Name: Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda o ensaio de formação de colónia em ágar mole para avaliar tumorigenicidade em células de cancro da mama usando o inibidor BB-Cl-amidine. Este método quantifica a proliferação celular em matrizes semi-sólidas.

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Agradecemos ao Dr. Richard Cerione, Dr. Marc Antonyak e Kelly Sullivan, da Universidade de Cornell, por fornecer consultoria técnica, e à Dra. Gerlinde Van de Walle, da Universidade de Cornell, por compartilhar seu microscópio invertido Olympus CKX41.

1. Preparação de 3% de 2-Hidroxietil agarose <ol><li> Em uma, seco de 100 ml frasco de vidro limpo, adicionar 0,9 g de 2-hidroxietilo de agarose (agarose VII), seguido por 30 ml de água destilada. </li><li> Micro-ondas a mistura durante 15 seg e agitar suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó se dissolve totalmente agarose. </li><li> Autoclavar a garrafa contendo solução durante 15 min. </li><li> Permitir que a solução de agarose a arrefecer até à temperatura ambiente antes de utilização posterior. Guardar a solução à TA. </li></ol> 2. Preparação da camada inferior: 0,6% do gel de agarose <ol><li> Pré-quente vários 5 ml e 10 ml pipetas num banho a 37 ° C para evitar a incubadora de agarose de solidificação na pipeta durante o manuseamento. </li><li> Parcialmente soltar a tampa do frasco e microondas a 3% de solução de pré-fabricados de agarose a 2-hidroxietil durante 15 seg. Em seguida, agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. CUIDADO: Tenha cuidado quando agitando o agarosolução se porque a solução sobe quando exposto ao ar e pode transbordar. </li><li> Se houver gel sólido residual no frasco, com microondas, durante mais alguns segundos. </li><li> Manter o frasco contendo a solução de agarose, num banho de 45 ° C a água durante os próximos passos para impedir que a solução de agarose de solidificação prematura. </li><li> Mídia MCF10DCIS quente em um banho de água a 37 ° C. Nota: meios MCF10DCIS consiste de DMEM / F12, 5% de soro de cavalo, 5% de penicilina estreptomicina. </li><li> Transferência de 3 ml da solução de agarose a 3% utilizando as pipetas pré-aquecido para uma estéril tubo de 50 ml. </li><li> Imediatamente adicione 12 ml de mídia MCF10DCIS quentes e inverter cuidadosamente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formam quaisquer bolhas que pode interferir com a contagem das colónias mais tarde. </li><li> Adicionar cuidadosamente 2 ml desta mistura para cada poço de uma placa de cultura de 6 cavidades, sem formar quaisquer bolhas de ar. </li><li> Incubar a placa de 6 poços de cultura horizontally sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante 1 h para permitir que a mistura de solidificar. </li><li> Após as mistura solidificar, colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 30 min. A camada inferior é agora pronto para o uso. </li></ol> 3. Preparação da Camada contendo celular: 0,3% do gel de agarose <ol><li> Tripsinizar as células e dilui-los MCF10DCIS a uma concentração celular de 4 x 10 4 / ml. </li><li> 2 ml de agarose a 3% usando pipetas pré-aquecida e transferir para um tubo de 50 mL estéril cónico. </li><li> Imediatamente adicionar 8 ml de mídia MCF10DCIS para o tubo cônico e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas. </li><li> 2 ml de células MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) e trata-se com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM). </li><li> Em uma diluição de 1: 1, misturar as células com agarose a 0,6%. </li><li> Tomar 1 ml da mistura de células-agarose e adicionar suavemente sobre a camada de fundo da cultura de 6 poços ptardios (2 x 10 4 células / mL). </li><li> Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidificar. </li><li> Após as mistura solidificar, colocar a placa num incubador a 37 ° C durante uma semana antes de se adicionar a camada de alimentação. </li></ol> 4. Preparação da Camada de alimentador: 0,3% do gel de agarose <ol><li> Microondas a 3% de 2-Hidroxietil solução de agarose pré-fabricados durante 15 seg. agite suavemente a solução e microondas por mais 15 segundos. </li><li> Equilibrar o frasco de solução de agarose, num banho de água a 45 ° C. </li><li> Aquecer os meios MCF10DCIS num banho de água a 37 ° C. </li><li> Misture 1 ml de solução de agarose 3% com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo de 50 ml e gentilmente inverter para misturar a agarose com a mídia. Evite a formação de bolhas de ar. </li><li> Tratar a mistura com BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 uM). </li><li> Suavemente adicionar 1 ml desta mistura (sem paraming bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo o fundo e as camadas macias. </li><li> Colocar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana, a 4 ° C durante pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura de solidificar. </li><li> Após a camada alimentadora solidifica, colocar a placa num incubador de 37 ° C. </li><li> Repetir este procedimento semanalmente alimentação sobrepondo 1 ml de solução de agarose / médio / tratamento de 0,3% para a camada de alimentação existente para repor as células com novos meios, até a formação de colónias é observado. Nota: Agar nas camadas moles e de alimentação é muito suave e, por conseguinte, os nutrientes adicionados a partir da camada de alimentação irá facilmente difundir-se na camada contendo as células para atingir as células. </li></ol> 5. Coleta de Dados <ol><li> Depois de 2,5 semanas de crescimento celular no agar mole, contar o número de colónias em cada poço usando um microscópio de luz. Para facilitar a quantificação, imprimir uma grade em uma transparência e anexar a grade para o6-poços para ajudar a localizar onde as células são, durante a contagem. Uma vez que o tamanho da colónia (como quantificado por o diâmetro de cada colónia) irá variar, predefinir um tamanho de colónias de referência para determinar quais as colónias serão marcados. Por exemplo, incluem dimensões das colónias de 70 mm ou maior na análise de dados. </li><li> Armazenar as amostras a 4 ° C para evitar uma maior formação de colónias e de contagem futuro. Selar a placa de cultura de 6 poços com Parafilm para evitar que os géis de secar. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A taxa de formação de colónias em agar mole varia dependendo do tipo de célula 9. Portanto, o número de células para iniciar com deve ser optimizado e ajustado em conformidade. Uma gama de partida sugerida é de entre 5 x10 2 a 1 x 10 4 culas por po numa placa de 6 poços. Além disso, o tamanho da colónia varia dependendo da taxa de crescimento de cada célula. Portanto, um pré-definido um limite para o tamanho da colónia é necessária para anotar colónias individuais para análises quantitat...

