Name: Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de mammosphere flutuante para estudar células-tronco em câncer de mama usando linhas celulares e tecidos tumorais. Este método avalia a capacidade de autorrenovação e potencial tumorigênico.

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Este trabalho é apoiado pela BRC imperial, o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde e Acção contra o Cancro, com menção especial para Hilary Craft e Sir Douglas Myers.

Os procedimentos a seguir foram eticamente aprovado pelo Imperial College, de Londres. 1. Geração de primárias Mammospheres de linhas celulares de cancro da mama humano NOTA: Execute as seguintes etapas sob uma capa de cultura estéril. <ol><li> Prepare Mammosphere meios contendo DMEM / F12 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Prepare media completo imediatamente antes da utilização, adicionando 20 fator ng / ml recombinante de crescimento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml fator recombinante humano básico de crescimento de fibroblastos (bFGF; Sistemas I &amp; D) e suplemento 1x B27. </li><li> Aspirar meios de balão contendo aderentes MCF-7 ou MDA-MB-231 (ou uma linha celular de cancro da mama de sua escolha; 70-80% de confluência), lavar duas vezes em 1x PBS, e trypsinize células. </li><li> Centrifugar células a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Células sobrenadante e ressuspender Decantar em 1-5 ml de mídia mammosphere. Pipetacima e para baixo e, se necessário, use um 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula. Usar um hemocitómetro para assegurar uma suspensão de célula única formou (se não, usar uma agulha G 25, a seringa da suspensão de células até 3 vezes). </li><li> Se necessário isolar CD44 + CD24- subconjunto celular através de FACS utilizando anticorpos anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpos monoclonais anti-9-CD44 fluoresceína. Alternativamente, isolar tais população que utiliza uma célula magnética ativado triagem do sistema (MACS) com anti-CD44 e microbeads combinados-anti-CD24 biotina, conforme as instruções do fabricante. Realizar seleção positiva usando LS colunas e seleção negativa usando colunas LD e confirmar os fenótipos de todas as células isoladas por citometria de fluxo 17. </li><li> Calcula-se o número de células viáveis ​​por ml, utilizando azul de tripano. NOTA: A viabilidade das células é calculada como o número de células viáveis, dividido pelo número total de células dentro das grades na hemocytometer. As células que ocupam azul tripan são considerados inviáveis. O procedimento seguinte é utilizado para determinar com precisão a percentagem de células viáveis. <ol><li> Prepara-se uma solução 0,4% de azul de tripano em PBS. Adicionar 0,1 ml de solução de estoque de azul de tripano a 1 ml de células. Coloque um hemocitômetro e examinar imediatamente sob um microscópio com pequeno aumento. Contar o número de células totais e o número de células coradas de azul. As células viáveis ​​= [1,00 - (número de células azuis ÷ Número de células totais)] x 100. </li><li> Para calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura, utilize a fórmula abaixo. Lembre-se de corrigir o fator de diluição. Número de células viáveis ​​× 10 × 1,1 = 4 células / ml de cultura </li></ol></li><li> Ressuspender uma quantidade pré-determinada de células em 2 ml de meio mammosphere completos em cada poço de uma placa de 6 poços aderente ultra-baixo. A densidade de sementeira é normalmente 500-4,000 células / cm2 de células por poço. Utilização lo Opcionalmentefixação w placas de 24 poços enquanto sementeira de células com a mesma densidade em 0,5 ml de meio. NOTA: Recomendamos a otimização da densidade de semeadura e tempo de cultivo para cada linhas de células de interesse. </li><li> Incubar baixa de fixação 6-se placas de ultra