Name: Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a isolar macrófagos peritoneais murinos para análise de expressão gênica após estimulação de receptores Toll-like. Este protocolo utiliza meio de tioglicolato para aumentar o rendimento celular e citometria de fluxo para caracterização.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia (NSERC, conceder nenhuma 298.515-2011). AL é o destinatário de um Ph.D. bolsa de estudos das ciências naturais e Council of Canada (NSERC) Pesquisa de Engenharia, e MS foi apoiada de uma concessão dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR, conceder nenhuma. MOP123246).

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações após a aprovação pelo Comitê Animal Care Institucional do Centro de recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM). 1. Isolamento, identificação e Cultura de Murino macrófagos Peritoneal <ol><li> Prepare meio de tioglicolato de 3,8% de cerveja. Para fazê-lo, suspensão 38 g de tioglicolato em 1000 ml de água destilada. Traga solução para ferver para dissolver o meio completamente. Esterilizar por autoclavagem a 121 ° C durante 15 min. Armazenar até 3 meses no escuro, à temperatura ambiente 18. NOTA: Descarte se desenvolve turbidez o que indica uma contaminação bacteriana. A solução pode ser mantida por até um ano no escuro, se manteve estéril. </li><li> Usando seringas de 1 ml ligados a 23 agulhas G, injectar 1 ml de 3,8% de tioglicolato Brewer para dentro da cavidade peritoneal de cada mouse e esperar por 3 dias. Use nova seringa e agulha para cada rato. </li><li> Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg) e a eutanásia ratos por deslocamento cervical. Confirme anestesia adequada, verificando a freqüência respiratória. Normalmente respirações rápidas indicam que o mouse não está profundamente anestesiados. </li><li> Lavar o abdómen de cada rato com etanol a 70%. Usando uma tesoura, realizar uma incisão lateral ao longo da linha média inferior do peritônio. </li><li> Usando uma pinça, puxar para trás a pele abdominal para expor a pele peritoneal transparente. Usando 5 ml seringas unidas a 20 agulhas G, injectar 5 ml de DPBS frio para dentro da cavidade peritoneal de cada rato. </li><li> Realizar uma massagem suave na cavidade peritoneal e, em seguida, aspirar o fluido com cuidado, sem perfurar qualquer órgão. Remover a agulha e dispensar o fluido peritoneal em tubos de 50 ml de centrífuga cónicos. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 400 xg numa centrifugadora refrigerada.As células devem ficar frio durante todo o procedimento. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio RPMI 1640. </li><li> Usando um hemocitómetro, contagem de células e ajustar a densidade celular para 1 x 10 6 células / ml. </li><li> Caracterizar o fenótipo de células isoladas por citometria de fluxo utilizando 1 x 10 6 culas por rato e antibodie contra F4 / 80 (um antigénio de superfície expresso em macrófagos). </li></ol> 2. tratamentos com células- <ol><li> Directamente, após isolamento, adicionar 1 x 10 6 células em cada poço. Deixar os macrófagos peritoneais murinos para aderir em placas de 6 poços por cultura durante 1 a 2 horas a 37 ° C. Remover as células não aderentes por lavagem suave três vezes com PBS quente. </li><li> Subsequentemente, as células de cultura em 900 ul de DMEM isento