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O objetivo geral deste procedimento é obter ilhotas viáveis e vivas de camundongos diabéticos LEP R DB e avaliar a secreção de insulina por células beta dentro das ilhotas utilizando imagem de células vivas por fótons. Isso é realizado primeiramente preparando reagentes, como a mistura enzimática para a digestão do pâncreas, o meio de cultura para o cultivo das ilhotas e o tampão extracelular para o ensaio de dois fótons. Em seguida, a cavidade abdominal de um camundongo eutanasiado é aberta e a mistura enzimática é injetada no pâncreas para digerir o órgão.

Em seguida, os ilhotes são separados do digesto pancreático e cultivados. Por fim, a microscopia de dois fótons é utilizada para obter imagens de fusões individuais de grânulos de insulina em células beta dentro do ilhoto. Em última análise, este protocolo ajudará os pesquisadores a compreender como a secreção de insulina é controlada na saúde e na doença.

A principal aperfeiçoamento da técnica de isolamento de ilhotas é o uso de enzimas mistas para melhorar o rendimento e a viabilidade das ilhotas. A técnica de imagem de dois fótons é atualmente o único método capaz de registrar a secreção de insulina de múltiplas células dentro de uma ilhota intacta. Para preparar as enzimas para o isolamento de ilhotas pancreáticas, dilua um frasco de cinco miligramas de liase TL com 26 mililitros de DMEM e prepare a colagenase tipo IV em tampão de Hank na concentração de 0,5 miligrama por mililitro, suplementado com as seguintes soluções mistas de liase TL e colagenase.

Na proporção de quatro para um, alíquotas o volume da mistura de enzimas em 2,5 mililitros cada e armazene a menos 20 graus Celsius. Para preparar o meio de isolamento RPMI em um frasco cônico grande contendo um litro de água, dissolva um frasco de pó RPMI 1 6 4 0 em temperatura ambiente e complete com dois gramas de bicarbonato de sódio e 4,02 gramas de hippies. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH a 7,4, em seguida filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius.

Prepare o meio de cultura RPMI adicionando 10% de FBS e 1% de antibióticos ao meio de isolamento RPMI para a imagem por dois fótons. Prepare o tampão extracelular rico em sódio com os seguintes reagentes. Para preparar o corante extracelular, faça um estoque de oito milimolar de SRB, alíquotas do tampão extracelular em tubos pequenos e armazene a menos 20 graus Celsius.

Para obter uma concentração de trabalho, utilize tampão extracelular fresco para diluir o SRB estoque em uma proporção de um para dez. Após sacrificar um camundongo e usar etanol 70% para pulverizar completamente o corpo do animal conforme descrito no protocolo, posicione o animal com a cabeça voltada para o cirurgião e a cauda afastada dele. Faça dois cortes laterais longos na pele abdominal e no peritônio para criar uma aba em formato de V.

Puxe a aba da pele para cima para expor toda a cavidade abdominal. Coloque o intestino de lado e, com o tecido dobrado, mantenha o fígado no lugar para revelar o ducto biliar comum. Em seguida, aplique um clamp vascular na ampola na parede do duodeno para impedir que as enzimas injetadas entrem no duodeno.

Esta é uma etapa importante que determina se as enzimas pancreáticas entram no refluxo do ducto pancreático, no local da injeção ou no duodeno. Use uma agulha de 31 gauge para canular o ducto biliar comum próximo à junção do ducto hepático comum e do ducto cístico, deixando espaço para uma segunda injeção. Se o pâncreas não for perfundido na primeira tentativa, injete lentamente cerca de dois mililitros da mistura fria de enzimas no ducto biliar comum do camundongo.

Se o clamp estiver na posição correta, o pâncreas será rapidamente perfundido. Uma vez que o pâncreas tenha sido perfundido, remova rapidamente o órgão, coloque-o em um frasco de vidro e incube-o em banho-maria a 37 graus Celsius por aproximadamente 19 minutos. Após a incubação, interrompa o processo de digestão adicionando aproximadamente 20 mililitros de meio de isolamento frio.