a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 5-10 dias (dependendo da linha de células e o tamanho do mammospheres) sem perturbar as placas, particularmente durante a fase de crescimento dos primeiros 5 dias . </li></ol> 2. Geração de primárias Mammospheres de cancro da mama humano amostras clínicas NOTA: tecido de cancro da mama humano pode ser obtido a partir de doentes submetidos a cirurgia para a remoção de tumores da mama. Tecido da loja em gelo durante até 24 horas em tubos de 50 ml estéreis em meio de cultura contendo 100 U / ml de penicilina e 100 U / ml de estreptomicina. Execute as seguintes etapas em uma capa de cultura estéril. <ol><li> Transfira a amostra num tecido 100 milímetros placa de Petri com um pequeno volume de meio. REMOVe do tecido adiposo com tesoura estéril, scapel e pinças. </li><li> Adicionar 2-3 ml de DMEM / F12 e pique a amostra em 1 milímetro 3 peças com um scapel estéril ou lâmina de barbear até que não haja grandes pedaços permanecem. </li><li> Ressuspender as peças de tecido em pré-aquecida de 10 ml de DMEM contendo enzimas proteolíticas (3.000 U / ml de colagenase e 1.000 U / ml de hialuronidase) e incubar a 37 ° C num agitador rotativo até que todos os fragmentos de tecido são digeridos. Normalmente, a digestão completa leva 1-3 horas. Ajuste o tempo de digestão de acordo com caracteres patológicos de tumores. (Por exemplo adenocarcinoma de mama é geralmente mais difícil de digerir em comparação com carcinoma mucinoso que é mais frágil e necessita de menor tempo de digestão). Avaliar o grau de digestão cada hora ½ observando 20 suspensão ul sob hemocitômetro. </li><li> Permitir que os fragmentos a sedimentar durante 5 min, em seguida, transferir o sobrenadante num tubo de polipropileno cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 10 min a ma quartoratura. Decantar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 1-5 ml de mídia mammosphere. </li><li> Siga os passos descritos acima para 1,1-1,4 linhas celulares para obter e chapa suspensões de células individuais. Passe células através da seringa 25 G um máximo de 2 vezes, se necessário limitar células prejudiciais. </li></ol> 3. Mammosphere Formando Eficiência (%) Cálculo <ol><li> Após o período de cultura, contar os mammospheres (maior do que 40 um) de diâmetro sob um microscópio com uma ampliação de 40X. Imagem digital 5 campos aleatórios utilizando uma câmera digital em um microscópio de luz e determinar o tamanho mammospheres usando o software de aquisição. Usar qualquer imagem Software Analysis. </li><li> Calcule Mammosphere Eficiência Formando (MFE%) utilizando a seguinte equação: MFE (%) = (# de mammospheres por poço) / (# de células semeadas por poço) x 100 </li></ol> 4. Passaging Serial de Mammospheres de Avaliação da auto-renovação <ol><li&gt; Pipeta o meio contendo as mammospheres de cada poço para um tubo de 15 ml. Lavar os poços com PBS e adicionar aos media recolhidos. Centrifugar a 115 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de pré-aquecido 0,5% de tripsina / EDTA a 0,2%. Incubar por 2-3 min. </li><li> Adicionar 500 ul de FCS para neutralizar a tripsina. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 100 mL de mídia mammospheres, pipetagem cima e para baixo para desagregar esferas. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro e determinar se as células estão em suspensão de célula única. Se não passar através de uma seringa 25 G até 3 vezes para se obter células isoladas. Semente as células em um novo ultra-baixo apego 6 bem-placa com a mesma densidade utilizado na geração primária. </li><li> Depois de 5-10 dias, conte esferas&gt; 40 mm e calcular a eficiência de formação de esfera usando a fórmula relatada antes. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses que possa ser percebido como prejudicial à imparcialidade deste artigo.

