Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

O objetivo geral deste procedimento é determinar quantitativamente o efeito do tratamento na capacidade das células de proliferar em matrizes semissólidas, pois a capacidade aprimorada é uma marca registrada da genicidade do tumor celular usando o ensaio de ágar mole A genicidade do tumor é medida através da capacidade de uma célula de formar colônias dentro de um gel AROS semi-sólido. Como as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidamente neste ambiente, o gel AROS semi-sólido é construído primeiro fazendo uma camada inferior de 0,6% AROS. Em seguida, uma célula contendo 0,3% de camada de gel AROS é adicionada acima da camada inferior.

Neste ensaio, as células experimentais são tratadas com um inibidor da enzima peptidil, arginina, dase ou pad desenvolvido pelo Dr. Subramanian. Toda semana, uma camada de alimentação adicional é adicionada, que é um gel de 0,3% aros com ou sem tratamento. A etapa final é contar o número de colônias maiores que 70 micrômetros para análise.

Em última análise, a microscopia invertida é usada para mostrar a diferença no número de colônias entre o grupo controle e o grupo de tratamento. Olá, meu nome é Achi Huta. Sou estudante de pós-graduação no laboratório Dr.Scott Kros no Baker Institute for Animal Health.

Na Universidade de Cornell, o ensaio de formação de colônias de tigres moles pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do câncer, como avaliar a genicidade tumoral de uma ampla gama de células cancerígenas em relação à sua sensibilidade a drogas, hormônios e uma infinidade de outras condições de tratamento. Comece este procedimento preparando 3%dois hidroxietilaros em uma garrafa de vidro limpa e seca de 100 mililitros. Adicione 0,9 gramas de dois hidroxietilaros, seguidos de 30 mililitros de água destilada.

Microondas a mistura por 15 segundos e agite suavemente. Repita esta etapa até que o pó AROS se dissolva completamente. Em seguida, autoclave a solução contendo o frasco por 15 minutos.

Deixe a solução agros esfriar até a temperatura ambiente. Antes de prosseguir, use Pré-aqueça várias pipetas de cinco mililitros e 10 mililitros em uma incubadora a 37 graus Celsius para evitar que o aros solidifique na pipeta. Ao manusear parcialmente, afrouxe a tampa da garrafa e leve ao micro-ondas a solução pré-fabricada de 3% e duas hidroxietil aro por 15 segundos.

Em seguida, gire suavemente a solução e leve ao microondas por mais 15 segundos. Tenha cuidado ao agitar a solução ARO, pois a solução sobe quando exposta ao ar e pode derramar se houver gel sólido residual no micro-ondas da garrafa. Por mais alguns segundos, mantenha o frasco contendo a solução ARO em banho-maria a 45 graus Celsius durante as próximas etapas para evitar que a solução agro solidifique prematuramente.

Em seguida, transfira 12 mililitros de meio aquecido usando as pipetas pré-aquecidas para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione imediatamente três mililitros da solução 3%aros e inverta suavemente o tubo cônico para misturar o aros com a mídia. Em seguida, adicione delicadamente dois mililitros dessa mistura em cada poço de uma placa de cultura de seis poços sem formar bolhas de ar.

Incube a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por uma hora para permitir que a mistura solidifique. Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. A camada inferior agora está pronta para uso.

Um aspecto difícil deste procedimento é garantir que todas as células sejam distribuídas igualmente e que a casca de agra derretida não solidifique antes da adição a cada poço para garantir que a seltz seja misturada no meio antes de adicionar o gel agri líquido. Além disso, os tubos são pré-aquecidos com antecedência para evitar que as soluções se solidifiquem durante o manuseio. Para preparar a célula contendo a camada, primeiro a tripsina olha para as células MCF 10 DCIS e dilui-as até uma concentração celular de 40.000 células por mililitro, depois pegue oito mililitros de meio usando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.

Adicione imediatamente dois mililitros de 3%aros ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar o aros com a mídia. Evite formar bolhas. Em seguida, pegue dois mililitros das células e trate-as com dois micromolares de cloramina BB em DMSO ou DMSO sozinho como controle após o tratamento, misture as células com 0,6% de aros em uma diluição de um para um para fazer uma concentração final de um micromolar de cloramina BB.

Em seguida, pegue um mililitro da mistura de aros celular e adicione delicadamente na camada inferior da placa de cultura de seis poços. Coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidifique. Depois que a mistura solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por uma semana antes de adicionar a camada de alimentação.

Comece a preparação da camada de alimentação colocando no micro-ondas a solução pré-fabricada de 3% e dois hidroxietilaro como antes e equilibrando a garrafa de solução agrícola em banho-maria a 45 graus Celsius, misture um mililitro de solução agrícola a 3% com nove mililitros de meio quente em um tubo cônico de 50 mililitros e inverta suavemente para misturar o aros com o meio. Evite formar bolhas de ar. Depois de tratar a mistura com cloramina BB, adicione suavemente um mililitro da mistura em cada poço da placa de cultura de seis poços contendo o fundo e as camadas moles.

Em seguida, coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente em uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura solidifique. Depois que a camada de alimentação solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius. Bader, repita este procedimento de alimentação semanalmente, sobrepondo um mililitro de solução de tratamento de meio 0,3% agros na camada alimentadora existente para reabastecer as células com novos meios até que a formação de colônias seja observada.

Após duas semanas e meia de crescimento celular no ágar mole, o número de colônias em cada poço é contado. Usando um microscópio de luz para facilitar a quantificação, imprima uma grade em uma transparência e prenda a grade à placa de seis poços para ajudar a localizar onde as células estão durante a contagem. O tamanho da colônia é quantificado pelo diâmetro de cada colônia e varia predefinindo um tamanho de colônia de referência para determinar quais colônias serão pontuadas.

Por exemplo, aqui, tamanhos de colônia de 70 micrômetros ou maiores são incluídos na análise de dados. Após a contagem, sele a placa de cultura de seis poços com paraforme para evitar que os géis sequem. Armazene as amostras a quatro graus Celsius para evitar a formação de colônias e para contagem futura.

Os resultados demonstram que a cloramina BB inibe significativamente a formação de colônias derivadas de células MC 10 DCIS na presença de um inibidor de PAD. Houve redução tanto na formação de colônias quanto no tamanho das colônias quando comparado ao controle DMSO. O tamanho das colônias para células MCF 10 DCIS tratadas com cloramina BB estava predominantemente na faixa de 20 a 100 micrômetros.

Enquanto o tamanho das colônias para o controle DMSO exibiu uma faixa maior de 70 a 150 micrômetros após duas semanas e meia de crescimento, colônias maiores que 70 micrômetros foram contadas e analisadas. Houve uma média de cerca de 3.500 colônias no controle DMSO, enquanto apenas aproximadamente 2000 colônias foram vistas no grupo tratado com cloramina BB. Após duas semanas e meia de agricultura suave, isso representa uma diminuição de 44% na formação média de colônias na presença de uma cloramina BB micromolar, indicando uma inibição tumorogênica significativa das células do câncer de mama pelo inibidor da almofada.

Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente pré-aquecer todos os reagentes e equipamentos com antecedência para evitar que as soluções solidifiquem durante o manuseio, e obrigado por assistir.