Name: Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e Ex Vivo Cultura de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a isolar linfócitos da pele humana para análise fenotípica e cultura ex vivo. Este método utiliza biópsias de pele e dissociação enzimática para obter células viáveis suficientes para citometria de fluxo e estudos imunológicos.

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biópsias de pele de pacientes com psoríase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatologia da Universidade de Essen, Alemanha), após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. XH também é suportado pelo NSFC 61263039 e 11101321 NSFC.

NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis ​​foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha. 1. Preparação de suspensões de células individuais de Pele Humana (Trabalho estéril em um Fluxo de-gabinete se Cultura de Células posterior é necessária) <ol><li> Prepare meio de cultura celular: RPMI 1640 + penicilina / estreptomicina (concentrações finais de 100 unidades / mL e 100 ug / ml, respectivamente) + piruvato (0.02 mM) e Glutamax (0,02 mM), sem soro adicionado. </li><li> Prepare meio de cultura completo: meio de cultura preparado no passo 1.1 + 10% de soro humano (HPS); Armazenar a 4 ° C. Traga médio a 20 ° C ± 2 antes de nósing. </li><li> Obter a biópsia de pele com um instrumento redondo 4 milímetros biópsia por punção e mantê-lo no meio de cultura RPMI 1640 completo a 20 ° C ± 2 até 4 horas ou a 4 ° C EM. Processar a biópsia, o mais rapidamente possível após a chegada ao laboratório. NOTA: um armazenamento mais prolongado da pele vai influenciar o rendimento das células e viabilidade celular. </li><li> Marcar um tubo de dissociação azul-tampado e adicionar 5 ml de meio de cultura completo para o tubo rotulado. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura completo a cada poço (num total de 3 cavidades) de uma placa de cultura de 6 poços estéril. Use ferramentas estéreis para colocar a biópsia em um único poço, lavar, mova-o para um segundo poço e repetir este passo mais uma vez, conseguindo assim um total de três lavagens. </li><li> Transferir a biópsia da pele bem lavado com uma placa de Petri estéril, adicionar 100 uL de meio de cultura completo no topo da biópsia, e raspar cuidadosamente o tecido gordo subcutâneo utilizando-se um bisturi de aço inoxidável estéril descartável. NOTA: Thé é um passo crítico. </li><li> Corte cada biópsia da pele em 4 pedaços menores em uma placa de Petri estéril. amostras de transferência (até quatro biópsias de 4 mm por tubo) para o tubo de dissociação preparadas contendo 5 ml de meio de cultura completo. </li><li> Feche bem os tubos com a tampa, e anexar cabeça para baixo para a manga da Dissociator tecido automatizado. Certifique-se de que todo o material de amostra está localizado na área do rotor. </li><li> Iniciar o processo de dissociação, executando o &quot;_01 programa m_spleen&quot; (um programa pré-definido fornecida pela memória interna do instrumento ou pelo cartão de programa, acompanhado) dissociar a biópsia na velocidade de rotação apropriada para 56 seg. </li><li> Após o processamento, retire o tubo de dissociação do Dissociator e certifique-se que todo o material dissociado é recolhido na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 150 ul de colagenase IA (80 mg / ml) para dentro do tubo de dissociação e incubar a amostra num banho de água com agitação a 37° C durante 60 min. Adicionar 100 ul de ADNase I (5 mU / ml) para dentro do tubo thedissociation, misturar bem. NOTA: Maior concentração de colagenase ou tempo de incubação vai alterar a viabilidade celular. </li><li> Fixe o tubo de dissociação para a manga da Dissociator tecido automatizada e execute o programa &quot;m_ baço _01&quot; dissociar a biópsia mais uma vez. </li><li> Coloque um coador de células de nylon de 70 | iM no topo de um tubo Falcon de 50 ml. Aplicar materiais de amostra dissociados para este filtro celular para remover os detritos aglomerados de células / tecido. </li><li> Lavar uma vez com filtro de células 5 ml de meio de cultura completo. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 xg durante 10 min e o sobrenadante aspirado. </li><li> Repetir o passo de lavagem mais uma vez. Ressuspender as peletes de células em 300 ul de meio de cultura completo. uma única célula suspensões estão prontos para uma análise mais aprofundada; continuar com protocolos para a cultura de células ex vivo ou citometria de fluxo. </li><li> Em caso de mais icoloração de citocinas ntracellular, estimular as células com PMA (12,5 ng / ml), ionomicina (500 ng / ml) e Brefeldine A (5? g / ml) durante 4 hr a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas antes de executar o fluxo análise de citometria. </li></ol> 2. Polyclonal ativação das células T da Pele-residente (Ex Vivo de Cultura Celular) <ol><li> Alíquotas de suspensões de células únicas de 100 ul (preparado no passo 1.15) numa placa de fundo redondo de 96 poços. NOTA: Para cada biópsia de pele de 4 mm, as suspensões unicelulares adquiridos pode ser dividida em, pelo menos, duas cavidades de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar anti-CD3 / microesferas anti-CD28 mAb-revestidas (25.000 grânulos por poço), citocina recombinante humano de rIL-2 (concentração final de 25 U / ml) e rIL-1p (concentração final de 50 ng / ml). </li><li> Cobrir a placa de cultura com uma tampa de placa bem marcado, incubar em 5% de CO2, 100% de humidade, 37 ° C incubadora. Alterar médio quando a cor média vira para amarelo. <br/&gt; NOTA: Uma colônia de células claras pode ser observado a partir do dia 8 de cultura de células. </li></ol> 3. citometria de fluxo de primário / cultivadas células da pele Residente T <ol><li> Preparar tampão de FACS: PBS + 0,2% de BSA. </li><li> Transferir células de interesse em uma placa de 96 poços de fundo em V. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> As células são coradas com 100 ul de eFluorescence780 preparados conjugados corante de viabilidade fixável (1: 1000 de diluição utilizando PBS) a 4 ° C durante 30 min. Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Escolha mAbs marcador da superfície celular necessárias, por exemplo: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), preparar os mAbs-mistura, utilizando tampão FACS de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha. </li><li> Adicionar 25 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar 20 min a 20 ° C ± 2, proteger da luz. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de FACS, centrifugar a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Para amostras que exigem apenas coloração da superfície celular, continue com o passo 3.16. </li><li> No caso da coloração de Foxp3 intra-celular: <ol><li> Preparar tampão de fixação e permeabilização através da mistura de uma parte do concentrado com 3 partes de diluentes. </li><li> Prepare tampão de permeabilização 1x: 1 parte de 10x permeabilização tampão + 9 partes de H 2 O. esterilizado </li></ol></li><li> Ressuspender as pelotas em 100 ul de fixação e permeabilitampão zação, misture bem, e incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização a cada poço, centrifugar a 450 xg à temperatura ambiente durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Lavar as células com tampão de permeabilização mais uma vez. </li><li> Escolha mAbs intracelulares necessário, por exemplo, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e de IFN-y-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Prepare a mistura de mAbs utilizando tampão de permeabilização contendo soro normal de rato 2% de acordo com cada fator de diluição mAb testados. Definir as configurações de porta usando o controle isotipo do anticorpo em conjunto com amostra não-mancha. </li><li> Adicionar 20 uL de mAb preparado-mistura em cada poço. Incubar a 4 ° C durante 30 min, proteger da luz. </li><li> Após 30 min de incubação, adicionar 100 ul de tampão de permeabilização em cada poço. Centrifuga-se a 20 ° C ± 2, 450 x g durante 2 min, e o sobrenadante aspirado. </li><li> Lave as células com buffe permeabilizaçãoR mais uma vez. Ressuspender sedimento em 110 ul de tampão de FACS, e suspensões de células para dentro do tubo de transferência microFACS. NOTA: A amostra está pronta para a medição usando 10 cores citometria de fluxo. </li><li> No caso do número de células exato necessário, adicione 10 ml de suspensão uniforme bem misturado de fluoroesferas em cada amostra imediatamente antes de realizar medições de citometria de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c + DCs, CD4 + e CD8 + T e Foxp3 + CD25 +. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito bem possível e...