Avaliação positiva dos mammospheres primárias e secundárias depende das células sendo banhado pelo suficientemente baixas densidades que mammospheres formulário a partir de clones de solteiro, com esfera de agregação mínima. No entanto em densidades que são muito baixos, muito poucos mammospheres podem formar para distinguir os efeitos de tratamentos estatisticamente. Densidade de semeadura deve ser otimizado para cada linha celular utilizada, uma vez que podem variar consideravelmente em suas eficiências esfera formand...

A existência de linhagens de células tumorais chefiadas por células-tronco cancerosas-tronco como contribuiu largamente para a nossa compreensão da heterogeneidade tumor. Enquanto alguns diversidade fenotípica em tumores que surgem do crescimento clonal de clones geneticamente distintas, um componente substancial parece resultar de diferenças epigenéticas: as células cancerosas podem fazer a transição (por vezes de forma reversível) entre a haste, progenitor, e os estados diferenciados através da ativação ou repressão do gene específico programas de expressão 1-3. Isto pode reflectir factores intrínsecos ou extrínsecos de células, reflectindo a expressão do gene programa actualmente a ser expresso em uma célula com a sua sinalização a autócrino resultante em conjunto com sinalização parácrina da vizinha cancro, estromais ou células imunitárias entregar factores moduladores, e microenviromental condições tais como o grau de hipóxia 2,4,5. Embora as abordagens rastreamento de linhagem inovadorasestão avançando a nossa capacidade de estudar as células-tronco do câncer putativos em sua in vivo nicho 6-8, ensaios de formação de esfera continuará a ser uma abordagem popular e conveniente para estimar o potencial de células de câncer de mama &quot;para se comportar como células-tronco, pelo menos nas condições de ensaio utilizados. É frequentemente utilizado juntamente com os métodos retrospectivos para cancro de células estaminais de purificação, pela sua expressão de marcadores de membrana CD44 e CD24 9, e os níveis de enzima ALDH (aldeído desidrogenase) de actividade 10, marcadores que têm sido propostos para corresponder a mais mesenchymal- e epitelial -como células-tronco do câncer, respectivamente 11. A abordagem formação esfera foi desenvolvido pela primeira vez como o ensaio de neuroesferas, permitindo o crescimento de células estaminais putativas a partir de clones individuais em não-aderentes, condições livres de soro, com a adição de factor de crescimento epitelial (EGF) 12, sendo posteriormente aplicado utilmente ao normal e canceroso tecidos mamários. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A identidade da célula fundadora formador de esfera, e os tipos de células mistas que constituem a massa esfera, são relevantes para as deduções que podem ser feitos a partir de mammo-, ou outra esfera formando-ensaios. Células-tronco a longo prazo ósseas repouso fide, pensado para descansar em fase G0, não vai experimentar a combinação precisa de fatores que favorecem a ativação in vivo. O ensaio mammosphere vez permite o crescimento de células ou pronta para divisão mitótica ou já divisórias 13. Estes progenitores, embora não uma célula verdadeiramente quiescente, pode ser a célula que prolifera fase com os agentes mitogénicos de EGF e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados no ensaio. No entanto, eles contêm uma variedade de haste ativado sinalização associado a células vias 14. Além disso, a taxa da sua formação está relacionada com a tumorigenicidade de tecido que foram retiradas, quando medido pela sua potência para ensaios de diluição limitadas em xenoenxertos de ratinho 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar células individuais e que geram mammospheres primárias de ambas as linhas de células de câncer de mama humano e amostras clínicas de tumores de mama. Nós também descrevem como executar passagens em série de mammospheres primários para avaliar a auto-renovação, e como calcular esfera formando eficiência que permite a comparação entre diferentes densidades de semeadura (ver esquema na figura 1).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicilina & Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Fator de crescimento básico de fibroblastos humanos recombinante (bFGF)</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0,5% tripsina / 0,2% EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerro</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços de fixação baixa</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>colagenase tipo 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecação estéril tesoura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

formação mammosphere ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar aos tecidos saudáveis, muitas sangue e tumores sólidos são pensados ​​agora para ser organizados hierarquicamente, com um subconjunto de células-tronco cancerosas, como que se auto-renovar, dando origem a descendência mais diferenciada. Compreensão e segmentação destas células-tronco cancerosas no câncer de mama, que pode possuir reforçada quimio e radio-resistência em comparação com o volume do tumor não-haste, tornou-se uma importante área de pesquisa. Os marcadores, incluindo CD44, CD24, e a actividade de ALDH pode ser avaliada utilizando células activadas por fluorescência (FACS) para prospectivamente isolar células que exibem tumorigenicidade aumentada quando implantadas em ratinhos imunocomprometidos: o ensaio mammosphere também tem sido amplamente usada para a sua capacidade para identificar retrospectivamente sphere- formação de células que se desenvolvem a partir de clones de células-tronco como single. Aqui destacamos abordagens para a cultura apropriada de mammospheres de linhas celulares ou amostras primárias do paciente, sua passaging e cálculos para estimar esfera feficiência orming (SFE). Primeiro vamos discutir as principais considerações e armadilhas no planejamento e interpretação de experimentos mammosphere apropriado.

Diferentes amostras ou os sujeitos a diferentes tratamentos podem variar no número de mammospheres&gt; 40 mm que se formam após a normalização para células iniciais semeadas. Calcular mammosphere formando eficiência (MFE) para cada tratamento cultivadas em triplicado. Isto permite que as experiências com diferentes densidades de semeadura para ser comparadas. Os dados são melhor apresentado em um gráfico de barras, de preferência, com os controlos positivos e negativos, e mostrar o desvio padrão entre as cavidades em tr...

