Name: Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda a medir a força isométrica máxima em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas. Este método permite avaliar propriedades contráteis celulares sem a complexidade da arquitetura muscular completa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelas seguintes fontes de financiamento: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
</ol>

Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela Aurora Scientific

As avaliações das propriedades contrácteis do músculo esquelético fibras individuais permeabilizadas são utilizados para investigar a função muscular de uma grande variedade de contextos. Exemplos incluem estudos que avaliaram os efeitos do envelhecimento 12, exercício 10,13,14, 15, voo espacial lesão 2,3,16, tratamentos de drogas 17,18, doença e 19 de manipulação genética 20,21 na estrutura e função de fibra. Devido à capacidade de avaliar directamente o desempenho contráctil de miofibrilas na sua configuração nativa, esta técnica fornece uma plataforma a partir da qual atraente para formar uma compreensão da função ausente miofibrilar de efeitos potencialmente confusão que estão presentes quando a transmissão de sinal neuromuscular e a libertação de cálcio induzida por excitação são incluídos no sistema estudado. Além disso, o teste funcional de fibras individuais podem ser usados ​​para complementar os resultados de identificação de proteína contráctil, tais como aquelesobtida por meio de imuno-histoquímica ou electroforese em gel de + 22 Western blot. Uma das funções primárias do músculo esquelético é de gerar força. Consequentemente sF o, uma medida da capacidade de geração de força intrínseca de um sistema contráctil, é de grande interesse para os fisiologistas musculares. Estimativas fiáveis ​​do SF o exigem medidas exatas de ambos CSA fibra e F o. Como as fibras são, em geral, nem circular em secção transversal, nem uniforme no CSA longo do seu comprimento, muito cuidado deve ser tomado ao estimar CSA. Para este fim, as medições são feitas em vários locais ao longo do comprimento da fibra e, em cada local, a partir de duas perspectivas separadas por 90 °. Medidas confiáveis ​​da F o exige atenção a vários detalhes, incluindo respondendo por força passiva, ajustando comprimento do sarcômero para maximizar a sobreposição de filamentos grossos e finos, empregando uma solução de ativação com uma concentração de cálcio tchapéu resulta em activação máxima, mantendo a temperatura experimental desejado, e a manutenção das condições óptimas de armazenagem (temperatura e duração) com as fibras antes do dia da experiência. Embora as etapas descritas aqui descrever o procedimento para avaliar força isométrica máxima, é freqüentemente desejável para avaliar outras qualidades funcionais importantes de fibras musculares esqueléticas. Isto pode ser conseguido através do alargamento do protocolo experimental para incluir manipulações mecânicas adicionais da fibra. Por exemplo, a medição da velocidade a que a fibra encurta contra uma série de diferentes cargas permite a determinação da relação força-velocidade, a partir dos quais as relações de força e de velocidade de alimentação de energia pode ser calculado 10,23,24. Além disso, a velocidade de encurtamento sem carga pode ser determinada através da utilização do &quot;teste de folga&quot; 25, o qual consiste em aplicar uma série de passos de encurtamento de indução de folga e measuring do tempo requerido pela fibra para remover a folga. Outro parâmetro cinética que é freqüentemente relatado é k tr, a constante de velocidade para a força de reconstrução na sequência de uma perturbação mecânica que destaca temporariamente todos pontes cruzadas 26. Por fim, a relação entre a concentração de cálcio e a geração de força activa (a &quot;relação força-PCA&quot;) é muitas vezes de interesse 18 e pode ser determinada por exposição da fibra a uma série de soluções com concentrações que variam de cálcio abaixo do limiar de activação do contráctil sistema para aqueles suficiente para provocar a activação máxima e, portanto, a força máxima (Fo). Embora grande parte do equipamento mencionado é necessária para avaliar a contratilidade de fibra única, outro equipamento não é absolutamente necessário. O controlador de comprimento, por exemplo, é essencial para qualquer protocolo experimental que requer alongamento rápido ou preciso, ou encurtamento da fibra,mas não é absolutamente necessário para a avaliação de força isométrica máxima (apesar de um nível de força de zero no registro vigor ainda deve ser identificado por alguns meios). Os prismas que permitem a observação da fibra a partir do lado, enquanto útil para avaliar a área em corte transversal, não são absolutamente necessárias quando o posicionamento da fibra no interior da câmara experimental. Além disso, meios