Tanto as células não transformadas (normais) quanto as transformadas podem proliferar prontamente em uma cultura de monocamada 2D. Essa forma de crescimento celular aderente é bastante diferente daquela que ocorre in vivo, onde, na ausência de estimulação mitogênica, as células geralmente não se dividem rapidamente em seu microambiente. O ensaio de ágar mole, por outro lado, é distinto dos sistemas de cultura 2D porque quantifica a tumorigenicidade medindo a capacidade de uma célula de proliferar e formar colônias em suspensão dentro de um gel de agarose semissólido1. Nesse cenário, as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidamente na ausência de ancoragem à matriz extracelular (MEC) e sofrem apoptose, um processo conhecido como anoikis. Em contraste, as células que sofreram transformação maligna perdem sua dependência de ancoragem devido à ativação de vias de sinalização, como fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)/Akt e Rac/Cdc42/PAK. Portanto, essas células são capazes de crescer e formar colônias dentro da matriz de ágar mole semi-sólido2.
Um uso comum do ensaio de ágar mole é testar se compostos específicos, como inibidores de PADI, são capazes de suprimir o crescimento do tumor in vitro. Em geral, a contagem de colônias ou tamanhos de colônias são leituras quantitativas do ensaio que podem ser comparadas entre os grupos de controle e tratamento para avaliar as diferenças na tumorigenicidade celular. Portanto, se alguém descobrir que a formação de colônias está inversamente correlacionada com o aumento da concentração do medicamento, pode-se concluir que o medicamento é um inibidor eficaz da tumorigenicidade in vitro. Por outro lado, se o medicamento não afetar a formação de colônias, o medicamento não está na dosagem apropriada ou não é um inibidor tumorigênico eficaz. Além de usar um ensaio de ágar mole para testar o efeito antitumoral de um medicamento, este ensaio também pode ser usado para investigar a relação entre um gene específico e a tumorigênese. Por exemplo, o efeito da supressão da expressão de PADI2 na tumorigenicidade pode ser abordado pelo tratamento com siRNA específico para PADI2.
PADIs são enzimas dependentes de cálcio que modificam proteínas pós-traducionalmente convertendo resíduos de arginina carregados positivamente em citrulina carregada neutramente em um processo conhecido como citrulinação ou deiminação3-5. Recentemente, descobrimos que a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) pode funcionar como um novo biomarcador de câncer de mama e que os inibidores de PADI representam terapias candidatas para câncer de mama em estágio inicial6. Por exemplo, demonstramos anteriormente que um inibidor "pan-PADI", Cl-amidina, suprime a proliferação de células de câncer de mama usando monocamadas 2D e que o inibidor suprimiu o crescimento de esferóides tumorais 3D6. Neste relatório, estendemos esses estudos e destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole, testando a eficácia de um novo inibidor de PADI, BB-CLA, na supressão do crescimento de MCF10DCIS colônias de câncer de mama7. Observamos que usamos células MCF10DCIS para este experimento porque são derivados oncogênicos de células MCF10A humanas não transformadas e porque contêm altos níveis de estado estacionário da proteínaPADI2 8. Nossa hipótese é que a atividade enzimática do PADI2 desempenha um papel fundamental na tumorigenicidade dessa linhagem celular e que a inibição da atividade do PADI2 mediada por BB-CLA suprimirá a progressão do câncer.

