Name: Lepr Db Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas viáveis do modelo Lepr Db de diabetes tipo 2 em camundongos e a realizar imagens de células vivas por microscopia de dois fótons para analisar a secreção de insulina em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado por um Australian Research Council Grant DP110100642 (para PT) e National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 e APP1059426 (para PT e HYG).

NOTA: Todos os presentes experimentos foram realizados de acordo com procedimentos de ética de animais locais da Universidade de Queensland (aprovados pela Universidade de Queensland, Comitê de Ética Biociências anatômica). 1. Isolamento Islet <ol><li> Preparação de reagentes <ol><li> Mistura de enzimas <ol><li> Para a digestão pancreática, utilizar uma mistura de Liberase e colagenase tipo IV. Diluir TL Liberase (termolisina baixo) 1 frasco de 5 mg com 26 ml de DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium). </li><li> Prepare a colagenase de tipo IV, em tampão de Hank com uma concentração de 0,5 mg / mL, suplementada com 5mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl 2, 0,1 mg / ml de DNase e 1 mg / ml de albumina de soro bovino. </li><li> Misturar o TL Liberase e soluções de colagenase em uma proporção de 4: 1 (em volume), ou seja, 4 ml Liberase TL + 1 ml de colagenase. Alíquota da mistura de enzimas para cada 2,5 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: Os tempos de incubação tecido vary um pouco entre os lotes de enzima (30 s a 1 min diferença). Portanto, um lote de ensaio pode ser necessária. </li></ol></li><li> RPMI Isolamento de mídia <ol><li> Dissolve-se um frasco de meio RPMI 1640 em pó em 1 litro de água à temperatura ambiente e completar com 2 g de NaHCO3, 4,02 g de HEPES. </li><li> Combinar a meios de isolamento RPMI num grande frasco cónico, misture com agitador magnético, ajustar o pH a 7,4 com NaOH, filtro esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Meios de Cultura </li><li> Utilizar o meio de cultura RPMI, com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (isto é, penicilina 100 U / ml, estreptomicina 100 ug / ml). </li></ol></li><li> A cultura e isolamento de ilhotas <ol><li> Sacrifício de Animais <ol><li> Sacrifique ratos por deslocamento cervical ou asfixia com CO2 de acordo com procedimentos de ética da instituição local. Pulverizar o corpo do rato cuidadosamente com etanol a 70%. </li></ol></li><li> Perfusão pâncreas <ol><li> VOCÊse duas longas cortes lateralmente através da pele abdominal e do peritoneu para fazer uma aba em forma de V. Puxe a aba da pele até descobrir toda a cavidade abdominal, pôr de lado o intestino e manter o fígado no lugar por um lenço de papel dobrado para revelar o ducto biliar comum (Figuras 1 e 2). Coloque o animal de modo que a cabeça na direção do cirurgião e da cauda longe do cirurgião. </li><li> Aplicar uma pinça vascular na ampola na parede do duodeno para bloquear as enzimas injectados de entrar no duodeno (Figura 1). NOTA: Este é um passo importante, pois determina se as enzimas injetadas vai para o ducto pancreático e perfundir o pâncreas ou refluxo no local da injecção (mais de pinça) ou ir para o duodeno (sob braçadeira). </li><li> Canular do ducto biliar comum com uma agulha G 31 perto da junção do ducto hepático comum e ducto cístico (Figura 1) e deixar espaço para uma segunda injecção se the pâncreas não para perfundir a primeira vez. Lentamente (mais de ~ 10 seg) injetar cerca de 2 ml de mistura de enzimas frio para o rato do ducto biliar comum. NOTA: Os pâncreas perfundido será rapidamente se a braçadeira está na posição direita. </li><li> Ajuste a posição da braçadeira se a agulha está dentro do ducto biliar comum, mas não pode perfundir o pâncreas (ie., Mover para cima a braçadeira um pouco longe do fígado se sobre apertada ou movê-lo um pouco para baixo para o fígado se sob apertada). NOTA: A agulha, por vezes, vai para dentro da cápsula, em vez de em torno do lúmen da conduta. Um sinal útil para verificar se a agulha está dentro do ducto biliar comum é a dilatação do duto, aquando da injecção. Se falhar o pâncreas para perfundir, uma alternativa é a mistura de enzimas pode ser injectado para múltiplos sítios do pâncreas com menor rendimento esperado. A perfusão do local esquerda do pâncreas (lóbulo esplénica) é importante para a maximização do