de soro durante 24 horas na presença das seguintes ligandos de TLR: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0,5 mg / ml); poli (I: C) -TLR3 (10 mg / ml) ; LPS-TLR4 (100 ng / mL); A flagelina-TLR5 (100 ng / ml); FSL1-TLR6 / 2 (100 ng / ml); ssRNA40-TLR7 (1 ug / ml); ODN1826-TLR9 (1 uM). NOTA: Prepare-se para cada ligando uma solução 10x estoque. Adicionar 100 ul desta última em cada poço, realizando assim uma diluição de 10 vezes. </li></ol> 3. Isolamento de ARN <ol><li> Remover todas as células de média e lisam directamente nas placas de seis poços por adição de 1 ml de TRIzol a cada poço e a passagem do ligado de células várias vezes através de uma pipeta. Incubar as amostras homogeneizadas durante 5 a 10 min à temperatura ambiente, para permitir a dissociação completa do complexo de nucleoproteínas. </li><li> Transferir ligado em 1,5 ml RNase- e microtubos livre de DNase. Adicionar 0,2 ml de clorofórmio por cada 1 mL de TRIzol. Agitar tubos vigorosamente à mão durante 15 segundos e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 10 min. Centrifuga-se a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Observe-se a mistura para uma fase de separação vermelho (fenol-clorofórmio) inferior, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor. ARN permanece exclusivamente na fase aquosa. </li><li> Transfer cuidadosamente a fase aquosa superior para um tubo fresco, sem perturbar a interfase. Precipitar o ARN a partir dele por mistura com 0,5 ml de álcool isopropílico. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 min e centrifuga-se a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. O ARN precipitados formando um sedimento branco no lado e no fundo do tubo. </li><li> Remover o sobrenadante. Lava-se a pelete de ARN, uma vez com 1 ml de etanol a 75%. Misturar as amostras com vórtex e centrifugar a 7500 xg durante 5 min a 4 ° C. Resumidamente secar o ARN (secar ao ar durante 10 min). Dissolve-se o ARN em 0,1 mL de DEPC (ARNase isenta de água) e incubar durante 10 min a 55 ° C. </li><li> Quantificar ARN utilizando um espectrofotómetro. Para fazê-lo, amostras diluídas 100 vezes em água com DEPC e lidas a comprimentos de onda de 260 nm. A concentração de RNA será então: OD 260 x 40 ng / ul x fator de diluição. </li><li> Equalizar as concentrações de RNA e síntese de cDNA, conforme as instruções do fabricante e utilizando RT-PCR Sistema de kit de primeiros-Strand cDNA Synthesis. Comoacordo com as instruções do fabricante, medir os níveis de ARNm do gene por PCR em tempo real (45 ciclos) em um sistema de detecção de ADN em tempo real. Normalizar os níveis de expressão gênica com gene dois arrumação por exemplo β-actina e GAPDH. NOTA: A concentração de RNA Normalizar a 500 ug / ml e 0,5 ug utilizar para a síntese de cDNA. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Os macrófagos são cruciais para a sobrevivência e fornecer um alvo tentador para manipular o host para objectivos imunológicos. A descoberta dos TLRs e outras moléculas de reconhecimento têm conduzido os macrófagos para o centro do debate imunológica. Os macrófagos responder a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, moléculas associadas a danos moleculares padrão (20) amortece e moléculas associadas com grupos de patógenos (PAMPs) 21. Estas respostas estímulos diferentes representam o curs...

