Name: Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar Toxoplasma gondii genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda genética direta para identificar genes de Toxoplasma gondii envolvidos na evasão imunológica em macrófagos. Este método revela mecanismos de resistência à imunidade autônoma celular.

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Agradecimentos especiais ao Dr. Peter Bradley pelo anticorpo para detectar as mitocôndrias do T. gondii. O trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde Grants AI072028 e AI107431 ao DGM e uma generosa doação ao New York Medical College para o estudo da medicina tropical.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo descrito fornece uma abordagem não-tendenciosa que usa a ativação dos macrófagos derivadas da medula óssea de camundongos e genética para a frente para isolar T. gondii mutantes com um defeito na sua capacidade de sobreviver a activação de macrófagos infectados. O fenótipo dos mutantes após a ativação dos macrófagos normalmente cai em uma das duas grandes categorias: 1) Os parasitas parecem intactos, mas não conseguem replicar para além de 1 parasita por PV; 2) Os parasitas parecem degradada e pode ...

Toxoplasma gondii (T. gondii) é uma intracelular obrigatório, patógeno protozoários. É o agente causador da toxoplasmose, um perigo para a saúde em indivíduos imunocomprometidos. É também o sistema modelo para outros agentes patogénicos apicomplexan que infectam os seres humanos, incluindo o Cryptosporidium e Cyclospora. A toxoplasmose é mais comumente adquirida através da ingestão de alimentos ou água contaminados com a bradyzoite ou oocisto fase do parasita. Após a ingestão, estes estágios converter ao palco taquizoíto do parasita que se replica dentro das células hospedeiras e divulga sistemicamente. As células T, IFN-γ e, em menor grau, o óxido nítrico 1-4, são importantes para o controlo de infecção, mas não são capazes de eliminar a doença, como uma proporção de taquizoítos converter para a fase bradyzoite que estão protegidas no interior dos cistos de tecido resultando numa infecção crónica de longa duração. De facto, não há terapias eficazes contra o cisto s crónicatagem da doença. Toxoplasmose grave é na maioria das vezes, devido à reativação da infecção persistente, com o estágio bradyzoite do parasita converter de volta para o palco rapidamente replicar característica taquizoíto de infecção primária e aguda. Sobrevivência no início da face da resposta imune inata é importante para permitir que o parasita para alcançar números suficientes de parasitas, assim como para alcançar locais distais, para permitir o estabelecimento de infecção crónica. T. gondii evoluiu estratégias para combater os mecanismos de defesa do hospedeiro que provavelmente contribuem para a sua capacidade de se replicar e propagar no início da infecção. Em primeiro lugar, T. gondii constitui um PV original durante a invasão do parasita que é largamente segregado a partir dos processos de endocitose e exocíticas da célula hospedeira em comparação com outros patogénios intracelulares 5-9. Além disso, como todos bem sucedidos patógenos intracelulares T. gondii altera a sua célula hospedeira para criar um ambiente permissivo fou crescimento. Isso inclui a expressão do gene da célula hospedeira reprogramação alterando fatores de transcrição da célula hospedeira, incluindo os que são importantes para regular a ativação de células 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 tenham sido mostrados para ser importante na regulação da resposta de transcrição e de sinalização celular em cascata de células hospedeiras infectadas com T. gondii. Estudos recentes utilizando cruzamentos genéticos entre linhagens do parasita com fenótipos distintos têm sido altamente produtivo na identificação de genes do parasita que fundamentam traços genótipo-dependente de parasitas, incluindo a evasão de imunidade relacionada GTPases (IRGs) 16,19,23-26. Em ratinhos, relacionadas com a imunidade GTPases (IRGs) são críticos para o controlo do Tipo II e III genótipos do parasita enquanto o tipo I muito virulento genótipos desenvolveram mecanismos para escapar às IRGs murino. No entanto, também é claro que o parasita se desenvolveram mecanismos para escapar meios antimicrobianares em adição aos IRGs e que alguns destes mecanismos pode ser conservado entre os genótipos de parasitas 27,28. Além disso, muito pouco se sabe sobre os mediadores críticos da imunidade celular autónoma contra T. gondii durante toxoplasmose humana. Genes dos parasitas importantes para a resistência aos mediadores da imunidade celular autónoma pode também ser importante para a sobrevivência durante taquizoíto para bradyzoite conversão que também pode ser desencadeada por respostas imunitárias do hospedeiro. Por exemplo, o óxido nítrico em níveis elevados pode suprimir a replicação do parasita em macrófagos infectados, mas também pode estimular a taquizoíto bradyzoite conversão resultando na produção de cisto 30-32. ToxoDB é um banco de dados de genômica funcional para T. gondii, que funciona como um recurso crítico para o campo em termos de fornecimento de informações de seqüência do genoma do parasita e acesso a dados em larga escala genômica publicados e não publicados, incluindo anotações da comunidade, exp gene<html> dados ression e proteômica 33. Semelhante a muitos patogénios protozoários, a maior parte do genoma é constituído por genes hipotéticos sem informações disponíveis, com base na homologia de genes para fornecer informações sobre as suas funções potenciais. Assim, a genética para a frente é uma ferramenta poderosa para identificar genes do parasita novos importantes para a evasão imune, conversão de cisto e outras funções críticas para parasita patogenia, bem como para a conversão entre diferentes estágios de desenvolvimento. Uma resistência adicional da genética para a frente é que ele pode ser usado como uma abordagem relativamente não enviesada para interrogar o parasita como para os genes que são importantes para tarefas específicas em