Name: A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Aprenda a quantificar 8-oxo-dGuo, marcador de oxidação do DNA, em amostras biológicas usando cromatografia líquida de alta eficiência com deteção electroquímica. Este protocolo minimiza artefactos de oxidação durante a preparação.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Canadá Health Initiative Genomics Research e Desenvolvimento (GRDI) ea Estratégia Regulatória Canadense de Biotecnologia (RCSB). Os autores não têm qualquer conflito de interesses.

<ol><li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+oxidation+matters%3A+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-hydroxy-2%27+-deoxyguanosine+%288-OHdG%29%3A+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci+Health+C+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li>
<li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+DNA+damage%3A+formation%2C+measurement%2C+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Pathol+Toxicol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li>
<li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer%3A+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li>
<li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2%27-deoxyguanosine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li>
<li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li>
<li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine%3A+implications+for+mutagenicity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li>
<li>Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+%288-oxo-dGuo%29+by+PAH+o-quinones%3A+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper%28ii%29%2Fcopper%28i%29+redox+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li>
<li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+7%2C8-dihydro-8-oxo-2%27-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li>
<li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+background+level+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine%3A+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
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<li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li>
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<li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+and+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li>
<li>Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection%3A+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li>
<li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li>
<li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li>
<li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+urinary+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li>
<li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonising+measurements+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%E2%80%B2-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzol%3A+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li>
<li>Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li>
<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses ou interesses financeiros concorrentes declarados.

Apesar de 8-oxo-dGuo foi classificado como um biomarcador útil de oxidação do DNA, a sua quantificação confiável pode representar um desafio. Embora existam vários métodos publicados, há uma necessidade de uma visão abrangente, descritivo de protocolo para permitir que pesquisadores para implantar o método em seus laboratórios. Aqui apresentamos uma visão detalhada de um protocolo baseado em HPLC que irá permitir novos usuários para estabelecer um método eficaz para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo. <p class...

Espécies reativas de oxigênio (ROS), cujos níveis de estado estacionário pode aumentar durante muitas condições patológicas e metabolismo xenotoxic, contribuir para um aumento da frequência de dano oxidativo ao DNA. Entre os vários possíveis nucleobases produtos de oxidação, lesões oxidativas do ADN pode ser facilmente medida utilizando o marcador estável de 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo), que é uma das formas oxidadas de 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo é o mais abundante lesão de DNA 2 e, por conseguinte, foi estudada a maior detalhe como um biomarcador oxidação DNA, apesar da existência de múltiplos produtos de oxidação de ADN 3. Nos seres humanos, este dano pode ser reparado através de base de reparo de excisão por 8-oxoguanine glicosilase 1 (hOGG1) 4. Se reparado, 8-oxo-dGuo pode contribuir para a formação da base de mutações de substituição de par (isto é, transversões de G para T) 4. Importante, 8-oxo-dGuo é um marcador estabelecido fodano do ADN r em relação à iniciação e promoção da carcinogénese 2. Portanto, a quantificação precisa de 8-oxo-dGuo é um biomarcador útil e desejável de dano oxidativo ADN 5. Há uma confusão generalizada na literatura sobre os nomes corretos para as formas oxidativamente-danificadas do 2-desoxiguanosina e, além disso, o nome correto do composto (s) medidos rotineiramente como um biomarcador de dano oxidativo DNA 6. Os 6,8-diceto-enol e 6, 8-ceto formas tautoméricas de 8-oxo-dGuo (mostrado na Figura 1) são os dois tautómeros mais proeminentes discutidos na literatura 5,7. A forma de ácido 6,8-diceto é a forma mais proeminente a pH fisiológico de 7,4, e é o mais proeminente do produto de oxidação de DNA 7. Portanto, 8-oxo-dGuo, em vez de 8-hidroxi-dGuo é o nome mais adequado para este produto de oxidação 6. É também importante notar que a 2-desoxiguanosina (dGuo), em vez de nucleobase guanina (Gua) ou guanosina ribonucleósido (Guo), respectivamente, é detectado pela maioria dos métodos 6. Detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo preciso é um desafio devido a: i) a variabilidade na digestão da amostra de ADN, ii) oxidação acidental de dGuo a 8-oxo-dGuo que pode ocorrer durante a preparação da amostra, e iii) a necessidade eficaz para validação do método de HPLC analítico ED-8. Neste protocolo, com vista à consecução i) proporcionando condições favoráveis, para a digestão completa do ADN e ii) pela inclusão quelante de metal e soluções tratados com quelantes e um reagente especial de isolamento de DNA, enquanto iii) foi apenas parcialmente abordados pela inclusão de controlos positivos e proporcionando, assim, que o método é capaz de detectar 8-oxo-dGuo em amostras biológicas. Além disso validação está além do escopo deste artigo. No entanto, estamos confiantes de que este protocolo vai ajudar o prospectivoutilizadores determinar a extensão em que eles precisam validar formalmente o protocolo, dependendo das suas finalidades. Uma lista dos passos requeridos para a validação formal do método é ainda proporcionado. Durante o desenvolvimento e implantação de um método de detecção 8-oxo-dGuo, métodos publicados foram revistos e consolidados. Assim, este método elimina a necessidade de recolher informações a partir de várias fontes publicadas que carecem frequentemente importantes detalhes experimentais ao mesmo tempo proporcionar meios rápidos e simples de testar se o método para a detecção e quantificação de 8-oxo-dGuo foi adoptada com sucesso. Este método foi adaptado empregue com sucesso para analisar amostras de ADN a partir de células cultivadas e tecidos de murino. Este artigo de vídeo ajudará outros grupos no estabelecimento de um método eficaz para a detecção e quantificação fiável de 8-oxo-dGuo por CLER-ED.

