitir que o metanol se evaporar a partir dos peletes. Use aplicadores com ponta de algodão para ajudar na absorção de metanol agarrado no interior do tubo. Não permita pelotas para o excesso de dry e uma vez que o metanol não é mais visível, passe para a próxima etapa. </li><li> Pelotas de proteína Ressuspender em tampão de conversão. Usar uma quantidade igual de tampão de conversão para a quantidade de material de partida homogenato de cérebro distribuído por cada tubo no passo 2.2. NOTA: É importante que o tampão de conversão utilizado para ressuspender peletes de proteína a partir de tanto um pH de 3,5 e preparações de substrato 7,4-tratados é a solução definido no passo 1.2 acima (o qual contém níveis baixos de detergentes e um pH fisiológico). </li><li> Soluções Resumidamente sonicate substrato num sonicator cuphorn (10 seg a ~ 30% de potência máxima), alíquota em 0,5-1,0 ml volumes em rotulados 1,5 ml microtubos. Realizar uma imunotransferência de controlo de qualidade (passo 2.9), numa alíquota de cada substrato. Guarde outras alíquotas a -80 ° C até que esteja pronto para realizar ensaio CER (Seção 4). </li><li> Executar o controlo de qualidade sobre os pares de substratos CER antes da utilização (Figura 2). Estas medidas asseguram que os substratos CER provide ótimos resultados em estudos de conversão. <ol><li> Certifique-se de quantidades comparáveis ​​de PrP C em dois substratos. Comparar os níveis de PrP em 10-25 mL de cada substrato por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting. Se os níveis de proteína em que o pH 7,4 e 3,5 são substratos dentro de ~ 10% uma da outra, os pares de substratos são apropriados para utilização em estudos de CER. NOTA: Os immunoblots PrP não devem mostrar evidências de uma forte degradação PrP C. A imunorreactividade da PrP devem ser principalmente&gt; 20 kDa. Bandas inferiores a essa massa molecular podem ser produtos de degradação. Padrões de bandas deve ser mais ou menos equivalente entre os pares de substrato. </li><li> À medida que a PrP C em ambos os substratos devem ser sensíveis PK, tratar 10-25 ul de cada substrato com PK a uma concentração final de 100 ug / ml e digerir as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador. Avaliar qualquer sinal PrP restante por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting.Substratos com res PrP não são apropriados para utilização em estudos de CER. </li></ol></li></ol> 3. Prepare Seeds TSE Agente <ol><li> Obter tecido cerebral TSE-infectados a partir de espécies de interesse e preparar a 10% (w / v) homogeneizado em 1x PBS pH 7,4, utilizando os métodos listados na etapa 2.1 acima. NOTA: As sementes também podem ser produzidos a partir de outros tecidos infectados com EET fora do sistema nervoso central, no entanto, a eficiência de conversão de substratos cerebrais derivadas de sementes derivadas de tecidos periféricos infectadas por EET ainda não foi experimentalmente avaliada na literatura publicada. </li><li> Aliquota homogenato resultante (s) em 100-300 ul volumes de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até estar pronto para executar o ensaio de CER. </li></ol> 4. CER Assay NOTA: O ensaio CER envolve a adição de uma quantidade relativamente pequena de PrP TSE (fornecido no &quot;semente&quot;) a partir de uma espécieem um excesso relativo de PrP C (fornecida no cérebro infectado &quot;substrato&quot;) a partir de uma outra espécie que foi parcialmente desnaturada a pH 3,5 ou 7,4 ou. Após um período de incubação prolongado agitação, a conversão baseada em modelos de PrP C por PrP TSE em cada reacção é avaliada pelo sinal densitométrica da PrP remanescente após a digestão res PK e detecção de imunotransferência. Comparando os níveis res PrP nos substratos previamente desnaturadas a pH 3,5 versus 7,4 fornece uma medida da barreira das espécies. Uma visão geral experimental deste procedimento de ensaio é fornecida na Figura 1. <ol><li> Lentamente descongelar pares substrato CER não infectados (ensaio requer volumes iguais de substratos previamente desnaturado, tanto pH 3,5 e 7,4) e soluções de sementes TSE-infectadas, colocando-os em cima de uma cama de gelo (cerca de 1 hr tempo degelo). </li><li> Uma