alternativos para expor a fibra para as várias soluções experimentais poderia ser empregue, incluindo concepção de um sistema de accionamento manual de câmaras ou uma única câmara que permite o enchimento e esvaziamento rápidos de soluções. Finalmente, enquanto que as temperaturas experimentais sub-fisiológicas, tais como 15 ° C são normalmente utilizados para melhorar a reprodutibilidade das medições mecânicas 1,2,3,5,8,12,17,27, é possível gerar dados válidos a outras temperaturas 23 , 28, contanto que os efeitos da temperatura sobre as propriedades de solução (concentração de cálcio, pH, etc.) são tomadas em consideração. </p&gt; As composições das soluções de teste estão entre os aspectos mais críticos das técnicas de fibras permeabilizadas descritos aqui. Considerações sobre a composição da solução são complexas e além do escopo deste artigo. As soluções descritas no Passo 5 da secção de protocolo são concebidos com um ênfase na activação rápida da fibra permeabilizadas sobre a sua transferência desde a pré-activação de activação de soluções, mantendo uma força iónica constante, a composição catiónica, e osmolaridade 6,29. Outras abordagens para a composição da solução têm sido empregados com sucesso notável por outros grupos de pesquisa e normalmente fazem uso de constantes de ligação publicados e ferramentas computacionais 27,30,31. As concentrações de iões cálcio em várias soluções de activação é particularmente importante em estudos que envolvem a activação submáximo, tais como as avaliações força-PCA. Para as experiências em que as fibras são completamente activados, tais como os que descrevemd aqui, a concentração de cálcio na solução de activação, tipicamente excede por uma margem confortável, que requerida para atingir a força máxima, fazendo o seu conhecimento preciso menos crítica. A adição de fosfato de creatina é importante para tamponar os intramyofibrillar ATP e ADP flutuações que de outra forma seriam associadas com a actividade contráctil. A creatina-quinase é necessária para catalisar a transferência de fosfato a partir de fosfato de creatina ao ADP. Sob condições experimentais que resultam em elevadas taxas de turnover ATP, incluindo trabalho a temperaturas elevadas ou a medição de encurtamento de alta velocidade em fibras rápidas 32, creatina quinase deve ser adicionado à solução para completar o endógena de creatina quinase que permanece ligado à fibra. As condições experimentais menos exigentes, o sistema de regeneração de ATP 27 é menos crítica. As limitações da técnica de fibra única permeabilizada incluem o seguinte. Os dados gerados por esses testes de definir opropriedades contrácteis da unidade miofibrilar específico que foi ligado ao dispositivo experimental. Por conseguinte, este capta apenas uma pequena fracção da totalidade da fibra multinucleadas partir do qual o segmento que foi obtido, por sua vez, representa uma pequena fracção do número total de fibras dentro do músculo. Os investigadores devem, portanto, considerar cuidadosamente a amostragem necessária para suportar todas as conclusões extraídas das experiências. Além disso, a avaliação do impacto de uma intervenção treinamento físico na função de fibra presume que as fibras avaliadas foram de fato recrutadas durante o treinamento. Embora o protocolo tenta imitar o meio intracelular natural da fibra, o processo de permeabilização sarcolema é não-específica e permite necessariamente constituintes intracelulares solúveis de difundir livremente em soluções de banho. Uma outra consequência da permeabilidade da membrana é uma mudança no equilíbrio osmótico evidenciado por um inchaço no volume de fibras 33. Ointumescente de fibras aumenta a distância entre os filamentos de actina e miosina, resultando em sensibilidade ao cálcio reduzida do sistema miofilamentos 34,35, mas pode ser revertida pela introdução de grandes, compostos osmoticamente activos 34. Uma limitação final a considerar é a consequência da técnica utilizada para anexar fibras para o aparelho experimental. Isso invariavelmente requer que distorcem a relação espacial dentro do sistema filamento em e perto dos pontos de fixação, com pessoas vão déficits funcionais. Especificamente, as regiões da fibra no e adjacente aos pontos de fixação estão funcionalmente comprometidas e, assim, contribuir série artefatual elasticidade ao sistema de medição. Em resumo, descrevemos um meio pelo qual se pode avaliar a capacidade de geração de força de quimicamente permeabilizadas fibras musculares esqueléticos in vitro. Embora o foco deste artigo foi sobre a avaliação da força isométrica máxima generatincapacidade g de fibras de músculo esquelético humano, a abordagem experimental pode ser modificado e ampliado para determinar uma variedade de parâmetros cinéticos e relacionamentos em toda uma gama de espécies de mamíferos, ou de outra forma.