A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue 1 , 2. Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em várias condições patológicas. Células imunes residentes na pele normal são pensados ​​para conduzir imunovigilância e 3 têm demonstrado desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como psoríase 4. Na pele lesionada psoriática, tanto CD4 + e CD8 + foram infiltradas células T observed e foi demonstrado que a razão entre a CD4 e CD8 varia dependendo do estado da doença 5. No entanto, estas populações de células são difíceis de estudar porque as técnicas existentes permitem o isolamento de apenas algumas células. As técnicas atualmente utilizados para o isolamento de células T a partir de pele humana combinam dissociação da pele mecânica com tratamento enzimático. As biópsias da pele humana são extensamente triturada e incubada com enzimas como a tripsina, colagenase e / ou EDTA 6-8. Considerando-se que a pele é um tecido de barreira, que é altamente resistente a forças de tracção e de desagregação mecânica, os métodos estabelecidos de isolamento de células T produzido muito poucas células, e até mesmo menor número de células viáveis, o que torna a cultura ex vivo de células destas populações de células difíceis e desafiador. Aqui, nós relatamos um método modificado para isolar linfócitos de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação mechanical dissociação da pele usando um Dissociator tecido automatizada em vez do método estabelecido de picagem extensivamente, em conjunto com a digestão enzimática com colagenase. Vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo as DCs viáveis ​​e células T foram observadas após a preparação de uma suspensão de célula única. É importante notar a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8 foi bem preservada. As células assim preparadas, estão prontos para uso em culturas de células ex vivo ou análise de citometria de fluxo. Este protocolo tem sido empregue com sucesso para a análise de biópsias de pele individuais (4 mm) derivadas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase. Os resultados mostraram que as células T do paciente de pele residente produzido mais citocinas inflamatórias como a IL-17 e IFN-y, em comparação com voluntários saudáveis ​​9.

<table><tbody><tr><td>Punção de biópsia descartável</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Bisturis estéreis descartáveis</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Tubo C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Tampa azul, usado como tubo de dissociação.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociador</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Dissociador de tecido automatizado. Usando o "programa spleen_01" para dissociação da biópsia de pele.</td></tr><tr><td>Filtro de células&nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &micro; m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humano Soro agrupado (HPS)</td> <td>preparado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Colagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Tipo 1-A, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Corante de viabilidade fixável (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Corar as células mortas antes da fixação celular; diluir com PBS a 1:1.000</td></tr><tr><td>Concentrado de Fixação/Permeabilização</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Diluente de Fixação/Permeabilização</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Permeabilização (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Clone de 563879 BD CD45 anti-humano de camundongo</td><td></td><td></td><td>: HI30; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-humano CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-humano CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-humano CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; fator de diluição 1:50 para coloração superficial; fator de diluição 1:25 para coloração intracelular.</td></tr><tr><td>PC5.5 Camundongo anti-humano CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; fator de diluição 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Camundongo anti-humano CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>APC Camundongo anti-humano CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; fator de diluição 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Rato anti-humano CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; fator de diluição 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Camundongo anti-humano CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Camundongo anti-humano CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>&nbsp; PE Rato anti-humano CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; fator de diluição 1:</td></tr> <tr><td>eFluo450 Rato anti-humano Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; coloração intracelular; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Camundongo anti-humano IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; coloração intracelular; fator de diluição 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Camundongo anti-humano IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S. B3; coloração intracelular; fator de diluição 1:400</td></tr><tr><td>Fluorosferas de contagem de fluxo</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Contas de contagem, para citometria de fluxo</td></tr></tbody></table>

isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; ex vivo</em&gt; cultura de células

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 + e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.

O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis ​​de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm. Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 + (~ 30%) e CD11c...

Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar de forma eficiente linfócitos T residentes na pele a partir de biópsias cutâneas humanas. Isso é realizado primeiramente obtendo biópsias cutâneas humanas utilizando um punch circular. Em seguida, cada biópsia cutânea é cortada em quatro pedaços menores em uma placa de Petri.Em seguida, o tecido da pele é dissociado mecanicamente e enzimaticamente para produzir uma suspensão de células simples. Por fim, os linfócitos residentes na pele são analisados por citometria de fluxo e cultivados ex vivo. Em última instância, quantidades suficientes de linfócitos viáveis residentes na pele humana podem ser isoladas e analisadas por imunomarcação e análise de FACS.Este método ajudará a responder perguntas-chave em dermatologia e imunologia de tumores cutâneos. Por exemplo, como os linfócitos T residentes na pele contribuem para a doença. A demonstração do procedimento será feita por Xuehui He, um estudante de doutorado do nosso laboratório.Após preparar o meio de cultura, de acordo com o protocolo descrito, adicione dois mililitros de meio completo a três poços de uma placa de cultura estéril com seis poços. Em seguida, utilize um punch de biópsia circular de quatro milímetros para obter uma biópsia de pele. Coloque-a em meio de cultura completo RPMI 1640 e deixe em temperatura ambiente por até quatro horas, ou a quatro graus Celsius durante a noite.Enquanto a biópsia está em incubação, rotule um tubo de dissociação com tampa azul e adicione cinco mililitros de meio de cultura completo. Em seguida, use ferramentas estéreis para colocar a biópsia no primeiro poço a fim de lavá-la. Transfira o tecido para o segundo poço, lave e repita o processo mais uma vez no terceiro poço.Transfira a biópsia de pele bem lavada para uma placa de Petri estéril e pipete 100 microlitros de meio de cultura completo sobre a amostra. Em seguida, utilize um bisturi descartável estéril de aço inoxidável para remover cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo. Em uma nova placa de Petri estéril, corte cada biópsia de pele em quatro pedaços menores.Em seguida, transfira as amostras para o tubo de dissociação preparado contendo cinco mililitros de meio completo. Tampe bem o tubo e fixe-o invertido na manga do dissociador automático de tecidos. Certifique-se de que todo o material da amostra esteja localizado na área do rotor.Em seguida, inicie o processo de dissociação executando o programa M baço zero um. Para dissociar a biópsia na velocidade de rotação apropriada durante 56 segundos. Após o processamento, retire o tubo de dissociação do dissociador e certifique-se de que todo o material dissociado seja recolhido na parte inferior do tubo.Adicione 150 micro-litros de colágeno tipo um A ao tubo de dissociação e incube a amostra em banho-maria agitado a 37 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, adicione 100 micro-litros de DNase ao tubo de dissociação e misture bem. Fixe o tubo de dissociação à manga do dissociador automático de tecidos e execute o programa M baço zero um para dissociar a biópsia mais uma vez.Em seguida, coloque um filtro de células de náilon de 70 micromolares sobre a parte superior de um tubo tipo falcon de 50 mililitros e aplique os materiais da amostra dissociada sobre o filtro para remover agregados celulares e debris teciduais. Utilize cinco mililitros de meio completo para lavar o filtro uma vez. Em seguida, centrifugue o filtrado a 450 ×g e 20 graus Celsius, mais ou menos dois graus, durante 10 minutos antes de aspirar o sobrenadante.Após repetir a etapa de lavagem mais uma vez, utilize 300 microlitros de meio de cultura completo para ressuspender os pellets celulares. As suspensões de células individuais estão agora prontas para análises adicionais. Para realizar a coloração intracelular de citocinas, use PMA, ionomicina e brefeldina A para estimular as células e incube a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono durante quatro horas antes de realizar a análise por citometria de fluxo.Para realizar a ativação policlonal de linfócitos T residentes na pele, alíquotas de 100 microlitros de suspensão celular simples em uma placa de 96 poços com fundo redondo. Adicione microesferas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, citocina humana recombinante, IL-2 e IL-1B. Com uma tampa etiquetada e pesada, cubra a placa de cultura e incube a 37 graus Celsius, 5 por cento de dióxido de carbono e umidade de 100 por cento.Em seguida, quando a cor do meio ficar amarela, troque-o. Uma colônia clara de células pode ser observada no oitavo dia em cultura celular. Para realizar a análise de FACS, transfira as células de interesse para uma placa de 96 poços com fundo em V.Centrifugue a 450 G e 20 graus Celsius, mais ou menos dois graus, durante dois minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante. Use 100 microlitros do corante viável fixável conjugado fluorescente 780 preparado para corar as células, incubando a quatro graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão FACS e centrifugue antes de aspirar o sobrenadante. Depois, após selecionar os anticorpos monoclonais para marcadores de superfície celular da lista fornecida no protocolo do texto, utilize o tampão FACS para preparar as soluções de anticorpos. Utilize o controle isotópico dos anticorpos juntamente com uma amostra não corada para definir as configurações de seleção.Agora, adicione 25 micro-litros da mistura de anticorpos de camundongo preparada em cada poço e proteja da luz. Incube a 20 graus Celsius por 20 minutos. Adicione 100 micro-litros de tampão FACS, centrifugue e aspire o sobrenadante.Usando os buffers preparados para coloração de foxp3 de acordo com o protocolo descrito, adicione 100 microlitros do tampão de fixação e permeabilização para re-suspender os pellets. Misture bem e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros do tampão de permeabilização a cada poço e centrifugue antes de aspirar o sobrenadante.Após lavar as células mais uma vez e escolher os anticorpos corretos, adicione 20 microlitros da mistura de anticorpos monoclonais preparada em cada poço e proteja da luz antes de incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos. Usando o tampão de permeabilização, lave as células mais uma vez. Em seguida, use 110 microlitros de tampão FACS para ressuspender os pellets e transfira as suspensões celulares para tubos FACS microlitros.Por fim, se o número exato de células for necessário, adicione 10 microlitros de uma suspensão uniforme bem misturada de fluoroesferas a cada amostra imediatamente antes de realizar as medições de FACS. Como mostrado aqui, diferentes tipos de leucócitos positivos para CD45 foram identificados em suspensões de células únicas derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo células T positivas para CD4, células T positivas para CD8 e células dendríticas positivas para CD11c.Enquanto poucas células B, células NK ou micrófagos foram observadas. Além disso, a metodologia permite a análise de células CD4 positivas, CD25 positivas e foxp3 positivas em biópsias de pele humana. Por exemplo, utilizando coloração intracelular após fixação e permeabilização, é possível demonstrar a expressão do fator de transcrição foxp3 em células T CD25 positivas.Como demonstrado aqui, para evitar a autofluorescência de fundo e a população celular autofluorescente, recomenda-se o anticorpo murino anti-humano CD45 conjugado ao fluoróforo brilliant violet 421 para o direcionamento da população de linfócitos. Esta figura ilustra que a maioria das células residentes na pele humana eram linfócitos T positivos para CD3. Para análise de viabilidade celular, recomenda-se o uso de um corante de viabilidade fixável para distinguir células viáveis de células mortas ou em processo de morte.Para análises funcionais adicionais, utilizando uma única biópsia de pele de quatro milímetros de pele lesada de pacientes com psoríase, demonstrou-se que os linfócitos T derivados da biópsia produziram IL-17a e interferon gama. Após estimulação de quatro horas com PMA e ionomicina na presença de brefeldina A. Por fim, esta figura mostra que os linfócitos T de indivíduos psoriásicos possuem uma capacidade muito maior de produzir as citocinas associadas à psoríase, IL-17a e interferon gama. Não se esqueça de que o trabalho com tecidos humanos e agentes laboratoriais pode ser perigoso.Considere sempre as medidas de segurança.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos...