rendimento da ilhota. </li><li> Depois do pâncreas é perfused, remover rapidamente o pâncreas, colocá-lo em um frasco (~ 20 ml, vidro) e incubar durante ~ 19 min num banho de água a 37 ° C. NOTA: O tempo de incubação pode variar um pouco dependendo da estirpe do mouse e idade. </li><li> Após o tempo de incubação, parar o processo de digestão por adição de ~ 20 mL de meio de isolamento frio. Agitar suavemente o frasco para interromper o pâncreas e derramá-lo através de um peneiro normal chá (diâmetro de poro de 1 mm) em um tubo estéril de 50 ml. Encher o tubo com meios de isolamento e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. </li><li> Dissolve-se o sedimento no meio de isolamento e transferir novamente para dois tubos de 15 ml, em seguida, centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C com freio fora. Após a aspiração do sobrenadante, misturar as duas pelotas bem com 6 ml de meio de separação celular gradiente de densidade (Histopaque 1077 solução) por tubo em vórtice ou pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicionar suavemente ~ 6 ml do meio de isolamento para o lado do tubo na parte superior deos meios de separação por gradiente de densidade e centrifugar a 100 xg durante 15 min a 4 ° C com freio fora. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante no (meio de isolamento) superior, média e inferior (densidade meios de separação de células gradiente) camada em três pratos separados. Handpick as ilhotas nestes três pratos, com uma pipeta sob um microscópio de dissecação. NOTA: A camada do meio contém a maioria dos ilhéus. As ilhotas são reconhecidos como estruturas compactas de ~ 50 a 500 um de tamanho (Figura 3). Obtemos ~ 200 ilhotas em camundongos WT e entre 300 e &lt;100 ilhotas em ratinhos db / db. </li></ol></li><li> A cultura ilhéu <ol><li> Para ajudar as ilhotas recuperar a partir da digestão enzimática, grupos de cultura de 40 ilhéus em 25 cm de placa de Petri com 6 ml de RPMI meio de cultura (10 mM de glucose) a 37 ° C, 5% / 95% de CO2 / O2 durante 2 dias antes vivo -cell imaging dois fótons. Alterar o meio de cultura diária. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Vivo celular 2-Photon Imagens <ol><li> Preparação do Reagente <ol><li> Tampão extracelular <ol><li> Preparar o tampão de sódio extracelular rico para o ensaio de 2-fótons com 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO3 e 10 mM de HEPES. </li></ol></li><li> Extracelular Dye <ol><li> Para o ensaio de 2-fótons, preparar estoque SRB 8 mM em tampão extracelular, alíquota em pequenos tubos e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a SRB estoque 1:10 em tampão extracelular fresco para obter uma concentração de trabalho de 0,8 mM. </li></ol></li></ol></li><li> Photon Imagens <ol><li> Em primeiro lugar, pré-incubar 2 dias em cultura ilhotas em tampão extracelular de glucose 3 mM durante 30 min. NOTA: Nós usamos ilhotas entre 2 e 5 dias de cultura. </li><li> Em seguida, colocar uma lâmina de vidro para a câmara de controlo térmico montado na platina do microscópio. Use massa para evitar o vazamento de uma solução. </li><li> Cubra a câmara com 500 mL de extracelulartampão ular contendo 0,8 mM SRB com diferentes concentrações de glicose (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mM de glicose). </li><li> Em seguida, colocar a ilhota pré-incubados no meio da câmara, e se concentrar em 3-4 camadas de células na ilhota onde, nas ilhotas de roedores, a imunocoloração para a insulina mostra que a maioria das células são células beta. NOTA: O SRB vai delinear toda a membrana da célula da ilhota rapidamente e a ilhota está pronto para a imagem. </li><li> Usar um microscópio 2-fótons com uma objectiva 60X de imersão em óleo (1,42 NA) e software de imagem (por exemplo., Scanimage 11). A Figura 4 ilustra uma disposição típica de microscopia. Imagem eventos exocíticas usando SRB como uma membrana extracelular marcador fluorescente impermeant excitados por pulsos de laser de femtossegundos a 880 nm, com fluorescência detectada em 550-650 nm. Grave as respostas à estimulação de ilhotas. </li><li> Identificar eventos exocíticas único pela súbita aparição de uma pequena mancha fluorescente (resolução de 10 pixels /1; m) e confirme a fase de rápido crescimento do sinal fluorescente sobre uma região de interesse (~ 0,78 mm 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

