Busulfan como Agente mielosupressores para a geração estável de alto nível de Medula Óssea quimerismo em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é substituir o compartimento da medula óssea de camundongos receptores por células da medula óssea de camundongos doadores que expressem ubiquitariamente a proteína verde fluorescente. Na ausência de irradiação. Isso é realizado primeiramente condicionando o camundongo receptor com injeções intraperitoneais seriadas do composto mielossupressor busulfano.

Em seguida, células da medula óssea são isoladas dos fêmures e tíbias de um camundongo doador que expressa ubiquitamente a proteína verde fluorescente. Por fim, as células da medula óssea doadoras são transplantadas para o camundongo receptor condicionado por meio de injeção na veia caudal. Em última análise, o sangue é coletado do camundongo transplantado e analisado por citometria de fluxo para estimar o grau de quimerismo da medula óssea.

As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como a irradiação corporal total, são que um alto grau de quimerismo de medula óssea pode ser estabelecido sem os efeitos citotóxicos da irradiação corporal total e sem a necessidade de instalações e equipamentos especializados. Este método não apenas permite investigar o acúmulo de células derivadas da medula óssea no sistema nervoso central, mas também pode ser utilizado para estudar temas de pesquisa como o desenvolvimento de linhagens hematopoiéticas, imunobiologia e leucemia. Para condicionar os camundongos receptores, prepare busulfano diluído de acordo com o protocolo descrito no texto e utilize injeção intraperitoneal para administrar 20 miligramas por quilograma diariamente aos camundongos receptores.

Após eutanasiar os camundongos de acordo com as diretrizes institucionais, sob uma capela de fluxo laminar, pulverize um camundongo com etanol a 70%. Levante a pele na região abdominal e, com tesoura cirúrgica, faça uma incisão na pele partindo da cavidade abdominal, subindo pela perna em direção ao tornozelo, segurando o pé. Puxe firmemente a pele do tornozelo em direção ao quadril, expondo o tecido da perna.

Retire o músculo e a gordura do fêmur para expor a articulação do quadril enquanto puxa suavemente o pé. Para estender a perna, pressione a tesoura contra os ossos da pelve e corte logo acima da cabeça do fêmur, tomando cuidado para não cortar o próprio fêmur. Para ajudar a manter a esterilidade, segure a perna pelo pé e limpe qualquer tecido remanescente do fêmur usando a tesoura e tecidos autoclavados para esfregar a superfície do osso.

Seccione o fêmur e a tíbia cortando através da articulação do joelho e coloque o fêmur em uma placa de cultura contendo PBS, incubando no gelo. Em seguida, remova e descarte a fíbula cortando nos pontos onde ela se conecta à tíbia. Depois, limpe a tíbia.

Remova o pé cortando a tíbia onde a medula vermelha termina e coloque a tíbia na placa de cultura junto com o fêmur, mantendo em gelo. Use pinça para segurar o fêmur e, com tesoura cirúrgica, retire cuidadosamente as extremidades distais do osso. Remova o mínimo necessário do osso para expor a cavidade medular com três mililitros de PBS estéril.

Encha uma seringa e acople uma agulha de 23 graus. Introduza cuidadosamente a agulha na cavidade medular e lave a medula óssea para um recipiente de cultura estéril. Utilize a ponta da agulha para raspar a cavidade medular, garantindo a remoção de todas as células desejadas após a extração.

Certifique-se de que a medula óssea vermelha não esteja mais visível e de que o osso agora pareça branco. Use uma pinça para segurar a tíbia e, com uma tesoura cirúrgica, retire cuidadosamente a extremidade onde a tíbia estava ligada ao joelho. Para expor a cavidade medular, encha uma seringa com três mililitros de PBS estéril e acople uma agulha de 25 graus.

Fure cuidadosamente com a agulha na cavidade medular e lave a medula óssea para o recipiente com medula óssea coletada dos fêmures. Com uma ponteira de pipeta de um mililitro, pipete suavemente a medula óssea para dissociar as células. Passe a suspensão celular através de um filtro de malha de 40 micrômetros para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros.

Use PBS para lavar a placa e recolher quaisquer células remanescentes, transferindo o tampão através do filtro para o tubo de centrífuga. Adicione PBS ao tubo, obtendo um volume final de 30 a 40 mililitros, e centrifugue a 450 × g e 4 °C por cinco minutos. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante.