A função primária do músculo esquelético é de gerar força. Força muscular é provocada in vivo através de uma complexa seqüência de eventos que inclui os potenciais de ação dos nervos motores, a transmissão neuromuscular, potenciais de ação das fibras musculares, liberação de cálcio intracelular e ativação do sistema de proteínas reguladoras e contráteis. Porque a geração de força é o resultado final desta sequência, um défice em vigor pode ser causado por uma falha de um ou mais dos passos individuais. Um atributo chave de preparação de fibras permeabilizadas é que elimina a maior parte das etapas necessárias para a geração de força in vivo, com apenas as funções de regulação e contrácteis associados com o aparelho restante miofibrilar. O investigador assume o controlo sobre a entrega de cálcio e ativação de energia (ATP), e é recompensado com um sistema simplificado que permite a avaliação das estruturas reguladoras e contráteis isolado em sua co nativanfiguration. Medidas de força, utilizando fibras musculares esqueléticas permeabilizadas são, portanto, valioso ao avaliar alterações na função muscular observadas in vivo. Por exemplo, temos utilizado essa técnica para caracterizar a capacidade de geração de força de fibras de miostatina camundongos deficientes 1 e para avaliar a causa da fraqueza muscular persistente exibiu seguinte crônica do manguito rotador lágrimas 2,3. Metodologia de fibras permeabilizadas moderna pode ser atribuída ao início dos estudos influentes 4,5 e está atualmente em uso por um número de grupos de pesquisa. Embora as técnicas têm sido descritas na literatura, eles ainda não foram apresentadas em formato de vídeo. O objetivo deste artigo é ilustrar, uma técnica válida e confiável atualizada para medir a capacidade máxima de geração de força de fibras individuais a partir de amostras de músculo esquelético quimicamente permeabilizadas. Para conseguir isso, um segmento individual de fibra (aqui referido como um ̶0; fibra &quot;) é extraído a partir de um pacote pré-permeabilizadas de fibras e colocado numa câmara experimental contendo uma solução de repouso, a característica definidora de que é uma concentração de cálcio que é &lt;10 nM. A fibra é então ligado numa extremidade a um transdutor de força-e na outra extremidade a um comprimento-controlador. Com a fibra mantida a um comprimento sarcómero óptima, a mesma é transferida para uma solução de activação que tem uma concentração de cálcio suficiente para induzir a activação máxima e assim a máxima força de contracção isométrica. Força dados são adquiridos, armazenados e analisados ​​utilizando um computador pessoal.

<table><tbody><tr><td>Tubo de ensaio de cultura de poliestireno com tampa</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Microcentrífuga 14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml com tampa de rosca</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de microcentrífuga de 0,5 ml com anel de vedação</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga criobox Fisher</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>Medidor de pH 5055-5005</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Sutura não estéril 10-0 monofilamento</td><td>Linha de Ashaway Fio</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Alfinetes de insetos</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps - Dumont # 5</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação</td><td>Ferramentas de ciências finas</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td>Inversores de micrômetro MZ8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Circulador de banho-maria&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Série 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW software</td><td>National Instruments-Computer</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Varied-Chamber</td><td></td></tr> <tr><td>System</td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de comprimento</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de força</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>K-proprionato</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (ácido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull; 0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (ácido)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (ácido)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 padrão</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 padrão</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