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo padrão</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Inapropriadamente referido como "8-hidroxi-2'-desoxi Guanosina"; consulte Fig. 1 e texto para obter detalhes.</td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>De E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Quelatos metais pesados</td></tr><tr><td>Mesilato de desferoxamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo padrão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Sal de sódio</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Tipo II, de pâncreas bovino</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>O composto não se dissolveria completamente até que o pH da solução fosse ajustado para 8,0 (por exemplo com NaOH)</td></tr><tr><td>F12-K meio</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de guarda</td><td>Especialidades cromatográficas</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Protege o cólum da contaminação; também pode levar ao acúmulo de pressão</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato</td> <td>de sódio monobásicoSigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Enzima fosfodiesterase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Tipo II de Crotalus adamaneus veneno</td></tr><tr><td>Homogeneizador de teflon</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 ou 7724T-5 para 1 ou 5 mL, respectivamente</td><td>O volume (capacidade de retenção) depende da quantidade de amostra a ser processada.</td></tr><tr><td>Coluna de Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASIC com as</td><td>especialidades cromatográficas</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td> do silicone esférico</tr></tbody></table> ligado

a medição por hplc do adn oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

O stress oxidativo está associado a diversos processos fisiológicos e patológicos, assim como o metabolismo xenobiótico, levando a oxidação de biomacromoléculas, incluindo ADN. Portanto, a detecção eficiente de oxidação do DNA é importante para uma variedade de disciplinas de investigação, incluindo a medicina e toxicologia. Um biomarcador comum de ADN é danificado oxidativamente 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo; erroneamente frequentemente referido como 8-hidroxi-2&#39;-desoxiguanosina (8-OH-dGuo ou 8 -oxo-dG)). Vários protocolos de medição 8-oxo-dGuo por cromatografia líquida de alta pressão com detecção electroquímica (HPLC-ED) foram descritos. No entanto, estas foram principalmente aplicada a ADN purificado tratados com pró-oxidantes. Além disso, devido a diferenças metodológicas entre laboratórios, principalmente devido às diferenças de equipamento analítico, a adoção de métodos publicados para a detecção de 8-oxo-dGuo por HPLC-ED requer otimização cuidadosa de cada laboratório. UMAprotocolo abrangente, que descreve este processo de otimização, é inexistente. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para a detecção de 8-oxo-dGuo por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais. Ele ilustra como a preparação da amostra de ADN podem ser facilmente e rapidamente optimizada para minimizar a oxidação do ADN indesejáveis ​​que podem ocorrer durante a preparação da amostra. Este protocolo demonstra como detectar 8-oxo-dGuo em células humanas cultivadas adenocarcinoma alveolar (isto é, células A549) tratadas com o agente oxidante KBrO 3, e a partir do baço de ratinhos expostos ao hidrocarboneto aromático policíclico dibenzo (DEF, p) criseno (DBC, anteriormente conhecido como dibenzo (a, l) pireno, DalP). Em geral, este trabalho ilustra como uma metodologia de CLER-ED pode ser facilmente optimizado para a detecção de 8-oxo-dGuo em amostras biológicas.

dGuo foi observado a ter um tempo de retenção de 4,7 minutos enquanto que 8-oxo-dGuo teve um tempo de retenção de aproximadamente 6,4 minutos (Figura 2A e B). Há uma diferença de cerca de 1.000 vezes em as alturas dos picos entre os dois analitos, como pode ser visto na Figura 2C. Voltamogramas de 8-oxo-dGuo e dGuo foram obtidos por padrões que funcionam a um potencial de trabalho na gama de 0,2-1,1 V. O potencial de trabalho óptima para o 8-oxo-dGuo foi determinada com...