O factor mais importante no isolamento de ilhotas é a perfusão inicial do pâncreas; sob um pâncreas perfundido resultados com um rendimento de ilhotas consideravelmente inferior. Outros factores também afectam a qualidade de isolamento, tais como o tempo de digestão e o nível de agitação que pode compensar parcialmente o nível de perfusão. Por exemplo, um pâncreas perfundido totalmente terá de ser incubadas a 37 ° C durante ~ 18 min 30 seg, agitando suavemente, em contraste sob uma digerido pâncreas pode necessitar de ~...

O papel da disfunção da célula beta em doenças tem sido amplamente reconhecida 3,4. As linhas celulares tais como o MIN6 e INS-1 são ferramentas úteis para compreender a biologia do comportamento das células beta. No entanto, o controlo fisiológico da secreção de insulina tem lugar dentro das ilhotas de Langerhans. Estas ilhotas conter milhares de células beta embaladas apertadamente, assim como os vasos sanguíneos e outros tipos de células endócrinas. Este ambiente dentro do ilhéu influencia a secreção de insulina e é provável que seja importante na diabetes. Portanto, para compreender o controlo fisiológico da secreção de insulina, e a patofisiologia da doença, que é essencial para estudar ilhotas intactas. Isolamento de ilhotas Ilhotas humanos vivos e, em particular, ilhotas humanas de pacientes com diabetes tipo 2 são difíceis de obter. Além disso, ilhotas humanos têm possibilidades limitadas de manipulação molecular experimental. Os investigadores têm, por conseguinte, é empreguepermite que a partir de animais e em modelos animais de diabetes do tipo 2. Um modelo de doença, tais é o rato db / db. Esta é uma mutação espontânea que os modelos de diabetes tipo 2 com uma progressão fenótipo que se aproxima bastante doença humana 5,6. O protocolo apresentado aqui para isolamento de ilhotas de ratos db / db diabéticos tem muitas etapas em comum com outros grupos com alguns refinamentos para melhor rendimento, purificação e aumento da sobrevida das ilhotas. Imaging dois fótons A célula de ensaio directo de 2-fótons descrito aqui permite aos investigadores para quantificar o número e avaliar as características de grânulos individuais contendo insulina a partir de células de muitos diabéticos do tipo selvagem e 7 ilhotas 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche-5401020001</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Colagenase tipo IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>para preparar meios de isolamento</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>para preparar meios de cultura</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>para preparar meios de cultura&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>para preparar meio de cultura</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>para diluir o programa metamorfo liberase</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices, EUA</td><td></td><td>para analisar as imagens de 2 fótons</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; mouse modelo de diabetes tipo 2: isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-photon imagens de ilhotas intactas

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

A diabetes tipo 2 é uma doença crónica que afecta 382 milhões de pessoas em 2013, e espera-se aumentar para 592 milhões até 2035 1. Durante as últimas duas décadas, o papel da disfunção da célula beta em diabetes tipo 2 tem sido claramente estabelecida 2. O progresso da pesquisa tem necessários métodos para o isolamento de ilhéus pancreáticos. O protocolo de isolamento de ilhotas apresentado aqui compartilha muitos passos comuns com protocolos de outros grupos, com algumas modificações para melhorar o rendimento e qualidade de ilhotas isoladas, tanto do tipo selvagem e db Lepr diabético (db / db) camundongos. Uma célula-vivo método de imagem 2-fótons é então apresentado que possa ser usado para investigar o controlo da secreção de insulina dentro de ilhotas.

Islet rendimento e purificação Para um rato normal de tipo selvagem, são esperados cerca de 200 ilhotas. Ilhotas saudáveis ​​olhar brilhante, em forma redonda e tem uma borda lisa. Um lote de isolamento over-digerido tem geralmente pequenas e difusas ilhotas enquanto um lote digerido-under tem menos ilhotas e ilhéus celulares ligados acinares (Figura 3). Para ratinhos db / db diabéticos, o rendimento da ilhota e aparência depende da progressão da doença com melhores ratos gl...

