Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

O objetivo geral deste procedimento é medir a capacidade máxima de geração de força isométrica de fibras individuais a partir de amostras de músculos esqueléticos quimicamente permanentes. Isso é feito expondo primeiro as membranas das fibras musculares a um detergente químico, removendo assim a barreira entre o conteúdo extracelular e intracelular. O segundo passo é extrair uma fibra individual de um pequeno feixe de fibras e anexá-la ao aparato experimental.

Em seguida, os padrões de interferência do laser são usados para definir o comprimento ideal do sarcômero para a fibra individual. Finalmente, o cálcio é administrado para provocar a força máxima de contração isométrica. Em última análise, a técnica de fibra única permanente fornece uma avaliação das propriedades contráteis do músculo esquelético sem as complexidades associadas à arquitetura muscular total.

A demonstração visual desse método é útil, pois as principais etapas para executar o protocolo com sucesso podem ser difíceis de aprender. Comece preparando as soluções de dissecação, armazenamento e teste conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, use uma pinça para preparar alças de sutura de fios de sutura de náilon monofilamento zero USP 10.

Usando a técnica do nó duplo overhand, prepare quatro alças para cada fibra a ser testada. Uma vez formado, coloque o nó sob um microscópio e reduza seu tamanho para aproximadamente 750 micrômetros de diâmetro. Usando as marcações IPS GTI como guia.

Em seguida, corte qualquer excesso de sutura, deixando apenas o laço e pequenas caudas de 500 micrômetros de cada lado. Transfira uma pequena massa de tecido muscular obtida por biópsia aberta ou por agulha para um prato contendo solução de dissecção gelada e adicione mais solução de dissecção para garantir que o tecido permaneça submerso. Inspecione a amostra ao microscópio e manipulada para alinhar o eixo longitudinal das fibras em direção ao ombro direito do investigador.

Em seguida, ancore a amostra ao prato, prendendo-a nos cantos com a pinça na mão esquerda e a tesoura de microdissecação na direita. Comece a dissecar suavemente um feixe ao longo das margens longitudinais entre as fibras. Remova e descarte qualquer tecido danificado pela pinça ou pinos.

Como resultado do processo de dissecação, transfira os feixes da solução de dissecação para um frasco de três mililitros contendo 2,5 mililitros de solução de dissecação fresca resfriada com um detergente não iônico adicionado. Incubar a amostra no gelo durante 30 minutos, com agitação ocasional e suave, e assegurar que os feixes permanecem submersos durante a incubação. Em seguida, transfira os feixes para um frasco contendo uma solução de dissecação fresca e agite suave e brevemente para remover qualquer detergente restante.

Depois de enxaguados, transfira os feixes para um frasco contendo solução de armazenamento refrigerada e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova o frasco do armazenamento a quatro graus Celsius e transfira todos os pacotes para um copo de remédio ou prato de dissecação. Na preparação para o armazenamento, transfira os feixes para frascos criogênicos rotulados individualmente, cheios de 200 a 400 microlitros de solução de armazenamento fresca e certifique-se de que o feixe não fique preso na lateral do tubo ou flutuando na superfície.

Em seguida, tampe o tubo e armazene a amostra a 80 graus Celsius negativos. Montar um aparato experimental como o mostrado aqui e atribuído no protocolo de texto que o acompanha. Em seguida, encha a primeira câmara experimental com solução relaxante, a segunda câmara com solução pré-reativadora e a terceira com solução ativadora.

Ajustar a temperatura na câmara até estabilizar a 15 graus Celsius com o aparelho na solução relaxante. Passe duas das alças de sutura preparadas nas superfícies de fixação de aço inoxidável que se estendem do transdutor de força e do controlador de comprimento. Em seguida, descongele um feixe de fibras de interesse no gelo por cerca de 15 minutos e, em seguida, transfira-o para uma placa de Petri revestida com elastômero de silicone cheia de solução relaxante fresca e gelada.

