Name: Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de geotaxia negativa em Drosophila melanogaster para quantificar defeitos de escalada em modelos de doenças neurodegenerativas. Este método sensível auxilia na triagem de alvos genéticos e farmacológicos.

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Este trabalho é apoiado por uma bolsa de equipe do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) para o Dr. Bolduc (co-PI) e o Dr. Guy Rouleau (PI). Gostaríamos de agradecer à Dra. Oksana Suchowersky, Dra. Kathryn Todd, aos membros do clube de moscas da Universidade de Alberta e ao Dr. Clayton Dickson pela ajuda no desenvolvimento do método e na análise estatística.

Pesquisa sobre Drosophila melanogaster estava em conformidade com a Universidade de diretrizes de pesquisa de Alberta. 1. Fly Colecção <ol><li> Coletar 20 moscas usando CO 2 (g) anestesiados e coloque em um frasco de recolha 25 milímetros x 95 milímetros contendo alimentos. </li><li> Frascos contendo loja moscas horizontalmente para evitar a captura de moscas em quaisquer líquidos que podem se acumular no fundo do frasco. </li><li> Incubar moscas durante pelo menos 21 horas a 22 ° C em 45% de humidade num incubador durante aproximadamente durante 15 h. Defina a incubadora com uma luz de 12 horas: ciclo escuro. </li></ol> 2. Escalada Assay <ol><li> Na manhã seguinte, a transferência de 20 moscas a partir de um único frasco num copo de 250 ml cilindro graduado. Marque a posição do cilindro para mantê-lo todos os dias constante. Usar um cilindro de vidro por genótipo para evitar a contaminação cruzada entre os genótipos. Lavar-se ao fim de cada experiência e rolitar-los entre os genótipos. <ol><li> Conduzir as experiências em luz ambiente (ou luz vermelha se houver um defeito potencial na visão) a temperatura e humidade de 22 ° C e 40% respectivamente. Para evitar circadiano confundem ritmo, sempre realizar experimentos na mesma hora do dia. </li></ol></li><li> Selar o topo do cilindro com uma película de barreira (filme de cera) para impedir a fuga de quaisquer moscas (Figura 2). </li><li> Configure a câmera de vídeo em um tripé. Câmera com foco na linha 190 ml dos 250 ml cilindro graduado (17.5 cm). </li><li> Contar o número de moscas mortas na parte inferior do cilindro e nos frascos de alimentos. Grave este número como a mortalidade. </li><li> Muito bata levemente contra o cilindro de uma almofada de espuma de células fechadas, repetidamente, com força suficiente para deslocar as moscas para a superfície de fundo interna. Toque 5-10 vezes enquanto com a outra mão para pressionar registro na câmera. </li><li> Pressione o botão &quot;Record&quot; na câmara. </li><li> Comece o vidEO gravação e câmera toque no cilindro de seis vezes em um padrão não-rítmica distinta. </li><li> Realizar cada julgamento por 2 min do tempo as moscas estão último aproveitado e registrar o número de moscas que atravessam a altura de 17,5 centímetros (190 ml) em cada ponto de tempo escolhido (quantificar a cada 10 segundos). Nota: A marcação no cilindro ml irá variar de um modelo para outro cilindro, dependendo do diâmetro. Para evitar erros, medir a altura de cada cilindro usado. </li><li> Uma vez que o julgamento terminou, dispor de moscas em 95% de etanol. </li><li> Repita os passos 2.1 a 2.9 até que todos os replicados foram testados com moscas fresco de cada vez. Nota: Embora cinco repetições pode ser suficiente, com uma mutação ter um forte efeito na locomoção, 10 réplicas biológicas de 20 moscas, moscas (200) é recomendado para detectar diferenças menores. </li><li> Após a conclusão da experiência, os cilindros de lavagem na máquina de lavar de laboratório e seca O / N para ser re-utilizado. </li></ol> 3. Análise <ol><li> Analyvídeos ze de cada voar julgamento. Cada 10 segundos, anotar o número total de moscas que passam a linha de meta. <ol><li> Se uma mosca sobe de volta para baixo ou cai, registro que voam como -1 e contar a próxima mosca para cruzar a linha de meta como o mesmo número que a mosca que subiu de volta para baixo ou caiu. Por exemplo, se o 15º mosca cai abaixo da linha de meta, a próxima mosca para cruzar a linha (16 th voar) é considerado o 15º mosca e não o 16º. </li></ol></li><li> Subtrair a mortalidade a partir do número total de moscas (20) para se obter o número de moscas que permanecem no ensaio. Em cada ponto de tempo, obter a fracção de moscas acima da linha de destino. </li><li> Traçar cada porcentagem em cada ponto de tempo (ver Figura 3). </li><li> Analisar o desempenho no ponto de dados 120 segundos e realizar teste t de Student quando dois grupos se encontrem presentes ou análise de variância e um pós-teste para comparações múltiplas (com modificação Bonferroni para planejado e Tukey para co não planejadamparisons). O teste de Kolmogorov-Smirnov testa 17 também é realizada para verificar a normalidade e variância igual, mas também para comparar as distribuições do grupo mutante para o controlo. </li><li> Para apresentar os dados sobre o envelhecimento, plotar a porcentagem de moscas subir a 120 segundos com moscas de diferentes idades (2 dias, uma semana, duas semanas) para ver se há um déficit progressivo (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
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<li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+epilepsy%3A+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li>
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<li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer%27s+disease+model%3A+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799(2011).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li>
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<li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429(2004).</li>
<li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Drosophila já provou ser um excelente modelo de doença 14 e outras condições neurodegenerativas 1,2 de Parkinson. Além das ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila, o seu genoma é altamente conservada em genes envolvidos em desordens neurológicas 19. O advento da largura métodos de rastreio genético do genoma (incluindo exome sequenciamento completo) é provável que continue a fornecer uma lista maior de genes candidatos associados com distúrbios do movimento huma...

