Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a barreira de espécies das encefalopatias espongiformes transmissíveis, conhecidas como TSE, para uma espécie específica sem a necessidade de expor animais vivos ao agente infeccioso. Isso é realizado primeiramente preparando dois substratos para ensaio de conversão, utilizados em um ensaio in vitro. O segundo passo é incubá-los com os agentes TSE que se deseja testar.

Após a digestão com proteinase K, as amostras são submetidas à eletroforese em gel de SDS e ao imunoblotting. O passo final é medir a quantidade de proteína PreOn resistente à proteinase K em cada substrato utilizando citometria D e comparar essas quantidades pelo cálculo de uma razão de eficiência de conversão ou CER. Em última análise, a CER fornece uma medida da barreira entre espécies para a EET testada em relação à espécie hospedeira da qual o substrato foi preparado.

As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, curto período experimental e a substituição de animais vivos por amostras de tecido. Embora este método seja particularmente adequado para fornecer informações sobre as barreiras entre espécies em doenças priônicas silvestres, ele pode ser aplicado a qualquer outra espécie de interesse. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a preparação do substrato, controle de qualidade e padronização.

Após obter tecido cerebral saudável e não infectado da espécie de interesse, prepare uma homogeneização a 10% peso por volume em tampão de lise utilizando um moinho de esferas ou almofariz e pistilo. Em seguida, refine ainda mais os homogeneizados submetendo-os a uma homogeneização com seringa e agulha, utilizando agulhas de calibre crescente até que o substrato possa ser aspirado e expelido com facilidade através de uma agulha de seringa de calibre 27. A seguir, divida o homogeneizado cerebral em dois volumes iguais em tubos cônicos plásticos separados e rotulados e adicione três molar de cloreto de guanidina em XPBS em pH 3,5 ou 7,4 a cada tubo numa proporção de um para um em volume em relação ao homogeneizado cerebral.

Agora, verifique os valores de pH das soluções de substrato e use ácido clorídrico concentrado ou hidróxido de sódio conforme necessário para garantir que o pH de cada substrato permaneça dentro de mais ou menos 0,05 do pH alvo. Incube as soluções em um agitador rotacional do tipo end-over-end à temperatura ambiente por cinco horas. Em seguida, precipite a proteína adicionando quatro volumes de metanol às soluções de substrato em cada tubo cônico, vortexie bem e incube a menos 20 graus Celsius por 16 a 18 horas.

Após a incubação, sedimente as amostras por centrifugação a 13.000 G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, decante e descarte cuidadosamente os sobrenadantes S e deixe o metanol evaporar dos pellets. Utilize aplicadores de algodão para auxiliar na absorção do metanol aderido ao interior do tubo.

Não permita que os pellets sequem em excesso. Prossiga para a próxima etapa quando o metanol já não for visível, utilizando uma quantidade de tampão de conversão igual à quantidade de material inicial de homogenato cerebral para ressuspender os pellets proteicos. Após a ressuspensão, sonique brevemente as soluções de substrato por 10 segundos.

Em um banho ultrassônico com ponteira, sonique a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, alíquotas das soluções em volumes de 0,5 a um mililitro em tubos microcêntrifuga de 1,5 mililitro identificados, considerando que a proteína priônica celular em ambos os substratos deve ser sensível à protease K. Trate 10 a 25 microlitros de cada substrato com protease K numa concentração final de 100 microgramas por mililitro e incube as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico. Carregue os substratos digeridos pela protease K, juntamente com 10 a 25 microlitros de cada substrato não digerido.

Em um gel de SDS-PAGE, realize um bloqueio imuno com um anticorpo específico para a proteína priônica para avaliar a proteína priônica do hospedeiro, a resistência à proteinase K e os níveis de proteína não digerida. Esta imagem mostra os resultados do blot imunológico. As duas primeiras pistas contêm os substratos não digeridos e as duas pistas à direita contêm o substrato digerido pela proteinase K.

Se os níveis de proteína nos substratos pH 7,4 e 3,5 estiverem dentro de aproximadamente 10% um do outro e não forem resistentes à proteinase K, os pares de substratos são apropriados para uso em estudos de CER; armazene outras alíquotas a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar o ensaio de CER. Agentes TSE devem ser manipulados utilizando precauções apropriadas de biossegurança e de acordo com as diretrizes institucionais. Após obter tecido cerebral infectado por TSE da espécie de interesse, prepare um homogeneizado de 10% peso por volume em um XPBS com pH 7,4, utilizando o método de homogeneização previamente usado para a preparação dos pares de substratos.