patogénese, incluindo a evasão imune e formação de quistos. As recentes melhorias na próxima geração de sequenciamento para perfilamento mutacional fizeram-lhe um método de escolha para identificar os genes do parasita responsáveis ​​de estudos de genética para a frente usando mutagênese tanto química e insercional 34-37. ntent &quot;&gt; É importante identificar vulnerabilidades no T. gondii que podem ser explorados para reforçar a eficácia das células imunitárias mecanismos autónomos contra o parasita particularmente aqueles que possam também ser activos contra o estágio de cisto resistente. Com este objectivo, in vitro murino infecção de macrófagos e modelo de ativação foi desenvolvido para identificar mutações no parasita que prejudicar especificamente T. gondii aptidão após a ativação dos macrófagos infectados, mas não em macrófagos ingênuos. Essa tela de macrófagos foi usado para interrogar uma biblioteca de T. gondii mutantes de inserção, a fim de, em última instância identificar genes de T. gondii importantes para a resistência ao óxido nítrico 27,28. O isolamento de um painel de mutantes de T. gondii com resistência diminuída à activação de macrófagos infectados, particularmente uma sensibilidade marcada ao óxido nítrico, comprovou a utilidade da tela para identificar genes do parasita importantes para a resistênciaa mediadores da imunidade celular autónoma do que os outros mecanismos de resistência descritos para os 28 IRGs murino. Mutagénese de inserção tem vantagens em relação a mutagénese química em termos de geração de um número limitado de mutações aleatórias em cada clone parasita e, em teoria, mais fácil identificação do local da mutação. No entanto, a identificação do sítio genómico de inserção no plasmídeo T. Os mutantes de inserção gondii, na prática, tem sido surpreendentemente difícil em muitos casos 37. A inserção de um plasmídeo em um gene é também susceptível de perturbar a função de um gene, em contraste com a mutagénese química que tipicamente resulta em alterações de um só nucleótido. No entanto, a mutagénese química com ou N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou sulfonato ethylmethane (EMS) pode oferecer uma maior capacidade de analisar um maior parte do genoma do parasita, em comparação com mutagénese de inserção, uma vez que cria vários polimorfismos de um único nucleótido ( estimado em 10 -100) por 34 mutante, De 38 anos. Além disso, avanços recentes na caracterização do genoma inteiro tornou possível a utilização de sequenciação próxima geração para identificar os genes candidatos mais prováveis ​​responsáveis ​​pelo fenótipo identificado de um parasita mutado 34,38. Independentemente da abordagem de mutagénese, a confirmação da função do gene parasita na resistência a activação de macrófagos em última análise requer a deleção do gene de complementação e para cumprir os postulados de Koch molecular. A capacidade para dissecar a função de um gene através da manipulação genética de tanto o parasita e o macrófago é importante como muitos dos genes identificados através da genética para a frente em T. gondii, bem como outros agentes patogénicos, são ainda caracterizadas como genes hipotéticos com pouca ou nenhuma homologia de sequência com outras proteínas com funções conhecidas. O papel actual descreve uma abordagem geral que pode ser usado para identificar se o gene interrompido num mutante é importante para a resistência a um ou conhecidadesconhecido mediador da imunidade autônomo celular. A análise inicial do hospedeiro factores antimicrobianos é realizada através da avaliação da sobrevivência de tipo selvagem e mutantes de parasitas em macrófagos dos murganhos do tipo selvagem versus pacientes com deleções de genes específicos em indutível da sintase do óxido nítrico (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidase), e GTPases específicas relacionadas com a imunidade (IRGs). Isso vai determinar se os genes do parasita identificados são importantes para a resistência ao óxido nítrico, intermediários reativos de oxigênio ou relacionadas com a imunidade GTPases 28, respectivamente, ou se um mecanismo imunológico desconhecido está envolvido. A activação de macrófagos infectados com tanto IFN-γ e LPS, descritos no protocolo de corrente, resulta primeiramente no isolamento de genes de parasitas importantes para a resistência ao óxido nítrico 28. A utilização de agentes farmacológicos que induzem o óxido nítrico na ausência de activação de macrófagos (dadores de óxido nítrico) confirmou que a maioria dos genes identificados, foram importantes para a resistência ao óxido nítrico em vez de óxido nítrico em combinação com mediadores adicionais associados com a activação de macrófagos 28. Passo um e dois descrevem uma tela genética para a frente destinada a isolar mutantes do parasita com um defeito de fitness a seguir à activação de macrófagos derivados da medula óssea infectadas in vitro. O primeiro passo descreve uma análise de titulação da dose para determinar empiricamente uma dose de LPS e IFN-γ a ser usado para a activação de macrófagos, que reduz a replicação do parasita, mas não inibe completamente a replicação do tipo selvagem T. gondii estirpe parental que é usada para a criação da biblioteca de mutantes do parasita. Passo dois descreve o rastreio genético para a frente dos clones mutantes em macrófagos em placas de 96 poços. Passo três descreve uma abordagem para confirmar o fenótipo de cada mutante identificado na triagem das placas de 96 poços e para avaliar se o defeito em cada mutante afecta a sobrevivência do parasita, replicação,ou a produção de cisto em resposta à activação de macrófagos. Passo quatro descreve a utilização de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos com deleções em vias antimicrobianos específicos para identificar os mediadores imunes ao qual o parasita mutante é especificamente susceptíveis. Passo cinco descreve uma abordagem para determinar se um parasita mutante é também comprometida para patogénese in vivo como avaliado pela produção de quisto nos cérebros de ratos infectados.

