Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a capacidade de escalada de moscas do tipo selvagem e moscas mutantes para os genes envolvidos na locomoção. Isso é feito primeiro transferindo as moscas para um cilindro graduado de vidro. O segundo passo é deslocar as moscas para o fundo do cilindro batendo levemente no cilindro no acolchoamento de espuma.

As moscas que cruzam a linha alvo são gravadas em seguida com uma câmara de vídeo durante dois minutos. A etapa final é analisar os vídeos e traçar o número de moscas acima da linha alvo a cada 10 segundos. Em última análise, o ensaio de escalada é usado para identificar defeitos na capacidade de escalada de linhagens mutantes de moscas-das-frutas.

A principal vantagem desta técnica, ou das técnicas existentes, como o método selvagem, é que ela tem a capacidade de detectar pequenas diferenças na capacidade de escalada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos distúrbios neurodegenerativos, como o papel de genes específicos na paraplegia espástica hereditária no comprometimento progressivo da marcha. A implicação desta técnica tende ao desenvolvimento da terapia.

IP para distúrbios neurológicos porque fornece um ensaio quantitativo simples para testar a resposta a medicamentos e mutantes para genes neurodegenerativos candidatos Comece anestesiando 20 moscas usando dióxido de carbono e coloque todas as moscas em um frasco de coleta de 25 milímetros por 95 milímetros que contém alimentos. Em seguida, guarde o frasco para injetáveis contendo as moscas horizontalmente em uma bandeja de papelão para evitar prendê-las em qualquer líquido que possa se acumular no fundo do frasco. Coloque as moscas em uma incubadora por pelo menos 21 horas sob um ciclo claro escuro de 12 horas na manhã seguinte, configure o ensaio de escalada transferindo as moscas do frasco para um cilindro graduado de vidro de 250 mililitros e sele a parte superior com filme de cera para evitar a fuga de moscas.

Realize o experimento com luz ambiente a 22 graus Celsius e 40% de umidade. Sempre realize experimentos na mesma hora do dia para evitar confusão com os ciclos de sono. Além disso, marque a localização do cilindro na bancada para mantê-lo constante todos os dias.

Conte o número de moscas mortas no fundo do cilindro e nos frascos de comida, registre esse número como a mortalidade. Em seguida, configure a câmera de vídeo em um tripé. Foque a câmera na linha de 190 mililitros do cilindro graduado de 250 mililitros muito levemente.

Bata o cilindro de cinco a 10 vezes contra uma almofada de espuma de célula fechada com força suficiente para deslocar as moscas para a superfície inferior interna. Em seguida, use a outra mão para pressionar gravar na câmera. Em seguida, toque no cilindro seis vezes em um padrão não rítmico distinto enquanto a câmera está gravando.

Conduza cada teste por dois minutos a partir do momento em que as moscas são tocadas pela última vez. Por fim, descarte as moscas em etanol 95%. Quando o teste estiver concluído, repita este ensaio de escalada 10 vezes usando 20 moscas frescas de cada vez, a fim de detectar pequenas diferenças na locomoção entre os grupos.

Lave os cilindros na máquina de lavar louça e seque durante a noite para serem reutilizados assim que o experimento for concluído para analisar o desempenho da mosca, comece assistindo a vídeos de cada registro de teste de mosca. O número total de moscas que passam pela linha alvo a cada 10 segundos. Se uma mosca descer ou cair, registre essa mosca como menos um e conte a próxima mosca a cruzar a linha alvo como o mesmo número que a mosca que desceu ou caiu.

Por exemplo, se a 15ª mosca cair abaixo da linha alvo, a próxima mosca a cruzar a linha é considerada a 15ª mosca e não a 16ª. Em seguida, subtraia a mortalidade do número total de moscas para obter o número de moscas que permanecem na parcela de teste. A porcentagem de moscas acima da linha alvo em cada ponto de tempo ao trabalhar com mutações graves, diferentes graus de defeito de escalada podem ser vistos usando diferentes ensaios de escalada.

Aqui, o número de moscas de oito dias que subiram ao topo de um frasco de comida vazio após 18 segundos foi registrado, não mostrando nenhuma diferença significativa no comportamento de escalada entre os dois grupos. Por outro lado, usando o ensaio de escalada deste protocolo, as moscas mutantes Bastin 17 dash seven over TM três mostram um déficit de desempenho em comparação com os controles. Como muitos distúrbios locomotores são progressivos, é importante observar a evolução das moscas ao longo do tempo.

Aos dois dias de idade, há uma diferença significativa no número de moscas que sobem acima da linha do alvo. Em comparação com os controles. Esse desempenho de escalada continua a diminuir à medida que as moscas mutantes envelhecem de dois a dias.

Uma vez dominado, esse experimento e análise podem ser concluídos em três horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como quantificar defeitos locomotores em modelos dola mutantes para distúrbios neurológicos.