O objectivo do presente protocolo é a detecção do marcador de oxidação do DNA, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo) por CLER-ED, no DNA a partir de células cultivadas ou tecidos animais.

A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2&#39;-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar e quantificar o produto de oxidação do DNA, oito OXO DG, em amostras biológicas por cromatografia líquida de alta pressão com detecção eletroquímica ou H-P-L-C-E-D. Isso é realizado mediante o isolamento de uma amostra de DNA de amostras biológicas, seguido pela digestão completa do DNA de maneira que minimize a oxidação indesejável do DNA que pode ocorrer durante o preparo da amostra, por meio da inclusão de um quelante de metais e um reagente especial para isolamento de DNA. Em seguida, as condições de corrida de H-P-L-C-E-D são otimizadas e curvas padrão para oito OXO DG e dois primados dioxatina são construídas.O passo final consiste em analisar o DNA digerido em série com oito OD DG e duas deoxiguaninas primárias na HPLC, a fim de determinar as proporções de oito OD DG para duas deoxiguaninas primárias nas amostras de DNA digerido sob investigação. Em última instância, a detecção e quantificação de oito OD DG por H-P-L-C-E-D é utilizada para quantificar o grau de oxidação do DNA em amostras biológicas. Sim, a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela reúne todas as informações relevantes de diver

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.

Radicais Livres em Biologia Química: de comportamento químico para o Desenvolvimento de biomarcadores

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Este protocolo descreve um método eficiente para detectar quantitativamente o dano oxidativo do DNA em células MCF-7 pela tecnologia ELISA.

Quantificando o nível de 8-oxo-dG usando o ensaio ELISA para avaliar o dano oxidativo ao DNA em células MCF-7

Cursos de tempo para a actividade de glicosilase de 8-oxoguanina glicosilase de ADN são bifásica exibindo uma explosão de formação do produto e uma fase de estado estacionário linear. Utilizando as técnicas de têmpera de fluxo, o rebentamento e as taxas em estado estacionário pode ser medida, o que corresponde à excisão de 8-oxoguanina e libertação da glicosilase de ADN a partir do produto, respectivamente.

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

O origami de DNA é um método poderoso para fabricar objetos precisos em nanoescala, programando a auto-montagem de moléculas de DNA. Aqui descrevemos um protocolo para o dobramento de um robô bio-responsivo a partir de origami de DNA, sua purificação e coloração negativa para imagens microscópicas eletrônicas de transmissão (TEM).

Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

O protocolo descrito aqui representa um método fácil e reprodutível que emprega cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) para medir o metabolismo de purinas em células de leucemia linfocítica crônica (LLC) cultivadas em diferentes condições.

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

Um protocolo para evitar a oxidação de substratos metálicos durante a transferência de amostras de uma solução ácida inibida para um espectrômetro de fotoelétrons de raios-X é apresentado.

Determinar a composição química do inibidor de corrosão / Metal Interfaces com XPS: Minimizando Pós Immersion Oxidação

Descrevemos o processo de fabricação e testes dos termómetros fotônicos.

Fabricação e teste dos termómetros fotônicos

O presente método serve para identificar a isoforma específica inibidores da histona deacetilases (HDAC) em células HeLa pela análise de vários substratos UHPLC-MS. Este é um método livre de anticorpos desenvolvido para refletir a atividade HDAC1 e HDAC6 do vida ambiente celular, em contraste com o single-isoforma celular livre ensaios.

Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

Este protocolo descreve a síntese de partículas magnéticas e avaliação de suas propriedades de ligação a DNA através de espalhamento de luz dinâmica e eletroforético. Este método concentra-se em acompanhamento de alterações no tamanho da partícula, sua polidispersividade e potencial zeta de superfície de partícula que desempenham grande papel na ligação de materiais tais como o DNA.

DNA-magnético partícula análise por dispersão de luz dinâmica e eletroforético de vinculação

Aprenda a quantificar 8-oxo-dGuo, marcador de oxidação do DNA, em amostras biológicas usando cromatografia líquida de alta eficiência com deteção electroquímica. Este protocolo minimiza artefactos de oxidação durante a preparação.

A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais (Vídeo) | JoVE Journal

A medição por HPLC do ADN Oxidação de biomarcador, 8-oxo-7,8-di-hidro-2'-desoxiguanosina, e em células em cultura de tecidos animais

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