<table><tbody><tr>Microscópio Invertido de <td></td><td>Microscopia 1021859251 Zeiss Axiopot Carl Zeiss</td><td></td> Olympus CKX41 DMEM/F-12 Lonza BioWhittaker 12-719F HyClone Doador Soro Equino Fisher Scientific SH30074.03 Penicilina Estreptomicina Life Technologies 15140-122 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxietilagarose: Tipo VII, baixa temperatura de gelificação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Dadas as dificuldades inerentes à investigação dos mecanismos de progressão do tumor in vivo, os ensaios baseados em células, como o ensaio de formação de colônias de ágar mole (doravante denominado ensaio de ágar mole), que mede a capacidade das células de proliferar em matrizes semissólidas, continuam sendo uma marca registrada da pesquisa do câncer. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos ensaios convencionais de monocamada 2D ou cultura de células esferóides 3D é o mimetismo próximo do ambiente celular 3D ao observado in vivo. É importante ressaltar que o ensaio de ágar mole também fornece uma ferramenta ideal para testar rigorosamente os efeitos de novos compostos ou condições de tratamento na proliferação e migração celular. Além disso, este ensaio permite a avaliação quantitativa do potencial de transformação celular no contexto de perturbações genéticas. Recentemente, identificamos a peptidilarginina deiminase 2 (PADI2) como um potencial biomarcador de câncer de mama e alvo terapêutico. Aqui destacamos a utilidade do ensaio de ágar mole para estudos anticâncer pré-clínicos, testando os efeitos do inibidor de PADI, BB-Cl-amidina (BB-CLA), na tumorigenicidade de células de carcinoma ductal humano in situ (MCF10DCIS).

O ensaio de formação de colónias em ágar mole pode ser utilizado para uma larga gama de aplicações que documentam a tumorigenicidade das células cancerosas. Uma importante vantagem desta técnica é que a matriz semi-sólida favorece selectivamente o crescimento de células que podem proliferar de uma forma independente de ancoragem. Esta característica é exibido principalmente por células cancerosas, mas não por células normais. Utilizamos esta técnica principalmente para testar a eficácia de inibição do crescimento do tum...

Aqui, documentamos o uso do ensaio de formação de colônias de ágar mole para testar os efeitos de um inibidor da enzima peptidilarginina deiminase (PADI), BB-Cl-amidina, na tumorigenicidade do câncer de mama in vitro.

Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar quantitativamente o efeito do tratamento sobre a capacidade das células de proliferar em matrizes semissólidas, pois a capacidade aumentada é uma característica da tumorigenicidade celular. Na análise em ágar mole, a tumorigenicidade é medida pela capacidade da célula formar colônias dentro de um gel semissólido de AROS. Como as células não transformadas são incapazes de se propagar rapidamente neste ambiente, o gel semissólido de AROS é montado primeiramente com uma camada inferior de 0,6% de AROS. Em seguida, adiciona-se uma camada de gel contendo células com 0,3% de AROS sobre a camada inferior.Neste ensaio, as células experimentais são tratadas com um inibidor da enzima peptidil, arginina, dase ou pad desenvolvido pelo Dr. Subramanian. Semanalmente, é adicionada uma camada adicional de alimentação, que consiste em um gel de aros a 0,3% com ou sem tratamento. O passo final é contar o número de colônias maiores que 70 micrômetros para análise.No final, a microscopia invertida é utilizada para mostrar a diferença no número de colônias entre o grupo controle e o grupo tratado. Olá, meu nome é Achi Huta. Sou estudante de pós-graduação no laboratório do Dr. Scott Kro no Instituto Baker para Saúde Animal.Na Universidade Cornell, o ensaio de formação de colônias em camada semissólida pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da biologia do câncer, como a avaliação da tumorigenicidade de uma ampla gama de células cancerígenas em relação à sua sensibilidade a medicamentos, hormônios e múltiplas outras condições de tratamento. Inicie este procedimento preparando 3% de dois hidroxietil aros em um frasco de vidro limpo e seco de 100 mililitros. Adicione 0,9 gramas de dois hidroxietil aros, seguido por 30 mililitros de água destilada.Coloque a mistura no micro-ondas por 15 segundos e agite suavemente. Repita este passo até que o pó de AROS se dissolva completamente. Em seguida, esterilize em autoclave o frasco contendo a solução por 15 minutos.Deixe a solução de agros esfriar até a temperatura ambiente. Antes de continuar, pré-aqueça várias pipetas de cinco mililitros e 10 mililitros em um incubador a 37 graus Celsius para evitar que o aros solidifique dentro da pipeta. Ao manipular parcialmente, afrouxe a tampa do frasco e aqueça a solução pré-pronta de aro a 3% em micro-ondas por 15 segundos.Em seguida, agite suavemente a solução e aqueça-a no micro-ondas por mais 15 segundos. Tenha cuidado ao agitar a solução de ARO, pois a solução sobe quando exposta ao ar e pode derramar se houver gel residual sólido no frasco durante o aquecimento no micro-ondas. Por mais alguns segundos, mantenha o frasco contendo a solução de ARO em banho-maria a 45 graus Celsius durante os próximos passos para evitar que a solução de agro se solidifique prematuramente.Em seguida, transfira 12 mililitros do meio aquecido utilizando pipetas pré-aquecidas para um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Adicione imediatamente três mililitros da solução de 3% de aros e inverta suavemente o tubo cônico para misturar o aros com o meio. Em seguida, adicione cuidadosamente dois mililitros dessa mistura em cada poço de uma placa de cultura de seis poços, sem formar bolhas de ar.Incube a placa de cultura de seis poços horizontalmente sobre uma superfície plana a quatro graus Celsius por uma hora para permitir que a mistura solidifique. Após a solidificação da mistura, coloque a placa em um incubador a 37 graus Celsius por 30 minutos. A camada inferior está agora pronta para uso.Um aspecto difícil deste procedimento é garantir que todas as células sejam distribuídas uniformemente e que a camada de ágar derretida não solidifique antes da adição em cada poço, assegurando que as seltz sejam misturadas no meio antes da adição do gel de ágar líquido. Além disso, as pipetas são pré-aquecidas previamente para evitar que as soluções solidifiquem durante o manuseio. Para preparar a camada contendo as células, primeiro trypsinize as células MCF 10 DCIS e dilua-as para uma concentração celular de 40.000 células por mililitro; em seguida, retire oito mililitros do meio utilizando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.Adicione imediatamente dois mililitros de aros 3% ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar o aros com o meio. Evite formar bolhas. Em seguida, retire dois mililitros das células e trate-as com cloramina BB de dois micromolares em DMSO ou apenas DMSO como controle; após o tratamento, misture as células com o aros 0,6% em uma diluição um para um, obtendo uma concentração final de um micromolar de cloramina BB.Em seguida, retire um mililitro da mistura de células aros e adicione suavemente sobre a camada inferior da placa de cultura de seis poços. Coloque a placa de cultura de seis poços na posição horizontal sobre uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior solidifique. Após a