vez completamente descongelado, e depois aspirado expulsar cada solução através de um substrato27 g de agulhas de seringa várias vezes para homogeneizar re-lo. Resumidamente sonicate cada solução semente TSE-infectados por 10 s em ~ 30% da potência máxima. Mantenha todas as soluções em gelo enquanto se prepara reações de conversão. </li><li> Etiqueta 5 individuais baixa ligação, de paredes finas tubos de PCR por agente TSE está sendo testado. </li><li> Prepare reacções de conversão em destes tubos por adição de 5 uL de solução de sementes infectadas por EET 10% a 95 ul de (a) substrato CER preparados a pH 7,4 e (b) substrato CER preparado a pH 3,5. <ol><li> Para cada amostra experimental, prepare reações paralelas em pares substrato CER previamente desnaturado, tanto a pH 3,5 e 7,4. </li><li> Otimizar os rácios de sementes agente TSE para substrato cérebro não infectado através da determinação empírica. Semente comum: rácios de substrato empregues manter um volume de reacção total de 100 uL e incluem ul 1:99, 2:98 e 5:95 ul ul. Para a maioria das aplicações, a semente 5:95 ul: proporção em volume de substrato e é apropriado é o que é apresentado no thé protocolo. </li></ol></li><li> Preparar três amostras de controlo por agente da EET serem testados como se segue: (a) adicionam-se 5 ml de solução de sementes infectadas por EET 10% a conversão de 95 ul de tampão como um controlo para a entrada res PrP; adicionar 5 uL de tampão de conversão de 95 ul de substrato preparada em (b) pH 3,5 e (c) a pH 7,4 como controlos para a conversão não-específico, não modelada. </li><li> Resumidamente vortex cada amostra em seu tubo de PCR fechado para misturar sementes e substrato bem. Siga com um pulso momentânea numa baixa velocidade de topo de bancada de mini-centrifugadora para remover qualquer volume da mistura de reacção preso na tampa do tubo de PCR. </li><li> Amostras de Carga em tubos de PCR-rotulados individualmente em cima da bancada thermo-shaker equipados para aceitar tubos PCR. Agitar as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Após agitação, adicionar sarcosil a uma concentração final de 2% (w / v) e PK a uma concentração final de 100 ug / ml. Digest amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador. NOTA: A adição de sarcosil a amostras auxiliares pós-conversão na digestão PK de PrP C. Sinais positivos falsos em amostras unseeded (passo 4.5) são praticamente eliminadas pela adição de Sarkosyl. </li><li> Adicionar tampão de amostra de SDS-PAGE, as amostras de calor a 95 ° C durante 5 minutos e res PrP resolver restantes em cada amostra por SDS-PAGE 16 seguida de imunotransf erência 17. NOTA: Após a adição de tampão de amostra e de aquecimento, as amostras podem ser processadas imediatamente ou amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C antes da imunomancha. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos usando os sistemas de gel e de transferência Novex NuPAGE. As amostras individuais de ensaio CER foram tratadas com tampão de amostra e o agente redutor de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram, subsequentemente, aquecida a 95 ° C durante 5 min e 30 ul de cada amostra foi carregada em 12% Bis-Tris géis pré-moldados. </li><li> Calcule o índice de eficiência de conversão (CER) como uma medidade barreira das espécies. Avalie os níveis de res PrP por densitometria 17 e dividir a densidade total da amostra pH 7,4 por que do pH 3,5 amostra. Multiplique por 100 para produzir uma porcentagem. </li><li> Compilar dados de réplicas experimentais independentes para gerar uma média CER ± desvio-padrão para uma espécie com um determinado agente TSE. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para a conclusão deste protocolo, a atenção deve ser dada aos níveis de PrP C no tecido cerebral infectado utilizado para a preparação do substrato (passo 2.1.2) e as sementes ao substrato razão para reações de conversão (etapa 4.4.2). Na nossa experiência, o cérebro pode ser extraída para uso como substrato CER depois de um período substancial de pós-mortem, enquanto a PrP C está presente por imunotransferência (Figura 4). Na verdade, alguns autólise foi observada nos cérebros dos...

Encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET, doenças de príon) são um grupo de doenças neurodegenerativas fatais com longos períodos de incubação que afetam uma variedade de animais e seres humanos. O agente etiológico da EET putativo é composto por um isómero enrolamento incorrecto da proteína prião de acolhimento (PrP), que é capaz de se auto-propagação por conversão baseada em modelos da forma celular normal da PrP (PrP C) para uma doença infecciosa, doença associada formulário (PrP TSE) que se acumula nos tecidos do sistema nervoso central do hospedeiro infectado 1. Príons infecciosos mamíferos geralmente transmitem a partir de-host-to anfitrião de uma forma específica da espécie, o que deu origem ao conceito da &quot;barreira das espécies TSE&quot; limitando eventos de transmissão entre espécies 2. Os determinantes biológicos da barreira das espécies de prião não são bem compreendidos. Similaridade de sequência de aminoácidos entre o infecciosa PrP TSE eo anfitrião PrP C cum influenciam fortemente se a conversão ocorre 3-5, mas continua a ser insuficiente para explicar todos os eventos de transmissão de prion observados in vivo 6,7. Assim, a caracterização da barreira de espécie TSE foi amplamente invocado estudos de provocação em animais: exposição dos animais ingênuos de uma determinada espécie de prions de outro e medindo o tempo de incubação resultante para o início da doença e taxa de ataque como indicadores de eficiência de transmissão. Ratos que expressam PrP C a partir de espécies heterólogas são também utilizados para este tipo de estudo de 8. Os custos associados à produção de camundongo transgênico e bioensaios prião prolongadas, bem como considerações éticas do uso de animais, são obstáculos para a investigação experimental de espécies TSE barreiras. Avaliação da barreira da espécie humana às TSE conta com ratos geneticamente modificados para expressar humano PrP C. Estes ratos exigem longos períodos de incubação de sucumbir às TSE humanos ou modificações a Tele humana molécula PrP C para início rápido da doença 9. Os períodos de incubação das EET não humana nesses camundongos pode estender-se para além do tempo de vida normal do mouse dificultando a interpretação dos resultados negativos desafiadoras. Os primatas não humanos também têm sido utilizados como proxies para estudar barreiras espécie humana, mas estes estudos são preocupantes com os mesmos desafios que outros tipos de experimentos com animais e primatas não-humanos não podem recapitular precisa da doença, uma vez que prossegue no hospedeiro humano. Bioensaios em animais continuam a ser o método &quot;padrão ouro&quot; para medir a susceptibilidade de uma espécie para a TSE, mas os obstáculos, custos e ética destes estudos em animais vivos têm obrigado investigação sobre alternativas. Um certo número de ensaios in vitro, com base na avaliação da conversão da PrP C hospedeiro para uma proteinase K (PK) estado -resistente (res PrP) quando semeadas por PrP TSE, foram desenvolvidos e utilizados para investigar TSE spECIES barreiras 10-12. Exemplos de ensaios in vitro incluem ensaios livres de células de conversão, proteína misfolding amplificação cíclica (CMAP), e o índice de eficiência de conversão (CER) ensaio 10-14. Embora nenhum destes ensaios de levar em conta fatores periféricos envolvidos em barreiras das espécies após a infecção natural, tudo pode ser útil para identificar os anfitriões potencialmente sensíveis para as EET. Aqui apresenta-se o protocolo para o ensaio de CER, em que dois substratos desnaturados PrP C derivadas de homogenatos cerebrais normais são utilizados em reacções de conversão de topo de bancada de prião (Figura 1) 13. PrP C no substrato desnaturada a pH 7,4 só pode ser convertido em res PrP por PrP TSE semeadas em a reacção na ausência de uma barreira 14 espécies. Em contraste, a desnaturação da PrP C no outro substrato a pH 3,5 permite que seja convertido ao PrP res após incubaçãocom PrP TSE de quaisquer espécies e serve como um controlo para a conversão. A proporção de conversão da PrP C e PrP no res de pH 7,4 em relação ao substrato que o substrato de pH 3,5 dá uma medida da barreira das espécies. Descobrimos que o ensaio CER prediz conhecido espécies barreiras de ratos de laboratório para vários EET e ter usado o ensaio em esforços para prever a barreira das espécies de numerosas espécies de mamíferos, incluindo carneiros selvagens, a doença debilitante crônica (CWD) e outras EET 14, 15. Os investigadores interessados ​​em uma ferramenta que permite a verificação rápida de espécies TSE barreiras ou avaliação da conversão PrP C -para-PrP res vai encontrar esta metodologia útil.