<table><tbody><tr><td></td><td>DMEM Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Identificação=29101& productId=3255471& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=11737973& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>Thermo</td><td>SH3002802&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2434305& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamina</td><td>Thermo</td><td>SH3003401&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3311957& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Caneta Hyclone estreptococo</td><td>Thermo</td><td>SV30010&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6& catalogId=29104& matchedCat Não=SV30010& fromSearch=1& searchKey=SV30010& highlightPro ductsItemsFlag=Y& endecaSearch Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=De& economia = 0,0& xrefEvent=1407777949003_0 & searchType=PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Thermo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3064595& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td></td><td>LPS LIST biológicos</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4</td></tr><tr><td>IFN-&#947;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494& catalogId=29 104& matchedCatNo=50813664& fromSearch=1& searchKey = murino + ifn + pepro + tecnologia & highlightProductsItemsFlag =Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=De& economia =0,0& xrefEvent=1407778210608_ 12& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Lâminas de câmara</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2164545& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>placas ópticas de 96 poços</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3010670& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3158736& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Tecido de cultura de tecidos T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67& catalogId=29104& matchedCat Não=12565351& fromSearch=1& searchKey=156367& highlightProdu ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=De& economia =0,0& xrefEvent=1407778974800_ 0& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Ted Pella Formaldeído de grau EM</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3425922& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Alexa 488 - kit de conjugação de proteínas</td><td>Life Technologies</td><td>A20181</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td></tr><tr><td>soro de cabra</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2133236& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& crossRefData =ICN19135680=2& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Mídia de montagem Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>dolichos conjugados com FITC</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>Anticorpo para LAMP1</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Life Tecnologias</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>C57BL6 camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td></tr><tr><td>gp91 camundongos phox knock out</td> Jackson <td>Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>iNOS knock out camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2609</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td></tr><tr><td>nitroprussiato de sódio</td><td>ACROS Organics</td><td>AC21164-0250&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2627727& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2252389& dis tipo=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>camundongo monoclonal anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