A análise das propriedades contráteis de fibras musculares esqueléticas quimicamente esfoladas ou permeabilizadas oferece um meio poderoso para avaliar a função muscular no nível de uma única célula muscular. Estudos de fibra muscular única são úteis tanto na ciência básica quanto em estudos clínicos. Para estudos básicos, as medidas de contratilidade de fibras musculares únicas permitem a investigação de mecanismos fundamentais de produção de força e a análise da função muscular no contexto de manipulações genéticas. Clinicamente, estudos de fibra muscular única fornecem informações úteis sobre o impacto de lesões e doenças na função muscular e podem ser usados para orientar a compreensão de patologias musculares. Neste artigo em vídeo, descrevemos as etapas necessárias para preparar e isolar um segmento individual de fibra muscular esquelética, anexá-lo ao aparelho de medição de força, ativá-lo para produzir força isométrica máxima e estimar sua área de seção transversal com o objetivo de normalizar a força produzida.

Saudáveis, fibras quimicamente permeabilizadas individuais devem aparecer uniforme em forma e ter um intervalo entre estrias consistente quando visto sob alta ampliação. As fibras que são inflexíveis quando manipulado com a pinça ou com danos estruturais óbvios deve ser descartado. Imagens digitais de alta ampliação tomadas durante a etapa 15 são analisadas por 5 medições de diâmetro emparelhados ao longo da barriga da fibra. Fibra CSA é estimada assumindo uma secção transversal elíptica e uma média de 5 medições CSA individuais conforme mostrado na Figura 7A. Figura 7B também serve para ilustrar a forma como as dimensões da fibra em uma vista pode ser significativamente diferente, em comparação com as dimensões emparelhados na outra vista (isto é, transversal seções não são, em geral, e volta). Vestígios força representativos de fibras lenta e rápida humanas são mostrados nas Figuras 8A e 8B, respectivamente. Voltage de saída do transdutor de força-é adquirida durante o teste e convertido para forçar (MN) utilizando o software de aquisição de dados e análise (LabVIEW). A Figura 9 ilustra o método utilizado para avaliar a força activa máxima (Fo), que é calculado subtraindo a força necessária para manter a fibra com comprimento de sarcômero ideal, enquanto em um estado relaxado (força passiva, F P), a partir da maior força isométrica desenvolvida durante a ativação de fibra máxima (força total F T). Uma vez que a saída do transdutor de força-que corresponde à força zero é, em geral, diferente para cada uma das diferentes câmaras de banho, fazemos uma breve distender a fibra em ambos os pré-activação e activação soluções para capturar o nível da força de zero no registro experimental. A normalização da força máxima ativa por fibra CSA é usado para gerar o valor mais informativo de força específica (SF o). Porque leva em consideração o CSA da fibra, o sF </sub&gt; fornece uma medida da capacidade de geração de força intrínseca do aparelho contráctil da fibra, permitindo assim comparações funcionais entre fibras de diferentes tamanhos. Deve, contudo, notar-se que as medições de CSA não é capaz de distinguir a proporção da fibra ocupada por filamentos contrácteis contra a proporção ocupada por outras estruturas subcelulares. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de 2,011 Claflin et al. 10 de humano, Mendias et al., 2011 1 de rato e Gumucio et al., 2012 2 para o rato são detalhadas na Tabela 3. Todos os dados apresentados na Tabela 3 foram gerados utilizando o técnicas descritas neste artigo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humano (Vasto lateral) </strong&gt; </td><td> Rato (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rato (Infra) </td></tr><tr><td colspan="2"> Masculino </td><td colspan="2"> Feminino </td><td> Masculino </td><td> Masculino </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (Não identificado) </td><td> (Não identificado) </td></tr><tr><td> CSA (2 uM) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F O (mn) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. As características típicas de adultos saudáveis, fibras de músculo vasto lateral humano 10, rato extensor longo dos dedos 1 e 2 infra rato músculos. Comprimentos de sarcômero Optimal foram fixados em 2,7 mm para fibras humanos 7,8 e 2,5 mm tanto para rato (36, 37) e fibras de rato (38). Gamas Experimental L F (25 º e 75 º quartis) foram 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm para humanos, ratos e ratinhos, respectivamente. Intervalos mostrados indicam os dias 25 e 75 th quartis e n ​​é o número de fibras testadas. Os problemas mais comuns experimentados durante os testes incluem um deslizamento laço de sutura, o que resulta em uma força response com um &quot;captura&quot;, tal como o ilustrado na Figura 10A, e um rasgo de espessura parcial ou total da fibra, o que resulta em uma resposta força que retorna bruscamente na direcção de ou para (pausa) zero, enquanto a fibra ainda está imerso na solução de activação (Figura 10B). Se um