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE géis</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Grânulos de óxido de zircônio</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Outras variedades de grânulos também são eficazes</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td>vários fornecedores</td><td></td><td>Selecione anticorpos primários e secundários apropriados para detecção de immunoblot de PrPres de espécies de interesse</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td> <td>de grânulosPróximo Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>Alta velocidade com controle de temperatura</td></tr><tr><td>Tubos cônicos</td><td>de qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicador com ponta de algodão</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Cuphorn</td><td>Sistemas de Calor-Ultrassom</td><td>W-380</td><td>Sistemas de Calor-Ultrassom, Inc. agora é Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometria programa de software</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Software de aquisição e análise de imagens</td><td>Outros programas, como o NIH ImageJ, também funcionarão</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de ponta a ponta</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetraacético</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Produto químico perigoso: irritação ocular</td></tr><tr><td>Cloridrato de guanidina, 8</td><td>M Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, irritação ocular</td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Produto químico perigoso: tampão</td></tr><tr><td>de amostra de dodecil sulfato de lítio de ácido forte, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Produto químico perigoso: pele e irritação respiratória, danos oculares graves, sólido inflamável</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda, líquido inflamável</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>de qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrífuga</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Produto químico perigoso: irritação da pele, danos aos olhos</td></tr><tr><td>Sistema de gel SDS-PAGE</td><td>Sistema de eletroforese Life Technologies NuPAGE</td><td>Outros sistemas SDS-PAGE também funcionarão</td><td></td></tr> com <tr><td>tubos de PCR (baixa ligação)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td> <td>de pilãoFisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de polivinildifluoreto</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Produto químico perigoso: irritação da pele e dos olhos, sensibilização respiratória, toxicidade de órgãos</td></tr><tr><td>Agente redutor para amostras SDS-PAGE, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6750</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação da pele, danos aos olhos, sólido inflamável</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Produto químico perigoso; base forte</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Biosciences</td><td>vários</td><td>Use o tamanho da seringa apropriado para volumes de substrato a serem homogeneizados</td></tr><tr><td>Agulhas de seringa</td><td>BD Biosciences</td><td>vários</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (agitador de tubo de PCR)</td> <td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Produto químico perigoso: pele, olhos, irritação respiratória</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Produto químico perigoso: toxicidade aguda, irritação ocular</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Científico</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliando encefalopatia espongiforme transmissível espécies barreiras com uma<em&gt; in vitro</em&gt; prion conversão protein assay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Estudos para entender a transmissão interespécies de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs, doenças priônicas) são desafiadores, pois normalmente dependem de estudos de desafio animal in vivo longos e caros. Vários ensaios in vitro foram desenvolvidos para ajudar a medir as barreiras das espécies de príons, reduzindo assim o uso de animais e fornecendo resultados mais rápidos do que os bioensaios em animais. Aqui, apresentamos o protocolo para um ensaio de conversão rápida de príons in vitro chamado ensaio de taxa de eficiência de conversão (CER). Neste ensaio, a proteína príon celular (PrPC) de um cérebro hospedeiro não infectado é desnaturada em pH 7,4 e 3,5 para produzir dois substratos. Quando o substrato de pH 7,4 é incubado com agente TSE, a quantidade de PrPC que se converte em um estado resistente à proteinase K (PK) é modulada pela barreira de espécies do hospedeiro original ao agente TSE. Em contraste, o PrPC no substrato de pH 3,5 é dobrado incorretamente por qualquer agente de EET. Ao comparar a quantidade de proteína príon resistente a PK nos dois substratos, uma avaliação da barreira de espécies do hospedeiro pode ser feita. Mostramos que o ensaio CER prevê corretamente as barreiras de espécies de príons conhecidas de camundongos de laboratório e, como exemplo, mostramos alguns resultados preliminares sugerindo que linces (Lynx rufus) podem ser suscetíveis ao agente de doença debilitante crônica de veado de cauda branca (Odocoileus virginianus).