Prenda o feixe no lugar com pinos em cada extremidade e certifique-se de que esteja submerso usando a pinça. Segure uma fibra em uma extremidade e comece a extraí-la suavemente ao longo de seu eixo longitudinal. Deve-se ter cuidado ao extrair fibras do feixe, pois as aderências entre as fibras e a matriz extracelular podem resultar em tensão excessiva, levando a danos induzidos pelo estiramento.

Uma vez extraída, introduza a fibra em uma ponta de pipeta modificada junto com uma pequena quantidade de solução relaxante e transfira-a para a câmara experimental que contém a solução relaxante guiando suavemente com a pinça. Remova a fibra da ponta da pipeta e prenda-a ao controlador de comprimento. Usando a primeira alça de sutura, manipule a outra extremidade da fibra em direção ao transdutor de força e prenda a fibra usando o mesmo procedimento.

Remova qualquer excesso de sutura usando a tesoura de microdissecação. Em seguida, passe o segundo laço sobre o primeiro e ancore a fibra em um ponto a 0,2 milímetros da extremidade da superfície de fixação do controlador de comprimento. Repita com o segundo loop na extremidade do transdutor de força da fibra.

Ajuste a posição do controlador de comprimento na direção do eixo Y para alinhar a fibra paralelamente às paredes laterais da câmara experimental. Em seguida, examine a fibra usando a vista lateral do prisma e ajuste a posição do controlador de comprimento na direção do eixo Z até que a fibra fique paralela ao piso da câmara. Se a fibra estiver danificada de alguma forma, a fibra deve ser descartada e uma nova fibra anexada.

Ligue o laser e ajuste a posição do stage de forma que o laser passe pelo centro da fibra. Em seguida, defina o comprimento do sarcômero aumentando ou diminuindo a tensão na fibra usando o driver de micrômetro do eixo X do controlador de comprimento até que o espaçamento desejado da luz difratada seja observado na tela de destino. Depois que o comprimento ideal do sarcômero for definido, meça a distância entre as duas suturas mais internas.

Posicione a câmara de forma que a cruz vertical da ocular fique alinhada na borda mais interna de uma sutura interna e zero. A leitura digital na unidade do micrômetro traduz o estágio ao longo do eixo x em relação ao microscópio até que a cruz vertical da ocular esteja alinhada com a sutura mais interna. O display digital indicará o comprimento da fibra, manterá a fibra no comprimento medido e usará a câmera montada no microscópio para capturar uma imagem de alta ampliação da porção central da fibra das vistas superior e lateral.

Use essas imagens para calcular a área da seção transversal da fibra. Use o software de controle da câmara para mover a fibra para a câmara que contém a solução de pré-reativação e incube lá por três minutos. Enquanto a fibra está inativando a solução, meça sua tensão passiva, mova a fibra para a câmara que contém a solução de ativação e permita que a força isométrica máxima se desenvolva, conforme evidenciado por um platô de força que é precedido por um rápido aumento.

Em seguida, use o controlador de comprimento para aplicar uma grande redução rápida e breve na distância entre os pontos de fixação da fibra, seguida por um retorno rápido ao comprimento original para identificar a saída do transdutor de força que corresponde a zero. A força mostrada aqui são as vistas superior e lateral de uma fibra de formato elíptico a partir dessas visualizações. A área da seção transversal foi determinada medindo os diâmetros em cinco pontos ao longo do comprimento da fibra e, em seguida, calculando a média das cinco áreas resultantes.

Traços de força de fibras musculares humanas, lentas e rápidas ilustram que as fibras rápidas geram força a uma taxa mais alta do que as fibras lentas usando a técnica mostrada neste vídeo. As características típicas das fibras musculares de camundongos e ratos humanos foram medidas e são apresentadas aqui. O intervalo mostrado indica o 25º ao 75º quartis e o N é o número de fibras testadas.

Observe a grande variação na força específica entre as diferentes espécies. Os procedimentos descritos aqui resultam na avaliação da capacidade máxima de geração de força intrínseca de uma única fibra muscular esquelética, adicionando intervenções adicionais, aspectos importantes da fisiologia do músculo esquelético, incluindo, entre outros, força de comprimento, velocidade de força e força. As relações de cálcio podem ser reveladas.