deslize, lágrima ou ruptura ocorre durante um experimento, a fibra deve ser descartado e os dados excluídos, embora mantendo um registro de falhas de fibra também pode ser informativa 11. Outro resultado negativo que pode ser encontrada é a activação prematura da fibra enquanto no pré-activação de solução (Figura 10C). Activação parcial na solução de pré-activação sugere contaminação cruzada bem significativa (isto é, um aumento na concentração de cálcio não intencional no pré-activação bem). Neste exemplo, todos os banhos deve ser aspirado e bem lavado com água desionizada. A secagem das superfícies divisórias entre as câmaras também é recoded como umidade ou condensação nessas áreas pode levar à absorção da solução entre banhos. A decisão de incluir ou excluir dados dependerá em última análise o foco experimental e deve, portanto, ser considerado na concepção do estudo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: laço de sutura (10-0 monofilamento de nylon de sutura). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissecação Bundle Fórceps estão na mão esquerda, tesouras microdissection estão na mão direita. A linha vermelha indica a orientação favorável do punho e da tesoura com os eixos longitudinais das fibras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) aparelho de teste com componentes marcados. (A) câmaras experimentais com fundos transparentes. (B) Comprimento-controlador. (C) Force-transdutor. (D) fonte de luz. (E) Comprimento-controlador da unidade micrômetro xyz com display digital. (F) unidade Stage micrômetro com display digital. (G) Force-transdutor unidade xyz micrômetro. (H) Plataforma de tela alvo laser de difração calibrado. Tabela isolamento (i) da vibração. (B) Opinião do Close-up das câmaras experimentais. Superfície (j) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o controlador comprimento. Superfície (k) de fixação de aço inoxidável estendendo-se desde o transdutor de força. (L) Side-view prisma. (M) Habitação para os módulos de refrigeração termoelétrica. (N) Termopar para relatar te câmaramperatura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificado 100 ponta da pipeta ul usado para transferir fibra de dissecção prato para a câmara experimental. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montagem de fibra única para aparato experimental (A) Gonzos para suturas preparadas enroscada superfícies de fixação de aço inoxidável. (B) transferido para a câmara de fibra experimental. (C) A fibra ancoradas às superfícies de fixação de aço inoxidável pelo primeiro par de argolas de sutura com fio de sutura em excesso removida. (D) segundo par de alças metálicas de sutura inseridas por cima de loops primeira sutura e amarrados no lugar. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: comprimento do sarcômero é avaliada pela projecção de um padrão de interferência de laser sobre uma tela de destino calibrado (a) fonte de laser.. (B) Mirror. (C) tela Target. Padrão de interferência (d) Laser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="A Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (a) determinação da área em corte transversal da fibra em comprimento óptimo sarcómero (humano = 2,7 uM). Assumindo uma secção transversal elíptica, a CSA é calculado para cada um dos cinco locais ao longo da fibra de secção mestra e a média das cinco medições individuais é relatado como fibra de CSA. 2a representa diâmetro e é vista de cima<html> um eixo maior da elipse, 2b representa vista lateral de diâmetro e é o outro eixo da elipse. (B) imagens de fibras representativas que ilustram cada um dos cinco medições correspondentes diâmetro tomadas tanto na vista de topo e lateral. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: traços de força representativos do músculo vasto lateral humano saudável fibras musculares (A) Escreva uma fibra (CSA: 5710 mm 2, F o: 0,89 mN e SF o: 156 kPa).. (B) Tipo de fibra 2a (CSA: 9510 mm 2, o F: 1,66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina tipo cadeia pesada foi determinado através da utilização de separação electroforética e prata-coloração técnicas 22. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Cálculo da força ativa máxima (F o) (a) vista expandida de resposta vigor fibras durante o indutor de folga circulação de comprimento-controlador iniciado em solução de pré-activação.. F P é a força necessária para manter um comprimento do sarcómero 2,7 um com a fibra em repouso. (B) vista expandida de comprimento-controlador de movimento de indução de folga. Note-se que o F = F T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: deslizamento (A) laço de sutura, evidenciado por um &quot;catch&quot; em vigor traço durante a ascensão da força. Verifique para ter certeza de que estão seguros laços antes de ativar a fibra. (B) ruptura de fibra durante a ativação. Pode ser devido a integridade da fibra pobres ou tratamento fibra agressivo durante sutura lugar de loopmento. (C) a ativação de fibra parcial prematura devido à contaminação da câmara de pré-ativação com Ca 2+.