A utilização bem sucedida do ensaio CER é em grande parte dependente da qualidade dos pares de substratos utilizados em reacções de conversão. Por esta razão, de acordo com procedimentos para preparar pares de substrato CER, uma imunotransferência de controlo de qualidade deve ser realizado (Figura 2). Para ambos substratos, ensaio 10-25 ul por imunotransferência. PrP C deve ser facilmente detectável em cada substrato e os níveis de PrP C deve ser aproximadamente a mesma entre os d...

Medir a barreira à transmissão interespécies de doenças priônicas é desafiador e normalmente envolve desafios em animais ou ensaios bioquímicos. Aqui, apresentamos um ensaio de conversão de proteína príon in vitro com a capacidade de prever barreiras de espécies.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a barreira de espécies das encefalopatias espongiformes transmissíveis, conhecidas como TSE, para uma espécie específica sem a necessidade de expor animais vivos ao agente infeccioso. Isso é realizado primeiramente preparando dois substratos para ensaio de conversão, utilizados em um ensaio in vitro. O segundo passo é incubá-los com os agentes TSE que se deseja testar.Após a digestão com proteinase K, as amostras são submetidas à eletroforese em gel de SDS e ao imunoblotting. O passo final é medir a quantidade de proteína PreOn resistente à proteinase K em cada substrato utilizando citometria D e comparar essas quantidades pelo cálculo de uma razão de eficiência de conversão ou CER. Em última análise, a CER fornece uma medida da barreira entre espécies para a EET testada em relação à espécie hospedeira da qual o substrato foi preparado.As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, curto período experimental e a substituição de animais vivos por amostras de tecido. Embora este método seja particularmente adequado para fornecer informações sobre as barreiras entre espécies em doenças priônicas silvestres, ele pode ser aplicado a qualquer outra espécie de interesse. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a preparação do substrato, controle de qualidade e padronização.Após obter tecido cerebral saudável e não infectado da espécie de interesse, prepare uma homogeneização a 10% peso por volume em tampão de lise utilizando um moinho de esferas ou almofariz e pistilo. Em seguida, refine ainda mais os homogeneizados submetendo-os a uma homogeneização com seringa e agulha, utilizando agulhas de calibre crescente até que o substrato possa ser aspirado e expelido com facilidade através de uma agulha de seringa de calibre 27. A seguir, divida o homogeneizado cerebral em dois volumes iguais em tubos cônicos plásticos separados e rotulados e adicione três molar de cloreto de guanidina em XPBS em pH 3,5 ou 7,4 a cada tubo numa proporção de um para um em volume em relação ao homogeneizado cerebral.Agora, verifique os valores de pH das soluções de substrato e use ácido clorídrico concentrado ou hidróxido de sódio conforme necessário para garantir que o pH de cada substrato permaneça dentro de mais ou menos 0,05 do pH alvo. Incube as soluções em um agitador rotacional do tipo end-over-end à temperatura ambiente por cinco horas. Em seguida, precipite a proteína adicionando quatro volumes de metanol às soluções de substrato em cada tubo cônico, vortexie bem e incube a menos 20 graus Celsius por 16 a 18 horas.Após a incubação, sedimente as amostras por centrifugação a 13.000 G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, decante e descarte cuidadosamente os sobrenadantes S e deixe o metanol evaporar dos pellets. Utilize aplicadores de algodão para auxiliar na absorção do metanol aderido ao interior do tubo.Não permita que os pellets sequem em excesso. Prossiga para a próxima etapa quando o metanol já não for visível, utilizando uma quantidade de tampão de conversão igual à quantidade de material inicial de homogenato cerebral para ressuspender os pellets proteicos. Após a ressuspensão, sonique brevemente as soluções de substrato por 10 segundos.Em um banho ultrassônico com ponteira, sonique a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, alíquotas das soluções em volumes de 0,5 a um mililitro em tubos microcêntrifuga de 1,5 mililitro identificados, considerando que a proteína priônica celular em ambos os substratos deve ser sensível à protease K. Trate 10 a 25 microlitros de cada substrato com protease K numa concentração final de 100 microgramas por mililitro e incube as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico. Carregue os substratos digeridos pela protease K, juntamente com 10 a 25 microlitros de cada substrato não digerido.Em um gel de SDS-PAGE, realize um bloqueio imuno com um anticorpo específico para a proteína priônica para avaliar a proteína priônica do hospedeiro, a resistência à proteinase K e os níveis de proteína não digerida. Esta imagem mostra os resultados do blot imunológico. As duas primeiras pistas contêm os substratos não digeridos e as duas pistas à direita contêm o substrato digerido pela proteinase K.Se os níveis de proteína nos substratos pH 7,4 e 3,5 estiverem dentro de aproximadamente 10% um do outro e não forem resistentes à proteinase K, os pares de substratos são apropriados para uso em estudos de CER; armazene outras alíquotas