Lepr ^Db Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

O objetivo geral deste procedimento é obter ilhós vivos viáveis dos camundongos diabéticos LEP R DB e avaliar a secreção de insulina das células beta dentro dos ilhós usando células vivas para imagens de fótons. Isso é feito preparando primeiro reagentes, como a mistura enzimática para a digestão do pâncreas, o meio de cultura para cultura de ilhós e o tampão extracelular para o ensaio de dois fótons. Em seguida, o abdômen de um camundongo sacrificado é aberto e a mistura enzimática é injetada no pâncreas para digerir o órgão.

Em seguida, os ilhós são separados do digestor pancreático e cultivados. Finalmente, a microscopia de dois fótons é usada para obter imagens de fusões de grânulos de insulina únicos de células beta dentro do ilhó. Em última análise, este protocolo ajudará os pesquisadores a entender como a secreção de insulina é controlada na saúde e na doença.

O principal refinamento da técnica de isolamento de ilhós é o uso de enzimas mistas para melhorar o rendimento e a viabilidade dos ilhós. A técnica de imagem de dois fótons é atualmente o único método para registrar a secreção de insulina de várias células dentro de um ilhó intacto. Para preparar enzimas para isolar ilhós pancreáticos diluir um frasco de cinco miligramas de liase TL com 26 mililitros de DM EM, prepare a colagenase tipo quatro no tampão de Hank a uma concentração de 0,5 miligramas por mililitro, suplementada com as seguintes soluções mistas de liase TL e colagenase.

Em uma proporção de quatro para um por volume, alíquota da mistura de enzimas para 2,5 mililitros cada e armazene a 20 graus Celsius negativos. Para preparar o meio de isolamento RPMI em um grande frasco cônico contendo um litro de água, dissolva um frasco de pó RPMI 1 6 4 0 em temperatura ambiente e suplegue com dois gramas de bicarbonato de sódio e 4,02 gramas de hippies. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH para 7,4, depois filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius.

Faça o meio de cultura RPMI adicionando 10% de FBS e 1% de antibióticos ao meio de isolamento RPMI para imagens de dois fótons. Prepare o tampão extracelular rico em sódio com os seguintes reagentes. Para preparar o corante extracelular, faça oito milimolares de SRB uma alíquota de tampão extracelular em pequenos tubos e armazene a 20 graus Celsius negativos.

Para chegar a uma concentração de trabalho, use tampão extracelular fresco para diluir o SRB de estoque de um a 10. Depois de sacrificar um camundongo e usar etanol a 70% para pulverizar completamente o corpo do camundongo de acordo com o protocolo de texto, posicione o animal com a cabeça voltada para o cirurgião e a cauda afastada. Use dois cortes laterais longos na pele abdominal e no peritônio para fazer um retalho em forma de V.

Puxe a aba da pele para cima para descobrir toda a cavidade abdominal. Deixe de lado o intestino e, com o tecido dobrado, mantenha o fígado no lugar para revelar o ducto biliar comum. Em seguida, aplique uma pinça vascular na ambula na parede do duodeno para impedir que as enzimas injetadas entrem no duodeno.

Esta é uma etapa importante que determina se as enzimas pancreáticas entram no refluxo do ducto pancreático, no local da injeção ou no duodeno. Use uma agulha de calibre 31 para caninar o ducto colédoco comum perto da junção do ducto hepático comum e do ducto cístico e deixe espaço para uma segunda injeção. Se o pâncreas não perfundir na primeira vez, injete lentamente cerca de dois mililitros de mistura enzimática fria no ducto biliar comum do camundongo.

Se a pinça estiver na posição correta, o pâncreas será rapidamente perfundido. Uma vez que o pâncreas esteja perfundido, remova rapidamente o órgão, coloque-o em um frasco de vidro e incube em banho-maria a 37 graus Celsius por aproximadamente 19 minutos. Após a incubação, interrompa o processo de digestão adicionando aproximadamente 20 mililitros de meio de isolamento a frio.