Análise das propriedades contráteis das fibras musculares esqueléticas, pele quimicamente, ou permeabilizadas oferece um poderoso meio para avaliar a função muscular ao nível da célula muscular único. Neste artigo vamos descrever uma técnica válida e confiável para preparar e testar permeabilizadas fibras musculares esqueléticas in vitro.

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a capacidade máxima de geração de força isométrica de fibras individuais provenientes de amostras de músculos esqueléticos quimicamente permeabilizados. Isso é realizado primeiramente expondo as membranas das fibras musculares a um detergente químico, removendo assim a barreira entre os conteúdos extracelular e intracelular. O segundo passo consiste em extrair uma fibra individual de um pequeno feixe de fibras e fixá-la ao aparato experimental.Em seguida, padrões de interferência a laser são utilizados para definir o comprimento ótimo do sarcômero para a fibra individual. Por fim, o cálcio é administrado para provocar a força máxima de contração isométrica. Em última análise, a técnica de fibra única permeabilizada fornece uma avaliação das propriedades contráteis do músculo esquelético sem as complexidades associadas à arquitetura do músculo inteiro.A demonstração visual deste método é útil, pois as etapas principais para a realização bem-sucedida do protocolo podem ser difíceis de aprender. Comece preparando as soluções de dissecação, armazenamento e teste conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, use pinças para preparar laços de sutura a partir de filamentos de sutura de nylon monofilamento USP 10 zero.Utilizando a técnica do nó duplo de overhand, prepare quatro laços para cada fibra a ser testada. Após formado, coloque o nó sob um microscópio e reduza seu tamanho para um diâmetro aproximado de 750 micrômetros, utilizando as marcações IPS GTI como guia.Em seguida, corte qualquer excesso de sutura, deixando apenas o laço e pequenas pontas de 500 micrômetros em ambos os lados. Transfira uma pequena porção de tecido muscular obtida por biópsia aberta ou por agulha para uma placa contendo solução de dissecação gelada e adicione mais solução de dissecação para garantir que o tecido permaneça submerso. Inspecione a amostra ao microscópio e manipule-a para alinhar o eixo longitudinal das fibras em direção ao ombro direito do pesquisador.Em seguida, fixe a amostra ao recipiente prendendo suas bordas com a pinça na mão esquerda e a tesoura microcirúrgica na mão direita. Comece a dissecar suavemente um feixe ao longo das margens longitudinais entre as fibras. Remova e descarte qualquer tecido danificado pela pinça ou pelas agulhas.Como resultado do processo de dissecação, transfira os feixes da solução de dissecação para um frasco de três mililitros contendo 2,5 mililitros de solução de dissecação fresca e refrigerada, com um detergente não iônico adicionado. Incube a amostra em gelo por 30 minutos, com agitação suave ocasional, garantindo que os feixes permaneçam submersos durante toda a incubação. Em seguida, transfira os feixes para um frasco contendo solução de dissecação fresca e agite suave e brevemente para remover qualquer resíduo de detergente.Uma vez lavados, transfira os feixes para um frasco contendo solução de armazenamento gelada e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, retire o frasco do armazenamento a quatro graus Celsius e transfira todos os feixes para um copo de medicina ou bandeja de dissecação. Em preparação para o congelamento, transfira os feixes para frascos criogênicos individualmente rotulados, preenchidos com 200 a 400 microlitros de solução de armazenamento fresca, e certifique-se de que o feixe não esteja preso à parede do tubo ou flutuando na superfície.Em seguida, tampe o tubo e armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Monte um aparato experimental como o mostrado aqui e descrito no protocolo de texto acompanhante. Em seguida, preencha a primeira câmara experimental com solução relaxante, a segunda câmara com solução pré-reativadora e a terceira com solução ativadora.Ajuste a temperatura na câmara até que ela se estabilize em 15 graus Celsius com o aparelho na solução relaxante. Passe dois dos laços de sutura preparados nas superfícies de fixação de aço inoxidável que se estendem tanto do transdutor de força quanto do controlador de comprimento. Em seguida, descongele um feixe de fibras de interesse sobre gelo por cerca de 15 minutos e, depois, transfira-o para uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone contendo