atacante genetics telas usando macrófagos para identificar<em&gt; toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para resistance to-ifn-γ dependente immunity autónoma

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, o agente causador da toxoplasmose, é um patógeno protozoário intracelular obrigatório. O parasita invade e se replica em praticamente qualquer tipo de célula vertebrada de sangue quente. Durante a invasão parasitária de uma célula hospedeira, o parasita cria um vacúolo parasitóforo (PV) que se origina da membrana da célula hospedeira, independente da fagocitose dentro da qual o parasita se replica. Embora a imunidade inata dependente de IFN e mediada por células seja importante para o eventual controle da infecção, as células imunes inatas, incluindo neutrófilos, monócitos e células dendríticas, também podem servir como veículos para a disseminação sistêmica do parasita no início da infecção. É descrita uma abordagem que utiliza a resposta imune inata do hospedeiro, neste caso macrófagos, em uma triagem genética direta para identificar mutantes parasitas com defeito de aptidão em macrófagos infectados após a ativação, mas invasão e replicação normais em macrófagos virgens. Assim, a tela isola mutantes parasitas que apresentam um defeito específico em sua capacidade de resistir aos efeitos da ativação de macrófagos. O artigo descreve dois fenótipos amplos de parasitas mutantes após a ativação de macrófagos infectados: estase do parasita versus degradação do parasita, geralmente em vacúolos amorfos. Os mutantes do parasita são então analisados para identificar os genes do parasita responsáveis especificamente importantes para a resistência aos mediadores induzidos da imunidade autônoma celular. O artigo apresenta uma abordagem geral para a triagem genética direta que, em teoria, pode ser modificada para direcionar genes de parasitas importantes para a resistência a mediadores antimicrobianos específicos. Também descreve uma abordagem para avaliar os mediadores antimicrobianos específicos de macrófagos aos quais o parasita mutante é suscetível. A ativação de macrófagos infectados também pode promover a diferenciação do parasita do estágio de taquizoíto para bradizoíto que mantém a infecção crônica. Portanto, é apresentada uma metodologia para avaliar a importância do gene do parasita identificado para o estabelecimento da infecção crônica.

Toxoplasma gondii replica livremente em macrófagos naive e tem um tempo de duplicação entre 6-12 horas, dependendo da estirpe do parasita. A Figura 1 mostra parasitas representativos nos ingénuos contra macrófagos derivados da medula óssea activados. A Figura 2 mostra a morfologia geral de parasitas em HFF células hospedeiras em 2, 4, 8, 16 e 32 parasitas / PV. No protocolo atual, o parasita é permitido invadir macrófagos ingênuos e estabelecer um vacúolo parasitóforo nascente ...

A genética avançada é uma abordagem poderosa para identificar genes em patógenos intracelulares importantes para a resistência à imunidade autônoma celular. A abordagem atual usa células imunes inatas, especificamente macrófagos, para identificar novos genes de Toxoplasma gondii importantes para a evasão imunológica.

Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

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Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

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Os detalhes são apresentados sobre como o mapeamento de QTL com um mapa genético baseado em seqüências genômicas inteiras pode ser usado para identificar um gene de resistência a drogas em Toxoplasma gondii e como isso pode ser verificado com o sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente um alvo genômico, neste caso o Gene de resistência a drogas.

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Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 e Classificação celular em linhas de células macrófagos e t

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