Transferir os homogenatos resultantes para volumes de 100 a 300 microlitros em tubos microcentrífugos de 0,5 mililitro e armazenar a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar o ensaio CER. Para iniciar, descongele lentamente quantidades iguais dos substratos CER não infectados em pH 3,5 e 7,4, bem como os pares e as soluções sementes infectadas com TSE, colocando-os sobre uma cama de gelo por aproximadamente uma hora. Após o descongelamento, mantenha as soluções em gelo e, em seguida, re-homogeneíze-as aspirando e expelindo cada solução de substrato através de uma agulha de seringa de 27 graus.

Em seguida, sonique brevemente cada solução infectada com TSE por 10 segundos a aproximadamente 30% da potência máxima. Em seguida, prepare as reações de conversão em tubos PCR de parede fina e baixa ligação, identificados, pipetando 95 microlitros de substrato CER preparado em pH 7,4, em duplicata, em dois dos tubos e 95 microlitros de substrato CER preparado em pH 3,5, em duplicata, em outros dois tubos.

Em seguida, adicione cinco microlitros de solução de semente infectada 10% TSE a um tubo de cada substrato pH 7,4 e 3,5. Em paralelo, adicione cinco microlitros de tampão de conversão ao outro tubo de cada substrato pH 7,4 e 3,5 para controlar a conversão não específica e não templada. Além disso, prepare um controle para a proteína priônica resistente à proteinase K de entrada.

Para cada agente TSE em teste, adicione cinco microlitros de solução semente infectada com TSE a 10% em 95 microlitros de tampão de conversão como controle. Vortexe brevemente cada amostra no tubo PCR fechado, com o dedo do pé e o substrato. Em seguida, realize um pulso momentâneo em uma mini centrífuga de bancada de baixa velocidade para remover qualquer volume da mistura reacional aprisionado na tampa do tubo PCR.

Carregue os tubos em um agitador térmico de bancada equipado para aceitar tubos de PCR e agite as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por 24 horas no dia seguinte, adicione sarco celsa a uma concentração final de 2% peso por volume e proteinase K a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, digira as amostras a 1000 RPM a 37 graus Celsius por uma hora no agitador térmico. Adicione tampão amostral SDS-PAGE, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos e separe a proteína PreOn resistente à pronase K remanescente em cada amostra por SDS-PAGE, seguido de imunoblotagem como anteriormente. Finalmente, calcule a razão de eficiência de conversão como uma medida da barreira entre espécies.

De acordo com as instruções no protocolo escrito, o substrato do ensaio CER de camundongo, preparado em pH 7,4 ou 3,5, foi incubado com scrapie adaptado para camundongo RML, ovelha doméstica, scrapie clássico, doença crônica de desgaste em veado cauda-branca, ou cepa 263K de scrapie adaptado para hamster. No ensaio CER, as amostras-controle rotuladas como nenhuma continham uma quantidade igual de agente infeccioso e nenhuma amostra de substrato de camundongo foi analisada quanto à presença da proteína priônica resistente à proteinase K por imunoblot com anticorpo monoclonal SAF 83.

Os valores brutos de tric para cada amostra são exibidos abaixo de cada faixa de proteína resultante da proteinase. Os níveis de proteína priônica resistente à proteinase K variaram entre os substratos de camundongo, desnaturados em pH 7,4 e inoculados com os diversos agentes EET. Embora a proteína priônica resistente à proteinase K tenha sido encontrada em todos os substratos, desnaturados em pH 3,5 e inoculados com um agente EET, este gráfico de barras mostra as médias das razões mais ou menos o desvio padrão entre os substratos de camundongo em pH 7,4 e 3,5 para cada agente infeccioso, com base em pelo menos três ensaios independentes.

Letras minúsculas referem-se a subconjuntos estatisticamente homogêneos determinados por um valor de p inferior a 0,05, utilizando análise de variância. Com o método de diferenças mínimas significativas de Tookie Kramer, uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de 48 horas se executada corretamente. O ensaio CER pode ser usado como uma avaliação inicial da existência de uma barreira de espécies EET que possa justificar ou tornar desnecessários estudos adicionais em animais vivos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar substratos, montar reações de conversão e calcular as razões de eficiência de conversão para avaliar barreiras entre espécies.