solidificação da mistura, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por uma semana antes de adicionar a camada de alimentação.Inicie a preparação da camada de alimentação aquecendo no micro-ondas a solução pré-pronta de 3% de two hydroxyethyl aro, como anteriormente, e equilibre o frasco da solução de agro em banho-maria a 45 graus Celsius. Misture um mililitro da solução de 3% de agro com nove mililitros de meio aquecido em um tubo cônico de 50 mililitros e inverta suavemente para misturar os aros com o meio. Evite formar bolhas de ar. Após tratar a mistura com cloramina BB, adicione cuidadosamente um mililitro da mistura em cada poço de uma placa de cultura de seis poços contendo as camadas inferior e macia.Em seguida, coloque a placa de cultura de seis poços horizontalmente sobre uma superfície plana a quatro graus Celsius por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura solidifique. Após a camada de alimentação solidificar, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius. Bader, repita este procedimento de alimentação semanalmente, adicionando um mililitro de solução tratada com meio de agros 0,3% sobre a camada de alimentação existente para reabastecer as células com novo meio até que a formação de colônias seja observada.Após duas semanas e meia de crescimento celular no ágar macio, o número de colônias em cada poço é contado. Para facilitar a quantificação, utilize um microscópio óptico, imprima uma grade em uma transparência e fixe a grade na placa de seis poços para ajudar a localizar as células durante a contagem. O tamanho das colônias é quantificado pelo diâmetro de cada colônia e variará; defina previamente um tamanho de referência para determinar quais colônias serão pontuadas.Por exemplo, aqui, tamanhos de colônia de 70 micrômetros ou maiores são incluídos na análise de dados. Após a contagem, feche a placa de cultura de seis poços com parafilm para evitar que os géis sequem. Armazene as amostras a quatro graus Celsius para impedir a formação adicional de colônias e para contagem futura.Os resultados demonstram que a cloramina BB inibe significativamente a formação de colônias derivadas de células MC 10 DCIS na presença de um inibidor de adesão. Houve uma redução tanto na formação de colônias quanto no tamanho das colônias em comparação com o controle de DMSO. O tamanho das colônias de células MCF 10 DCIS tratadas com cloramina BB foi predominantemente na faixa de 20 a 100 micrômetros.Embora o tamanho das colônias no controle com DMSO tenha exibido uma faixa maior de 70 a 150 micrômetros após duas semanas e meia de crescimento, foram contadas e analisadas apenas as colônias maiores que 70 micrômetros. Houve uma média de cerca de 3.500 colônias no controle com DMSO, enquanto aproximadamente 2.000 colônias foram observadas no grupo tratado com cloramina BB. Após duas semanas e meia de cultura em camada semissólida, isso representa uma redução de 44% na formação média de colônias na presença de um micromolar de cloramina BB, indicando uma inibição significativa da tumorigenicidade de células de câncer de mama pelo inibidor de PAD.Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente pré-aquecer todos os reagentes e equipamentos previamente para evitar que as soluções solidifiquem durante o manuseio, e obrigado por assistir.

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Medicine

Medicina

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Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.

Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência

O ensaio de invasão celular in vitro é utilizado para medir o potencial de metástase oncológica, quantificando o potencial celular para invasão e migração usando inserções de cultura celular contendo matriz proteica. As células são desafiadas a migrar através da matriz proteica e uma membrana porosa, em direção a um quimioatractivo, e depois quantificada por microscopia de luz.

O uso de células tumorais do rato mamário em um ensaio de invasão in vitro como medida de comportamento de células oncogênicas

Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Esse protocolo experimental oferece um método estável, econômico e eficiente que combina knockdown de lncRNA com ensaios formadores de colônias para quantificar o efeito do lncRNA na proliferação celular do osteossarcoma.

Ensaio de Formação de Colônias Detectando a Capacidade Proliferativa de Células de Osteossarcoma por Knockdown de RNAs LncRNA

Aprenda o ensaio de formação de colónia em ágar mole para avaliar tumorigenicidade em células de cancro da mama usando o inibidor BB-Cl-amidine. Este método quantifica a proliferação celular em matrizes semi-sólidas.

Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal

Utilização do ensaio de formação de colónia agar mole para identificar inibidores de tumorigenicidade em células de cancro da mama

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