Agite suavemente o frasco para romper o pâncreas e despeje-o através de uma peneira T normal com tamanho de poro de um milímetro em um tubo estéril de 50 mililitros. Use o meio de isolamento para completar o volume do tubo e centrifugue a 400 ×g e quatro graus Celsius por um minuto. Com a interrupção, adicione meio de isolamento ao palato e dissolva-o.

Em seguida, transfira a suspensão para dois tubos de 15 mililitros e centrifugue uma segunda vez. Após aspirar o sobrenadante, adicione seis mililitros de meio de separação celular por gradiente de densidade a cada tubo e pipete ou vortexe para ressuspender. Depois, ao longo da parede dos tubos, adicione cuidadosamente cerca de seis mililitros de meio de isolamento sobre o meio de separação por gradiente de densidade e centrifugue a 100 ×g e 4 °C por 15 minutos.

Com a separação, colete as camadas superior, média e inferior em três recipientes separados. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, use uma pipeta para selecionar manualmente os botões oculares nos três recipientes. A maioria será encontrada na camada média, o que ajuda os botões oculares a se recuperarem da digestão enzimática.

Prepare grupos de 40 ilhotos em placas de Petri de 25 centímetros com seis mililitros de meio de cultura RPMI contendo 10 milimolares de glicose e cultive por dois dias. Troque o meio diariamente para realizar a microscopia de dois fótons como um ensaio indireto para medir a secreção de insulina. Comece usando três milimolares de glicose em tampão extracelular para pré-incubar os ilhotos cultivados por dois dias.

Por 30 minutos, aplique graxa na platina do microscópio para evitar vazamento da solução e monte uma câmara de controle térmico contendo uma lâmina de vidro sobre a platina do microscópio. Em seguida, cubra a câmara com 500 microlitros de tampão extracelular contendo 0,8 milimolar de SRB e várias concentrações de glicose. Depois, coloque o olhal pré-incubado no centro da câmara e foque em três a quatro camadas celulares dentro do olhal.

Onde, em ilhotas de roedores, a imunomarcação para insulina mostra que a maioria das células são células beta. Em seguida, com o microscópio de dois fótons e uma objetiva de imersão em óleo de 60x, identifique eventos exoácidos individuais pelo aparecimento súbito de um pequeno ponto fluorescente. Por fim, no software de imagem de varredura, confirme um evento pela fase de aumento rápido do sinal fluorescente em uma região de interesse de um camundongo selvagem.

Espera-se obter cerca de 200 olhinhos utilizando o protocolo demonstrado neste vídeo. Olhinhos saudáveis apresentam-se brilhantes, com formato arredondado e borda lisa. Um lote de isolamento submetido à digestão inadequada geralmente possui olhinhos pequenos e difusos, além de olhinhos com células asar aderidas.

Embora um lote superdigerido apresente menos poros no ensaio de duas fótons em resposta a estímulos como glicose ou insulina granular de potássio elevado fundida com a membrana plasmática, um SRB entra nos grânulos, o que resulta no aparecimento de um ponto fluorescente súbito, com aproximadamente 400 nanômetros de diâmetro. Durante o tempo registrado, todos os eventos de exocitose em resposta ao estímulo são identificados, bem como a localização dos eventos, o momento do aparecimento, a duração e o tipo de fusão. Eventos como beijo (KISS) e corrida ou fusão completa são caracterizados e são valiosos para avaliar qualquer defeito na fusão dos grânulos em modelos de diabetes tipo dois.

Este método foi utilizado para demonstrar que o defeito nos ilhotas diabéticas DB DB é a perda da fusão completa dos grânulos e não uma alteração na cinética da fusão individual dos grânulos. Além disso, o maior fator que influencia a diminuição da secreção de insulina na doença é a redução no número de células responsivas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da perfusão pancreática e da ativação de ilhotas a partir de camundongos DB DB, e também ser capaz de realizar os dois ensaios em língua para avaliar as respostas secretórias dentro de ilhotas intactas.