a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar o ensaio de CER. Agentes TSE devem ser manipulados utilizando precauções apropriadas de biossegurança e de acordo com as diretrizes institucionais. Após obter tecido cerebral infectado por TSE da espécie de interesse, prepare um homogeneizado de 10% peso por volume em um XPBS com pH 7,4, utilizando o método de homogeneização previamente usado para a preparação dos pares de substratos.Transferir os homogenatos resultantes para volumes de 100 a 300 microlitros em tubos microcentrífugos de 0,5 mililitro e armazenar a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar o ensaio CER. Para iniciar, descongele lentamente quantidades iguais dos substratos CER não infectados em pH 3,5 e 7,4, bem como os pares e as soluções sementes infectadas com TSE, colocando-os sobre uma cama de gelo por aproximadamente uma hora. Após o descongelamento, mantenha as soluções em gelo e, em seguida, re-homogeneíze-as aspirando e expelindo cada solução de substrato através de uma agulha de seringa de 27 graus.Em seguida, sonique brevemente cada solução infectada com TSE por 10 segundos a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, prepare as reações de conversão em tubos PCR de parede fina e baixa ligação, identificados, pipetando 95 microlitros de substrato CER preparado em pH 7,4, em duplicata, em dois dos tubos e 95 microlitros de substrato CER preparado em pH 3,5, em duplicata, em outros dois tubos.Em seguida, adicione cinco microlitros de solução de semente infectada 10% TSE a um tubo de cada substrato pH 7,4 e 3,5. Em paralelo, adicione cinco microlitros de tampão de conversão ao outro tubo de cada substrato pH 7,4 e 3,5 para controlar a conversão não específica e não templada. Além disso, prepare um controle para a proteína priônica resistente à proteinase K de entrada.Para cada agente TSE em teste, adicione cinco microlitros de solução semente infectada com TSE a 10% em 95 microlitros de tampão de conversão como controle. Vortexe brevemente cada amostra no tubo PCR fechado, com o dedo do pé e o substrato. Em seguida, realize um pulso momentâneo em uma mini centrífuga de bancada de baixa velocidade para remover qualquer volume da mistura reacional aprisionado na tampa do tubo PCR.Carregue os tubos em um agitador térmico de bancada equipado para aceitar tubos de PCR e agite as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por 24 horas no dia seguinte, adicione sarco celsa a uma concentração final de 2% peso por volume e proteinase K a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, digira as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico. Adicione tampão amostral SDS-PAGE, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos e separe a proteína PreOn resistente à pronase K remanescente em cada amostra por SDS-PAGE, seguido de imunoblotagem como anteriormente. Finalmente, calcule a razão de eficiência de conversão como uma medida da barreira entre espécies.De acordo com as instruções no protocolo escrito, o substrato do ensaio CER de camundongo, preparado em pH 7,4 ou 3,5, foi incubado com scrapie adaptado para camundongo RML, ovelha doméstica, scrapie clássico, doença crônica de desgaste em veado cauda-branca, ou cepa 263K de scrapie adaptado para hamster. No ensaio CER, as amostras-controle rotuladas como nenhuma continham uma quantidade igual de agente infeccioso e nenhuma amostra de substrato de camundongo foi analisada quanto à presença da proteína priônica resistente à proteinase K por imunoblot com anticorpo monoclonal SAF 83.Os valores brutos de tric para cada amostra são exibidos abaixo de cada faixa de proteína resultante da proteinase. Os níveis de proteína priônica resistente à proteinase K variaram entre os substratos de camundongo, desnaturados em pH 7,4 e inoculados com os diversos agentes EET. Embora a proteína priônica resistente à proteinase K tenha sido encontrada em todos os substratos, desnaturados em pH 3,5 e inoculados com um agente EET, este gráfico de barras mostra as médias das razões mais ou menos o desvio padrão entre os substratos de camundongo em pH 7,4 e 3,5 para cada agente infeccioso, com base em pelo menos três ensaios independentes.Letras minúsculas referem-se a subconjuntos estatisticamente homogêneos determinados por um valor de p inferior a 0,05, utilizando análise de variância. Com o método de diferenças mínimas significativas de Tookie Kramer, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de 48 horas se executada corretamente. O ensaio CER pode ser usado como uma avaliação inicial da existência de uma barreira de espécies EET que possa justificar ou tornar desnecessários estudos adicionais em animais vivos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar substratos, montar reações de conversão e calcular as razões de eficiência de conversão para avaliar barreiras entre espécies.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aqui nós descrevemos um ensaio de romance para o monitoramento e captação de prion tráfico por células do sistema imunológico imediatamente após a inoculação intraperitoneal de purificação e fluorescente rotulagem varas prion agregados de material cerebral infectado acompanhamento da sua absorção e movimento a partir do local da injeção e caracterizar as células mediadoras desses eventos.