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

O objetivo geral deste procedimento é obter ilhotas viáveis e vivas de camundongos diabéticos LEP R DB e avaliar a secreção de insulina por células beta dentro das ilhotas utilizando imagem de células vivas por fótons. Isso é realizado primeiramente preparando reagentes, como a mistura enzimática para a digestão do pâncreas, o meio de cultura para o cultivo das ilhotas e o tampão extracelular para o ensaio de dois fótons. Em seguida, a cavidade abdominal de um camundongo eutanasiado é aberta e a mistura enzimática é injetada no pâncreas para digerir o órgão.Em seguida, os ilhotes são separados do digesto pancreático e cultivados. Por fim, a microscopia de dois fótons é utilizada para obter imagens de fusões individuais de grânulos de insulina em células beta dentro do ilhoto. Em última análise, este protocolo ajudará os pesquisadores a compreender como a secreção de insulina é controlada na saúde e na doença.A principal aperfeiçoamento da técnica de isolamento de ilhotas é o uso de enzimas mistas para melhorar o rendimento e a viabilidade das ilhotas. A técnica de imagem de dois fótons é atualmente o único método capaz de registrar a secreção de insulina de múltiplas células dentro de uma ilhota intacta. Para preparar as enzimas para o isolamento de ilhotas pancreáticas, dilua um frasco de cinco miligramas de liase TL com 26 mililitros de DMEM e prepare a colagenase tipo IV em tampão de Hank na concentração de 0,5 miligrama por mililitro, suplementado com as seguintes soluções mistas de liase TL e colagenase.Na proporção de quatro para um, alíquotas o volume da mistura de enzimas em 2,5 mililitros cada e armazene a menos 20 graus Celsius. Para preparar o meio de isolamento RPMI em um frasco cônico grande contendo um litro de água, dissolva um frasco de pó RPMI 1 6 4 0 em temperatura ambiente e complete com dois gramas de bicarbonato de sódio e 4,02 gramas de hippies. Use hidróxido de sódio para ajustar o pH a 7,4, em seguida filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius.Prepare o meio de cultura RPMI adicionando 10% de FBS e 1% de antibióticos ao meio de isolamento RPMI para a imagem por dois fótons. Prepare o tampão extracelular rico em sódio com os seguintes reagentes. Para preparar o corante extracelular, faça um estoque de oito milimolar de SRB, alíquotas do tampão extracelular em tubos pequenos e armazene a menos 20 graus Celsius.Para obter uma concentração de trabalho, utilize tampão extracelular fresco para diluir o SRB estoque em uma proporção de um para dez. Após sacrificar um camundongo e usar etanol 70% para pulverizar completamente o corpo do animal conforme descrito no protocolo, posicione o animal com a cabeça voltada para o cirurgião e a cauda afastada dele. Faça dois cortes laterais longos na pele abdominal e no peritônio para criar uma aba em formato de V.Puxe a aba da pele para cima para expor toda a cavidade abdominal. Coloque o intestino de lado e, com o tecido dobrado, mantenha o fígado no lugar para revelar o ducto biliar comum. Em seguida, aplique um clamp vascular na ampola na parede do duodeno para impedir que as enzimas injetadas entrem no duodeno.Esta é uma etapa importante que determina se as enzimas pancreáticas entram no refluxo do ducto pancreático, no local da injeção ou no duodeno. Use uma agulha de 31 gauge para canular o ducto biliar comum próximo à junção do ducto hepático comum e do ducto cístico, deixando espaço para uma segunda injeção. Se o pâncreas não for perfundido na primeira tentativa, injete lentamente cerca de dois mililitros da mistura fria de enzimas no ducto biliar comum do camundongo.Se o clamp estiver na posição correta, o pâncreas será rapidamente perfundido. Uma vez que o pâncreas tenha sido perfundido, remova rapidamente o órgão, coloque-o em um frasco de vidro e incube-o em banho-maria a 37 graus Celsius por aproximadamente 19 minutos. Após a incubação, interrompa o processo de digestão adicionando aproximadamente 20 mililitros de meio de isolamento frio.Agite suavemente o frasco para romper o pâncreas e despeje-o através de uma peneira T normal com tamanho de poro de um milímetro em um tubo estéril de 50 mililitros. Use o meio de isolamento para completar o volume do tubo e centrifugue a 400 ×g e quatro graus Celsius por um minuto. Com a interrupção, adicione meio de isolamento ao palato e dissolva-o.Em seguida, transfira a suspensão para dois tubos de 15 mililitros e centrifugue uma segunda vez. Após aspirar o sobrenadante, adicione seis mililitros de meio de separação celular por gradiente de densidade a cada tubo e pipete ou vortexe para ressuspender. Depois, ao longo da parede dos tubos, adicione cuidadosamente cerca de seis mililitros de meio de isolamento sobre o meio de separação por gradiente de densidade e centrifugue a 100 ×g e 4 °C por 15 minutos.Com a separação, colete as camadas superior, média e inferior em três recipientes separados. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, use uma pipeta para selecionar manualmente os botões oculares nos três recipientes. A maioria será encontrada na camada média, o que ajuda os botões oculares a se recuperarem da digestão enzimática.Prepare grupos de 40 ilhotos em placas de Petri de 25 centímetros com seis mililitros de meio de cultura RPMI contendo 10 milimolares de glicose e cultive por dois dias. Troque o meio diariamente para realizar a microscopia de dois fótons como um ensaio indireto para medir a secreção de insulina. Comece usando três milimolares de glicose em tampão extracelular para pré-incubar os ilhotos cultivados por dois dias.Por 30 minutos, aplique graxa na platina do microscópio para evitar vazamento da solução e monte uma câmara de controle térmico contendo uma lâmina de vidro sobre a platina do microscópio. Em seguida, cubra a câmara com 500 microlitros de tampão extracelular contendo 0,8 milimolar de SRB e várias concentrações de glicose. Depois, coloque o olhal pré-incubado no centro da câmara e foque em três a quatro camadas celulares dentro do olhal.Onde, em ilhotas de roedores, a imunomarcação para insulina mostra que a maioria das células são células beta. Em seguida, com o microscópio de dois fótons e uma objetiva de imersão em óleo de 60x, identifique eventos exoácidos individuais pelo aparecimento súbito de um pequeno ponto fluorescente. Por fim, no software de imagem de varredura, confirme um evento pela fase de aumento rápido do sinal fluorescente em uma região de interesse de um camundongo selvagem.Espera-se obter cerca de 200 olhinhos utilizando o protocolo demonstrado neste vídeo. Olhinhos saudáveis apresentam-se brilhantes, com formato arredondado e borda lisa. Um lote de isolamento submetido à digestão inadequada geralmente possui olhinhos pequenos e difusos, além de olhinhos com células asar aderidas.Embora um lote superdigerido apresente menos poros no ensaio de duas fótons em resposta a estímulos como glicose ou insulina granular de potássio elevado fundida com a membrana plasmática, um SRB entra nos grânulos, o que resulta no aparecimento de um ponto fluorescente súbito, com aproximadamente 400 nanômetros de diâmetro. Durante o tempo registrado, todos os eventos de exocitose em resposta ao estímulo são identificados, bem como a localização dos eventos, o momento do aparecimento, a duração e o tipo de fusão. Eventos como beijo (KISS) e corrida ou fusão completa são caracterizados e são valiosos para avaliar qualquer defeito na fusão dos grânulos em modelos de diabetes tipo dois.Este método foi utilizado para demonstrar que o defeito nos ilhotas diabéticas DB DB é a perda da fusão completa dos grânulos e não uma alteração na cinética da fusão individual dos grânulos. Além disso, o maior fator que influencia a diminuição da secreção de insulina na doença é a redução no número de células responsivas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da perfusão pancreática e da ativação de ilhotas a partir de camundongos DB DB, e também ser capaz de realizar os dois ensaios em língua para avaliar as respostas secretórias dentro de ilhotas intactas.