Doenças neurodegenerativas tais como a doença devastadora de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, e paraplegia espástica hereditária são cada vez mais reconhecidas. Infelizmente, a maioria desses distúrbios neurodegenerativos são ainda sem tratamentos. O uso clínico generalizado de testes genéticos, imparciais de todo o genoma, tais como sequenciação de toda exome levou a um aumento do número de genes implicados em distúrbios locomotiva humanos. Apesar deste progresso, a progressão patológica desde cedo a fases tardias, permanece indefinida nesses transtornos. Drosophila fornece um com as ferramentas genéticas para estudar exigência gene de uma forma temporal e espacial controlada. Além disso, Drosophila tem se mostrado útil na triagem de drogas para doenças neurológicas como Parkinson 1, a doença de Alzheimer 2, deficiência mental e epilepsia 3,4 5,6 entre outros. O nosso objectivo foi desenvolver um custo eficaze ensaio de confiança que permita a análise de alto rendimento que ainda seria suficientemente sensível para detectar pequenas mudanças no desempenho do motor. Existem vários ensaios utilizados para quantificar os efeitos da mutação genética e / ou condições ambientais sobre o comportamento de escalada de Drosophila. A maioria dos ensaios capitalizar a tendência natural das moscas para escalar, conhecidos como geotaxis negativos, ou o ensaio de escalada. Benzer 7 em 1967 sugeriram que o aparelho em contracorrente utilizada para o estudo de fototaxia também poderia ser usado para estudar gravitaxis. Desde então, Ganetsky 8 e muitos outros 9 -12 construíram no ensaio inicial. O princípio é o de colocar um número conhecido de moscas em um frasco e o frasco toque fortemente contra uma superfície dura, fazendo com que as moscas a cair para o fundo do frasco. Como se trata de um comportamento inato, as moscas vai tentar subir para a parte superior do frasco, em oposição à gravidade. Este ensaio é quantitativa e measures quantas moscas subiram passado um marcador no frasco durante um período de tempo estipulado. Medição da velocidade, em vez do número total de moscas escalada tornou-se um parâmetro fiável e mostrado defeitos nos casos em que o número de parâmetros de moscas não foi significativa 13. O ensaio de escalada provou ser útil no estudo de muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson 14. No entanto, observou-se que os defeitos locomotiva pode não ser detectável no momento em que a neurodegeneração já é visto em estudos patológicos 14. Assim, a utilização do ensaio tradicional pode limitar a capacidade para estudar os estágios iniciais da patogénese da doença. O aparecimento de defeitos locomotiva durante fases posteriores da patologia pode refletir uma doença cuja progressão é muito avançado para resgate completo. Isto levanta um problema potencial com a sensibilidade do ensaio escalada tradicional. A incapacidade potencial do tradicional subir ensaio para detectar defeitos leves locomotiva pode ser atribuído à altura a que as moscas são obrigados a subir. Os tradicionais 15,16 ensaio mede o número de moscas para escalar com sucesso através de uma altura de 2 a 5 cm em 10 a 20 seg.