solução relaxante fresca e gelada.Fixe o feixe no lugar com alfinetes em ambas as extremidades e certifique-se de que ele esteja submerso usando a pinça. Segure uma fibra em uma das extremidades e comece a extraí-la suavemente ao longo de seu eixo longitudinal. Deve-se ter cuidado ao extrair as fibras do feixe, pois adesões entre as fibras e a matriz extracelular podem gerar tensão excessiva, levando, em última instância, a danos induzidos por estiramento.Uma vez extraída, introduza a fibra em uma ponteira de pipeta modificada juntamente com uma pequena quantidade de solução relaxante e transfira-a para a câmara experimental que contém a solução relaxante, guiando suavemente com a pinça. Remova a fibra da ponteira e fixe-a ao controlador de comprimento. Usando o primeiro laço de sutura, manipule a outra extremidade da fibra em direção ao transdutor de força e fixe a fibra utilizando o mesmo procedimento.Remova qualquer excesso de sutura utilizando a tesoura de dissecação microcirúrgica. Em seguida, passe o segundo laço sobre o primeiro e fixe a fibra em um ponto situado a até 0,2 milímetros da extremidade da superfície de fixação do controlador de comprimento. Repita o procedimento com o segundo laço na extremidade da fibra ligada ao transdutor de força.Ajuste a posição do controlador de comprimento na direção do eixo Y para alinhar a fibra paralelamente às paredes laterais da câmara experimental. Em seguida, examine a fibra utilizando a visão lateral do prisma e ajuste a posição do controlador de comprimento na direção do eixo Z até que a fibra esteja paralela ao fundo da câmara. Se a fibra estiver danificada de alguma forma, ela deve ser descartada e uma nova fibra deve ser fixada.Ligue o laser e ajuste a posição da platina de modo que o laser passe pelo centro da fibra. Em seguida, defina o comprimento do sarcômero aumentando ou diminuindo a tensão na fibra usando o micrômetro do controlador de comprimento no eixo X até que o espaçamento desejado da luz difratada seja observado na tela do alvo. Após o comprimento do sarcômero ótimo ter sido definido, meça a distância entre os dois pontos de sutura mais internos.Posicione a câmara de modo que o retículo vertical da ocular esteja alinhado com a borda mais interna de uma sutura interna e zero. O mostrador digital do micrômetro moverá o estágio ao longo do eixo x em relação ao microscópio até que o retículo vertical da ocular esteja alinhado com a sutura mais interna. O visor digital indicará o comprimento da fibra, mantenha a fibra no comprimento medido e utilize a câmera acoplada ao microscópio para capturar uma imagem em alta magnificação da porção central da fibra, nas vistas superior e lateral.Utilize estas imagens para calcular a área da seção transversal da fibra. Use o software de controle da câmara para mover a fibra até a câmara contendo a solução pré-reativadora e incubar por três minutos. Enquanto a fibra estiver na solução inativadora, meça sua tensão passiva, depois mova a fibra para a câmara contendo a solução ativadora e permita que a força isométrica máxima se desenvolva, evidenciada por um platô na força precedido por um aumento rápido.Em seguida, utilize o controlador de comprimento para aplicar uma redução rápida e breve na distância entre os pontos de fixação da fibra, seguida por um retorno rápido ao comprimento original, a fim de identificar a saída do transdutor de força correspondente a zero. As forças mostradas aqui são vistas superior e lateral de uma fibra com formato elíptico a partir dessas imagens. A área da seção transversal foi determinada medindo-se os diâmetros em cinco pontos ao longo do comprimento da fibra e, em seguida, calculando-se a média das cinco áreas resultantes.Rastros de força de fibras musculares humanas, lentas e rápidas ilustram que as fibras rápidas geram força a uma taxa mais elevada do que as fibras lentas, utilizando a técnica mostrada neste vídeo. As características típicas de fibras musculares humanas, de camundongo e de rato foram medidas e são apresentadas aqui. A faixa indicada corresponde aos quartis de 25 a 75 e N é o número de fibras testadas.Observe a grande variação na força específica entre as diferentes espécies. Os procedimentos descritos aqui permitem a avaliação da capacidade máxima intrínseca de geração de força de uma única fibra muscular esquelética, mediante a adição de intervenções adicionais, aspectos importantes da fisiologia do músculo esquelético, incluindo, entre outros, força-comprimento, força-velocidade e relações força-cálcio, que podem ser reveladas.