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Este protocolo descreve a dissociação rápida não enzimática de fragmentos de tecido humano fresco para avaliação qualitativa e quantitativa de células CD45+ (linfócitos/leucócitos) presentes em vários tecidos humanos normais e malignos. Além disso, o sobrenadante obtido do homogeneizado de tecido primário pode ser coletado e armazenado para análise ou experimentação posterior.

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

A pele abriga uma complexa rede de células imunológicas. Descrevemos uma metodologia eficiente para a digestão da pele de camundongos, de diferentes partes do corpo do animal, a fim de obter uma suspensão unicelular e analisar as diferentes populações de leucócitos residentes na pele por citometria de fluxo.

Preparação de uma única célula suspensões para Análise de citometria de fluxo de diferentes regiões da pele do rato

O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Este protocolo descreve a digestão enzimática da pele de camundongo em meio rico em nutrientes, seguida de separação gradiente para isolar leucócitos.  As células assim derivadas podem ser usadas para diversas aplicações a jusante. Esta é uma alternativa eficaz, econômica e aprimorada às máquinas de dissociação de tecidos e aos protocolos de digestão de tecidos mais severos baseados em tripsina e dispase.

Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.

Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar linfócitos da pele humana para análise fenotípica e cultura ex vivo. Este método utiliza biópsias de pele e dissociação enzimática para obter células viáveis suficientes para citometria de fluxo e estudos imunológicos.

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e

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