<table><tbody><tr>Estoques <td></td><td></td><td>de Drosophila</td><td>Os estoques são selecionados dependendo dos experimentos. A temperatura e a umidade na sala e na incubadora devem ser controladas e consistentes para evitar que as moscas fiquem muito estáticas ou muito molhadas.</td></tr><tr><td>Câmera</td><td></td><td></td><td>de vídeo Qualquer filmadora digital serve. Certifique-se de que eles possam focar em objetos próximos.</td></tr><tr><td>Cilindro graduado</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Diferentes modelos de cilindro graduado podem ter diâmetros diferentes. Portanto, é importante medir a altura.</td></tr><tr><td>Computador</td><td></td><td></td><td>Qualquer modelo serve. Usamos o computador para monitorar a escalada das moscas e registrar o número de moscas em cada ponto de tempo.</td></tr></tbody></table>

análise quantitativa de defeitos de escalada em um modelo de drosophila de doenças neurodegenerativas

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotiva defeitos resultantes de doenças neurodegenerativas pode ser um início dos sintomas da doença de tarde, após anos de degeneração subclínica, e, assim, estratégias atuais de tratamento terapêutico não são curativos. Através da utilização de sequenciação exome conjunto, um número cada vez maior de genes foram identificados a desempenhar um papel na locomoção humana. Apesar de identificar estes genes, não se sabe como esses genes são cruciais para o funcionamento normal locomotiva. Por conseguinte, um ensaio de confiança, que utiliza organismos modelo para elucidar o papel destes genes, a fim de identificar novos alvos de interesse terapêutico, é necessário mais do que nunca. Nós preparámos uma versão sensibilizado do ensaio geotaxis negativos que permite a detecção de defeitos leves anterior e tem a capacidade de avaliar esses defeitos ao longo do tempo. O ensaio é realizado em um cilindro de vidro graduado, que é selada com uma película de barreira de cera. Ao aumentar a distância patamar de ser escalado para 17,5 cm e aumentando a duração da experiência para 2 min temos observado uma maior sensibilidade na detecção de disfunções de mobilidade suaves. O ensaio é rentável e não requer a formação extensa para obter resultados altamente reprodutíveis. Isso o torna uma excelente técnica para o rastreio de drogas candidatas em mutantes de Drosophila com defeitos de locomoção.

Escalada é um comportamento forte e reprodutível. Na verdade, um dia velhos moscas do tipo selvagem alcançar o desempenho escalada distância do alvo rapidamente (25-30 seg). Moscas mutantes apresentam uma série de desempenho de leve (ou retardada) para completar a incapacidade de subir ao alvo. Nós ilustramos esta aqui com dois alelos mutantes diferentes. O primeiro é um alelo grave do Spastin gene causada por uma deleção completa do gene Spastin spas (5,75) 18. Nesta linha (5,75 spas com TM6b) um ...

Apresentamos um ensaio de geotaxia negativa otimizado, barato e confiável em Drosophila melanogaster como modelo para doenças neurodegenerativas. Sendo mais sensível a defeitos locomotores leves, este ensaio ajudará a rastrear possíveis interações genéticas e alvos de drogas.

Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a capacidade de escalada de moscas selvagens e de moscas mutantes para os genes envolvidos na locomoção. Isso é realizado primeiramente transferindo as moscas para um cilindro graduado de vidro. O segundo passo é deslocar as moscas para a base do cilindro, batendo levemente o cilindro sobre uma espuma de proteção.A seguir, as moscas que cruzam a linha-alvo são registradas usando uma câmera de vídeo durante um período de dois minutos. O passo final é analisar os vídeos e plotar o número de moscas acima da linha-alvo a cada 10 segundos. Em última instância, o ensaio de subida é utilizado para identificar defeitos na capacidade de subida de linhagens mutantes de moscas-das-frutas.A principal vantagem dessa técnica, ou de técnicas existentes, como o método selvagem, é a capacidade de detectar pequenas diferenças na habilidade de escalada. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos distúrbios neurodegenerativos, como o papel de genes específicos na paraplegia espástica hereditária sobre o comprometimento progressivo da marcha. A implicação dessa técnica tende a favorecer o desenvolvimento de terapias.IP para distúrbios neurológicos porque fornece um ensaio quantitativo simples para testar a resposta a medicamentos e mutantes de genes candidatos a doenças neurodegenerativas. Comece anestesiando 20 moscas usando dióxido de carbono e coloque todas as moscas em um frasco de coleta de 25 milímetros por 95 milímetros que contenha alimento. Em seguida, armazene o frasco contendo as moscas na posição horizontal em uma bandeja de papelão para evitar que fiquem presas em qualquer líquido que possa se acumular no fundo do frasco. Coloque as moscas em uma incubadora por pelo menos 21 horas sob um ciclo claro-escuro de 12 horas. Na manhã seguinte, monte o ensaio de escalada transferindo as moscas do frasco para um cilindro graduado de vidro de 250 mililitros e feche a parte superior com filme de cera para impedir a fuga de qualquer mosca.Realize o experimento em luz ambiente a 22 graus Celsius e 40% de umidade. Sempre realize os experimentos no mesmo horário do dia para evitar interferências com os ciclos de sono. Além disso, marque a posição do cilindro na bancada para mantê-la constante todos os dias.Conte o número de moscas mortas no fundo do cilindro e nos frascos de alimento, registrando esse número como mortalidade. Em seguida, monte a câmera de vídeo em um tripé. Foque a câmera na marca de 190 mililitros do cilindro graduado de 250 mililitros, com muito cuidado.Toque no cilindro de cinco a dez vezes contra uma almofada de espuma de célula fechada com força suficiente para deslocar as moscas até a superfície interna inferior. Em seguida, use a outra mão para pressionar a gravação na câmera. Depois, toque no cilindro seis vezes em um padrão distinto e não rítmico enquanto a câmera estiver gravando.Realize cada ensaio por dois minutos a partir do momento em que as moscas são batidas pela última vez. Por fim, descarte as moscas em etanol 95%. Após a conclusão do ensaio, repita este teste de escalada 10 vezes, utilizando 20 moscas frescas a cada vez, a fim de detectar pequenas diferenças na locomoção entre os grupos.Lave os cilindros em uma lava-louças e seque-os durante a noite para reutilizá-los após a conclusão do experimento. Para analisar o desempenho das moscas, comece assistindo aos vídeos de cada registro de tentativa das moscas. O número total de moscas que ultrapassam a linha-alvo a cada 10 segundos. Se uma mosca descer novamente ou cair, registre essa mosca como menos um e conte a próxima mosca que cruzar a linha-alvo como o mesmo número da mosca que desceu ou caiu.Por exemplo, se a 15ª mosca cair abaixo da linha de referência, a próxima mosca que cruzar a linha será considerada a 15ª mosca e não a 16ª. Em seguida, subtraia a mortalidade do número total de moscas para obter o número de moscas que permanecem na parcela experimental. A porcentagem de moscas acima da linha de referência em cada ponto temporal, ao trabalhar com mutações graves, pode revelar diferentes graus de defeito de escalada ao utilizar diferentes ensaios de escalada.Aqui, registrou-se o número de moscas com oito dias de idade que escalaram até o topo de um frasco vazio de alimento após 18 segundos, mostrando nenhuma diferença significativa no comportamento de escalada entre os dois grupos. Por outro lado, ao utilizar o ensaio de escalada deste protocolo, as moscas mutantes Bastin 17 traço sete sobre TM três apresentam um déficit no desempenho em comparação com os controles. Como muitos distúrbios locomotores são progressivos, é importante observar a evolução das moscas ao longo do tempo.Em dois dias de vida, há uma diferença significativa no número de moscas que sobem acima da linha-alvo, em comparação com os controles. Esse desempenho de escalada continua a diminuir à medida que as moscas mutantes envelhecem de dois dias em diante.Uma vez dominado, este experimento e análise podem ser concluídos em três horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar defeitos locomotores em modelos mutantes de dola para distúrbios neurológicos.

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Drosophila é amplamente usado como um sistema modelo para estudar a neurodegeneração. Este protocolo descreve um método pelo qual a degeneração, como determinado pela formação de vacúolo no cérebro, podem ser quantificados. Ela também minimiza os efeitos devido ao procedimento experimental por meio de processamento e controlo de moscas e de seccionamento experimentais como uma amostra.

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Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

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O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.

Uma técnica simples para avaliar a atividade locomotora em Drosophila

Este protocolo apresenta um ensaio para modelagem da constipação intestinal em um modelo de doença de Parkinson baseado em alfa-sinucleína .

Medindo a constipação em um modelo de Drosophila da doença de Parkinson

O protocolo apresenta um método de alto rendimento e custo-benefício para avaliar a neurotoxicidade na mosca-da-fruta por meio da quantificação da disfunção locomotora como alternativa aos modelos tradicionais de mamíferos. Tem como objetivo avaliar os efeitos neurotóxicos de compostos farmacêuticos, agentes ambientais ou modificações genéticas usando um modelo sensível, reprodutível e eticamente favorável.

Análise comportamental da disfunção locomotora em Drosophila melanogaster como leitura de neurotoxicidade

Aprenda a realizar ensaio de geotaxia negativa em Drosophila melanogaster para quantificar defeitos de escalada em modelos de doenças neurodegenerativas. Este método sensível auxilia na triagem de alvos genéticos e farmacológicos.

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