Os ensaios de mamosfera flutuante podem investigar o subconjunto de células-tronco de câncer de mama que sobrevivem em condições de suspensão e mostram tumorigênese aumentada quando implantadas em camundongos. Este protocolo fornece uma medida in vitro conveniente da capacidade de formação de esferas, um proxy para a tumorigênese in vivo, ao mesmo tempo em que facilita a análise da paisagem transcricional associada ao tronco.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estimar a proporção de células com características de células-tronco dentro de uma linhagem celular de câncer ou amostra de tecido tumoral e avaliar sua capacidade de autorrenovação em sucessivos subcultivos. Para isso, uma linhagem celular de câncer ou tecido tumoral é processada para gerar uma suspensão unicelular, que então é separada para isolar subpopulações celulares positivas para CD44 e negativas para CD24. As células são semeadas em placas com baixa adesividade, mantidas por um período para crescimento e posteriormente examinadas por microscopia de luz em forma de esferoides.A eficiência de formação é quantificada determinando o número de esferas formadas em relação ao número de células inicialmente semeadas. O processo de gerar uma suspensão de células isoladas, permitir tempo para crescimento e determinar a eficiência de formação de esferas é repetido em passagens sucessivas, fornecendo, em última análise, uma medida da capacidade das células de autorrenovação ao longo do tempo. Este método fornece um ensaio perspectivo simples para identificar células que exibem propriedades funcionais de células-tronco, como autorrenovação, bem como uma estimativa quantitativa do número de células-tronco provenientes de tumores in vivo.Um princípio central dos ensaios de formação de esferas é que cada esfera é derivada de uma única célula, sendo, portanto, clonal. Por essas razões, a densidade celular é o parâmetro mais importante desse ensaio, porque tem um impacto crítico na viabilidade. Trabalhando sob uma capela de cultura estéril, inicie este procedimento com células MCF seven ou MDA MB 2 3 1 que estejam 70 a 80% confluentes.Aspire o meio do frasco e lave as células duas vezes com PBS. Em seguida, adicione tripsina-EDTA e incube por dois a seis minutos, seguindo-se a dissociação com adição do meio de mamósfera contendo 10% de FBS. Uma vez que as células se tenham destacado, transfira-as para um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 200 × g, à temperatura ambiente, durante cinco minutos.Após a centrifugação, decante o sobrenadante. Em seguida, re-suspenda as células em um a cinco mililitros de meio manosférico, pipetando para cima e para baixo 10 vezes para dispersar o pellet celular. A seguir, passe a suspensão celular por um filtro de 40 micrômetros e colete o fluxo passante no tubo acoplado.Para obter uma suspensão de células isoladas, pipetei uma alíquota de 20 microlitros das células re-suspensas em um hemocitômetro e utilizei um microscópio para examiná-la. Se forem observados aglomerados celulares, como visto aqui, utilize uma seringa para passar a suspensão para dentro e para fora de uma agulha de 25 graus uma ou duas vezes. Uma vez que as células tenham sido dispersas em uma suspensão de células isoladas, conforme mostrado aqui, prossiga para isolar subpopulações celulares positivas para CD44 e negativas para CD24 por meio de triagem de células ativada por fluorescência ou triagem de células ativada magneticamente.Utilize uma coluna LS para selecionar positivamente as células positivas para CD44. Como as células desejadas aderem às paredes da coluna LS, descarte o fluxo que passa, em seguida, remova as células da coluna. Adicione cinco mililitros de tampão e use o êmbolo fornecido com a coluna, pressionando-o para expulsar as células desejadas.Em seguida, utilize uma coluna LD para purificar ainda mais a população por seleção negativa. Nesse caso, as células positivas para CD24 aderem às colunas LD. Colete o fluxo que passa, o qual contém as células negativas para CD24.Em seguida, utilizando citometria de fluxo, confirme os fenótipos de todas as células isoladas. Utilizando o método de exclusão com azul de tripano, calcule a densidade de células viáveis após diluir adequadamente a suspensão celular. Semee de 500 a 4.000 células por centímetro quadrado em cada poço de uma placa de adesão ultrabaixa de seis poços, em dois mililitros de meio completo para mamoesferas.Incube as placas tomando cuidado para não perturbá-las por cinco a 10 dias, até que esferoides sejam observados. Continue o cultivo até que os esferoides tenham pelo menos 40 micrômetros de diâmetro, mas ainda não tenham começado a apresentar