Agite o frasco suavemente para romper o pâncreas e despeje-o através de um T sive normal com um tamanho de poro de um milímetro em um tubo estéril de 50 mililitros. Utilizar o meio de isolamento para completar o tubo e centrifugar a 400 G e quatro graus Celsius durante um minuto. Com a quebra, adicione meio isolante ao palato e dissolva-o.

Em seguida, transfira a suspensão para dois tubos de 15 mililitros e gire uma segunda vez. Depois de aspirar o supinato, adicione seis mililitros de meio de separação de células de gradiente de densidade a cada paleta e pipeta ou vórtice para resus. Em seguida, ao lado dos tubos, adicione suavemente aproximadamente seis mililitros de meio de isolamento em cima da centrífuga do meio de separação de gradiente de densidade a 100 G e quatro graus Celsius por 15 minutos.

Com a quebra, reúna as camadas superior, média e inferior em três pratos separados. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use uma pipeta para escolher a dedo os ilhós nos três pratos. A maioria será encontrada na camada intermediária para ajudar os ilhós a se recuperarem da digestão enzimática.

Prepare grupos de 40 ilhós em placas de Petri de 25 centímetros com seis mililitros de meio de cultura RPMI contendo 10 milimolares de glicose e cultura por dois dias. Mudando o meio diariamente para realizar duas imagens de fótons como um ensaio indireto para medir a secreção de insulina. Comece usando três milimolares de glicose em tampão extracelular para pré-incubar ilhós cultivados em dois dias.

Por 30 minutos, aplique graxa no microscópio stage para evitar que a solução vaze e monte a câmara de controle térmico contendo uma lâmina de vidro no microscópio stage. Em seguida, com 500 microlitros de tampão extracelular contendo 0,8 milimolar, SRB e várias concentrações de glicose cobrem a câmara. Em seguida, coloque o ilhó pré-incubado no meio da câmara e concentre-se em três a quatro camadas de células no ilhó.

Enquanto nos ilhós de roedores, a coloração imunológica para insulina mostra que a maioria das células são células beta. Em seguida, com o microscópio de dois fótons e uma objetiva de imersão em óleo de 60 x, identifique eventos exo ácidos únicos pelo aparecimento repentino de um pequeno ponto fluorescente. Finalmente, no software de imagem de varredura confirme um evento pela fase de ascensão rápida do sinal fluorescente sobre uma região de interesse para um camundongo do tipo selvagem.

São esperados cerca de 200 ilhós usando o protocolo demonstrado neste vídeo. Ilhós saudáveis parecem brilhantes, redondos e têm uma borda lisa. E sob lote de isolamento digerido geralmente tem ilhós pequenos e difusos e ilhós anexados a células asar.

Enquanto um lote superdigerido tem menos ilhós no ensaio de dois fótons em resposta a estímulos como glicose ou grânulos de insulina com alto teor de potássio alimentados com a membrana plasmática, um SRB entra nos grânulos, o que resulta no aparecimento de uma mancha fluorescente repentina, com aproximadamente 400 nanômetros de diâmetro. Dentro do tempo registrado, todos os eventos exo em resposta ao estímulo são identificados e a localização dos eventos, o tempo do aparecimento, a duração e o tipo da fusão. Eventos como KISS e Run ou fusão completa são caracterizados e são valiosos para avaliar qualquer defeito na fusão granular em modelos de diabetes tipo dois.

Este método foi usado para mostrar que o defeito nos ilhós DB DB diabéticos é a perda da fusão completa dos grânulos e não uma alteração na cinética da fusão individual dos grânulos. Além disso, o maior fator que influencia a diminuição da secreção de insulina na doença é a redução do número de células responsivas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da perfusão pancreática e da atuação sem olhos da esquerda, camundongos RDB, e também ser capaz de realizar os dois ensaios de língua para avaliar as respostas secretoras de incidências nas ilhas intactas.