measurement-maximum-isometric-force-generated-permeabilized-skeletal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo demonstra modulação da atividade reflexa, força volitiva e deambulação através de avaliação clínica e quantitativa em indivíduos com motor SCI incompleta como resultado da administração oral aguda de um inibidor da recaptação da serotonina (ISRS).

Os métodos para quantificar alterações farmacologicamente induzida na função motora em humanos SCI incompleta

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

Este vídeo demonstra a preparação cirúrgica e os procedimentos necessários para estudar as respostas contráteis da preparação músculo gastrocnêmio medial de...

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em...

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

As medições da função do músculo contribui para a avaliação de potenciais agentes terapêuticos para o músculo patologia, bem como para a determinação dos mecanismos subjacentes à fisiologia desse tecido. Vamos demonstrar a preparação do extensor longo dos dedos e músculos do diafragma para testes funcionais. Protocolos para contrações isométricas e excêntricas será mostrado, bem como as diferenças de resultados entre os músculos distróficos, representando um estado patológico, e os músculos de...

Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

Apresentamos um protocolo para avaliar alterações na função neuromuscular. A estimulação elétrica nervosa percutânea é um método não invasivo que evoca respostas musculares. As propriedades eletrofisiológicas e mecânicas dessas respostas permitem a avaliação da função neuromuscular do cérebro ao músculo (níveis supraespinhal, espinhal e periférico).

Avaliação da função neuromuscular Usando percutânea Estimulação Elétrica Nervosa

Descrevemos um protocolo in vivo para medir a dorsiflexão do pé após estimulação do nervo fibular e contração do compartimento crural anterior do membro posterior do rato. Essas medições são uma ferramenta translacional indispensável para avaliar a patologia do músculo esquelético e as abordagens de engenharia de tecidos para reparo e regeneração muscular.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Uma avaliação funcional da junção neuromuscular (JNM) pode fornecer informações essenciais sobre a comunicação entre o músculo e do nervo. Aqui descrevemos um protocolo para avaliar exaustivamente o músculo e o MNJ funcionalidade usando duas preparações diferentes de nervo-músculo, ou seja, sóleo-isquiático e frênico-diafragma.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.

Isolando Myofibrils de Biópsias musculares esqueléticas e determinando função contractile com um transdutor de força de resolução nano-Newton

A avaliação da recuperação motora continua sendo a medida de desfecho de referência em estudos experimentais de nervos periféricos. A medição da força tetanica isométrica do músculo tibialis anterior no rato é uma ferramenta inestimável para avaliar os resultados funcionais após a reconstrução de defeitos do nervo ciático. Os métodos e nuances estão detalhados neste artigo.

Medição máxima da Força Tetanica Isométrica do Músculo Tibialis Anterior no Rato

O presente protocolo descreve detalhes experimentais concisos sobre a avaliação e interpretação dos dados de torque in vivo obtidos por estimulação elétrica do nervo peroneal comum em suínos anestesiados.

In vivo Medição do Torque Isométrico Dorsiflexor Hindlimb do Porco

Aprenda a medir a força isométrica máxima em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas. Este método permite avaliar propriedades contráteis celulares sem a complexidade da arquitetura muscular completa.

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Explorar mais vídeos