Monitoramento células imunes Tráfico Rods Horas Prion fluorescente após a infecção intraperitoneal

Proteína de amplificação cíclica misfolding (PMCA) é um ensaio in vitro em para o estudo da conversão de prião e as barreiras de tensão e espécies. Também pode ser utilizado como um ensaio de detecção de prião.

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Incubar com uma enzima proteolítica para digerir os príons normais, deixando intactos os agregados resistentes.

Detecção de agregados de proteína príon mal dobrados em tecido cerebral de camundongo usando Western Blotting

Catadores têm potencial para translocam infecciosas transmissíveis prions encefalopatia espongiforme em suas fezes para áreas livres da doença. Nós métodos de detalhes usados ​​para determinar se prions de scrapie mouse adaptados permanecer infeccioso após a passagem que o trato digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), o consumidor comum de animais mortos.

Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

A propagação de agregados proteicos semelhante ao príon surgiu recentemente como implicada em muitas doenças neurodegenerativas. O objetivo deste protocolo é descrever como usar o nematóide C. elegans como um sistema modelo para monitorar a disseminação de proteínas e investigar fenômenos semelhantes a príons.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Este protocolo descreve uma metodologia de alta produtividade para a tela funcionalmente para herança à base de proteínas no S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Falta um método para avaliar áreas comumente usadas em ambientes de laboratório para contaminação por príons e descontaminação eficaz. O protocolo descrito aqui fornece os principais fundamentos para a implementação de um teste de segurança de príons em laboratório que pode ser facilmente modificado para atender às necessidades individuais de laboratórios específicos.

Teste de furto do laboratório de segurança de príons

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Aprenda a avaliar barreiras de espécie em encefalopatias espongiformes transmissíveis usando um ensaio in vitro de conversão de proteína priônica. Este método substitui desafios em animais vivos.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

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