apoptose. Obtenha tecido de câncer de mama humano de pacientes submetidos a cirurgia para remoção de tumores mamários.Armazene o tecido em gelo por até 24 horas em 50 mililitros. Tubos estéreis em DMEM contendo 100 unidades por mililitro, penicilina e 100 unidades por mililitro. Estreptomicina trabalhando sob uma capela de cultura de tecidos estéril.Transfira a amostra para uma placa de cultura tecidual de 100 milímetros contendo um pequeno volume de meio utilizando tesoura estéril, bisturi e pinça. Remova o tecido adiposo. Adicione dois a três mililitros de D-M-E-M-F 12 e, com um bisturi ou lâmina de barbear estéril, pique a amostra até que não restem pedaços grandes.Reese curva os fragmentos de tecido e 10 mililitros de DMEM pré-aquecido contendo enzimas proteolíticas e incuba a 37 graus Celsius em um agitador rotativo por uma a três horas. Ao separar células viáveis de tumores de primatas usando enzimas digestivas, existe um compromisso crítico entre a morte celular e a extração suficiente da matriz celular. Para garantir o sucesso, é essencial monitorar regularmente essa digestão. A cada meia hora, pipete 20 microlitros da suspensão em um hemocitômetro e use um microscópio para avaliar o grau de digestão.Uma vez concluída a digestão, deixe os fragmentos sedimentarem por cinco minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros.Centrifugue a 200 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as células em um a cinco mililitros de meio para mamósferas. Em seguida, prepare e plaque suspensões de células únicas conforme descrito na seção anterior.Neste vídeo, agite as células para cima e para baixo com uma seringa de 25 gauge no máximo duas vezes para dispersar as células, se necessário. Após o período de cultura, observe as células em uma ampliação de 40 vezes sob microscópio equipado com câmera digital. Adquira imagens de cinco campos aleatórios.Após todas as imagens terem sido capturadas, utilize o software de aquisição para determinar o número de microesferas com diâmetro maior que 40 micrômetros. Por fim, calcule a eficiência de formação de metaesferas dividindo o número de esferas mamos em cada poço pelo número de células semeadas em cada poço multiplicado por 100. Transfira o meio contendo as esferas mamos de cada poço para um tubo de 15 mililitros. Lave cada poço com PBS e adicione ao meio coletado.Em seguida, centrifugue as células a 115 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Suspenda o pellet em 500 microlitros de tripsina pré-aquecida com EDTA e incube por dois a três minutos.Após a incubação, adicione 500 microlitros de SFB para neutralizar a tripsina e, em seguida, centrifugue a 500 vezes G durante cinco minutos. Após a conclusão da centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de meio para mamasferas. Pipeteie para cima e para baixo para dissociar quaisquer esferas. Novamente, utilizando um hemocitômetro, conte as células e determine se elas se dispersaram em uma suspensão de células isoladas.Se não, passe-as através de uma seringa de 25 gauge até duas vezes para obter células isoladas, semeie as células em uma nova placa de seis poços com aderência ultrabaixa na mesma densidade utilizada na geração primária. Após cinco a 10 dias, conte as esferas maiores que 40 mícrons e calcule a eficiência de formação de esferas como anteriormente, para estimar a eficiência de formação de esferas. As atmosferas foram cultivadas a partir de uma linhagem celular epitelial positiva para estrogênio CF7 e de uma linhagem celular mesenquimal triplo negativa MDA-MB-231, conforme descrito neste vídeo. A contagem de mammosesferas maiores que 40 mícrons fornece uma estimativa da eficiência de formação de esferas para cada linhagem celular.Observe que a agregação mínima por fusão celular observada aqui foi obtida por meio de plaqueamento em baixa densidade, de 500 células por centímetro quadrado para o MCF7 e 1000 células por centímetro quadrado para o MDA231. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar e contar mamoesferas derivadas de diferentes linhagens celulares ou de amostras tumorais cirúrgicas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de semear as células em baixas densidades para garantir clonalidade e assegurar uma alta proporção de viabilidade celular ao extrair células de amostras cirúrgicas.Além deste procedimento, outros métodos, como o xenotransplante de populações celulares em camundongos imunocomprometidos, devem ser realizados para determinar a tumorigenicidade in vivo dos tecidos de interesse.

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JoVE Journal

Medicine

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