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

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Neste vídeo, descrevemos a imagem intravital do pâncreas de um camundongo através de uma janela estabilizada para visualização de longo prazo da dinâmica celular.

Imagem intravital: um método para observação em nível celular do pâncreas de camundongo através de uma janela de imagem estabilizada

Este vídeo demonstra um método baseado em imagem para visualizar células beta transplantadas que expressam luciferase em um camundongo imunodeficiente diabético não obeso. A introdução de esplenócitos de um camundongo diabético leva à destruição progressiva das células beta, visualmente confirmada pelo declínio da luminescência após a introdução do substrato.

Imagem de células beta transgênicas em um camundongo imunodeficiente desafiado com esplenócitos diabéticos

Uma nova abordagem combinando transplantação intra-ocular e microscopia confocal permite longitudinal, não-invasivo de imagem em tempo real, com uma única célula de resolução dentro dos tecidos...

Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Descreveremos um protocolo para visualização de exocitose de insulina em ilhotas intactas usando pHluorin, uma proteína verde fluorescente de sensíveis ao pH. Ilhotas isoladas estão infectadas com vírus adenoide codificação pHluorin juntamente com a carga de vesículas neuropeptide Y. Isto permite a detecção de eventos de fusão de grânulo de insulina por microscopia confocal.

Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens e quantificar a dinâmica do cálcio em populações heterogêneas de células, como células de ilhotas pancreáticas. Os repórteres fluorescentes são entregues na camada periférica de células dentro da ilhota, que é então imobilizada e imagemda, e a análise por célula da dinâmica da intensidade da fluorescência é realizada.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Este estudo apresenta a aplicação de fatias de tecido pancreático vivo ao estudo da fisiologia da ilhota e interações ilhotas-células imunes.

Observando a função da ilhota e interações celulares ilhotas-imunes em fatias de tecido pancreático ao vivo

A imagem in vivo de alta resolução do pâncreas foi facilitada com a janela de imagem intravital pancreática.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas viáveis do modelo Lepr Db de diabetes tipo 2 em camundongos e a realizar imagens de células vivas por microscopia de dois fótons para analisar a secreção de insulina em tempo real.

Lepr Db Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas (Vídeo) | JoVE Journal

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