Re-suspenda o pellet com três mililitros de tampão de lise de eritrócitos e incube no gelo por 8,5 minutos. Em seguida, adicione cerca de 30 mililitros de PBS estéril para inativar o tampão de lise, centrifugue e descarte o sobrenadante. Use um mililitro de PBS estéril para ressuspender o pellet e mantenha-o no gelo.

Com PBS, dilua uma pequena quantidade de homogenato celular e utilize um hemocitômetro para contar as células. Dilua a suspensão celular até oito vezes 10 à sexta potência de células por mililitro e incube no gelo até a injeção. Para realizar o transplante de medula óssea, adicione 300 microlitros da suspensão celular diluída a uma seringa de 0,5 mililitro.

Para cada camundongo a ser injetado, certifique-se de remover todas as bolhas de ar. Coloque a gaiola com os camundongos receptores condicionados sobre uma placa aquecida e permita que as veias da cauda dilatem. Coloque um camundongo receptor em um dispositivo de contenção de tamanho apropriado, limpe a cauda com gaze cirúrgica embebida em etanol 70%, segure firmemente a cauda e, com o bisel voltado para cima, insira suavemente a agulha em uma das veias laterais da cauda e injete a suspensão celular.

Mantenha uma gaze cirúrgica no local da injeção até que o sangramento pare. Antes de introduzir o camundongo em uma nova gaiola limpa, aproximadamente duas a três semanas após o transplante de medula óssea, coloque o camundongo em um tubo de contenção e retire a pelagem da pata traseira para expor a veia safena lateral. Em seguida, aplique uma fina camada de geléia petrolatum na pata e use uma agulha de 25 gauge para perfurar a veia safena com um tubo capilar revestido com heparina.

Colete cerca de 50 microlitros de sangue e, em seguida, use gaze cirúrgica para estancar o sangramento. Após cessar o sangramento, devolva o camundongo à gaiola. Adicione o sangue a um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de buffer fax.

Agite o tubo por inversão e mantenha-o no gelo. Centrifugue as amostras de sangue a 900 × g durante cinco minutos. Após remover e descartar o sobrenadante, use 500 microlitros de tampão lisante de eritrócitos para ressuspender o precipitado e incube no gelo por 8,5 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de tampão fax para interromper a ação do tampão lisante e centrifugue a 900 × g durante cinco minutos.

Após a lise e uma segunda centrifugação, de acordo com o protocolo descrito, verifique se o pellet agora está branco. Se estiver vermelho, repita a etapa de lise pela terceira vez, ressuspendendo. Suspenda o pellet em tampão fax e utilize citometria de fluxo para quantificar a proporção de células positivas para GFP.

Este gráfico mostra os níveis de quimerismo quantificados semanalmente no sangue periférico de camundongos condicionados com 100 miligramas por quilograma de busulfano recebendo um transplante de medula óssea alogênico bem-sucedido e camundongos condicionados com 80 miligramas por quilograma de busulfano recebendo um transplante de medula óssea alogênico malsucedido. Níveis de quimerismo superiores a 80% são tipicamente estabelecidos entre três e quatro semanas após o transplante de medula óssea; os dados representativos aqui mostrados do sangue periférico indicam um transplante de medula óssea bem-sucedido e malsucedido três semanas após o procedimento. Esses dados de citometria de fluxo demonstram que um alto grau de quimerismo permanece estabelecido por pelo menos um ano na medula óssea e que o condicionamento com veículo não é suficiente para induzir quimerismo na medula óssea.

Embora não haja diferenças significativas nos níveis de quimerismo medular alcançados com doses de 60 a 100 miligramas por quilograma de busulfano, as células GFP positivas se acumulam no sistema nervoso central de maneira dependente da dose. Esta figura ilustra o acúmulo de células derivadas da medula óssea GFP positivas na região lombar da medula espinhal de um camundongo selvagem, e em maior extensão em um modelo murino da doença neurodegenerativa esclerose lateral amiotrófica. Ao implementar este procedimento, é importante utilizar camundongos receptores e doadores singênicos do mesmo sexo, a fim de minimizar a possibilidade de rejeição do transplante após este procedimento.

Outros métodos, como citometria de fluxo e imuno-histoquímica, podem ser utilizados para estudar os mecanismos pelos quais células derivadas da medula óssea entram no sistema nervoso central.