O sistema reticuloendotelial fagocítico é composto de células em vários tecidos e órgãos, tais como a medula óssea, sangue, fígado e baço. Os macrófagos são amplamente distribuídos ao redor do corpo, onde elas nomeadamente participar inata e adaptativa respostas imunes para controlar infecções e claras. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro, os macrófagos desempenham também um papel importante na cicatrização de feridas e na manutenção da homeostase dos tecidos 1,2. Além disso, os macrófagos não só são importantes para a função imune, mas também participar activamente na homeostase do ferro 3. No corpo, cerca de 80% do ferro está presente na hemoglobina dentro de eritrócitos, que quando senescentes são fagocitadas por macrófagos 4. Diariamente, estes macrófagos reciclar 25 mg de ferro derivados do eritrócito e fornecer o seu transporte para o plasma 5. Além disso, durante a infecção e inflamação, os macrófagos pró-inflamatórias seqüestrar ferro sérico para reduzir availabili ferroty a patógenos, em ambos os níveis sistêmicos e locais 6-8. Assim, os estudos mostraram que os macrófagos e principalmente hepatócitos produzir um péptido antimicrobiano denominado hepcidina que é considerado o principal regulador do metabolismo do ferro 9, 10. A hepcidina é aumentado principalmente por estímulos inflamatórios e é parcialmente responsável pelo seqüestro de ferro em macrófagos em cima inflamação crônica 11-13. Como expressão da hepcidina em macrófagos não é muito bem compreendido, estudamos o possível papel dos receptores Toll-like (TLR) neste regulamento. Os TLRs são encontrados principalmente em macrófagos e desempenham um papel central na sua activação. Além disso, o LPS hepcidina expressão induzida no fígado é dependente de TLR4 13. Portanto, para executar o nosso estudo, foi utilizado um método com base no isolamento de macrófagos peritoneais murinos. Linhas celulares de macrófagos são amplamente utilizados em parafuso prisioneiro de macrófagoss; no entanto, a cultura prolongada pode provocar perda de gene e diminuiu funções imunológicas nestas linhas celulares. Assim, o isolamento de macrófagos da cavidade peritoneal é crucial. A cavidade peritoneal do rato apresenta um local ideal para a colheita macrófagos 13-15. Isolado macrófagos peritoneais de murino são convenientes para diversos estudos em relação à sua função imunológica. No entanto, o número de macrófagos do peritoneu é insuficiente para estudos extensivos e é estimado em cerca de 1 x 10 6 macrófagos por rato. Assim, para aumentar a produção de macrófagos, provocando um agente de estéril tal como tioglicolato foi injectada na cavidade peritoneal anterior à colheita de células. Após a injecção de tioglicolato, o rendimento de macrófagos por rato foi aumentada em 10 vezes. Apesar do aumento na produção de macrófagos, tioglicolato de Brewer médias atos como um irritante que induz uma resposta inflamatória, resultando no recrutamento de macrófagos, que may mas não é necessário afectar a expressão do gene. Assim, um grupo de controlo que consiste em macrófagos não-tratados devem ser incluídos em cada experiência. Nas nossas mãos, hepcidina expressão que é altamente estimulada pela inflamação não foi detectada em tioglicolato não-tratados induziu macrófagos peritoneais. Além disso, estudos têm mostrado que tioglicolato de cerveja recruta numerosos macrófagos, mas não ativá-los 16. Por outro lado, tioglicolato de Brewer eliciada macrófagos mostraram um aumento na enzima lisossómica, mas uma diminuição na morte de microorganismos ingeridos 17. No entanto, a capacidade fagocitária não foi afetado quando comparado com os macrófagos não provocou 16. Uma vez cultivadas em placas, os macrófagos peritoneais se tornar aderente, permitindo assim a sua separação a partir de outro tipo de células isoladas da cavidade peritoneal. Subsequentemente, os macrófagos isolados foram estimulados com diferentes agonistas de TLRs.Por fim, o ARNm foi extraído a partir das células cultivadas e a expressão do gene foi analisada utilizando reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa quantitativo (qRT-PCR).

<table><tbody><tr><td>Camundongos C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, EUA)</td><td>475</td><td></td></tr><tr><td>Tioglicolato</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>19032-500G</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% pentobarbital sódico (Usado para anestesia em camundongos (80 mg/kg, i.p.))</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS), colocada no gelo e servirá para colher macrófagos</td><td>WISENT INC Canada (QC)</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (Suplemento com penicilina, estreptomicina, L-glutamina e soro fetal de bezerro a 10%).</td><td>WISENT INC Canadá (QC)</td><td>350-000-CL</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 e 5 ml</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>309659 <tr><td>placas de 6 poços</td><td>Corning Incorporated (NY, EUA)</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteína bacteriana Pam3CSK4 (0,5 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>TLRL-pm25</td><td></td></tr><tr><td>Poliionosina&ndash; ácido policitidílico (Poli(I:C)) (10 mg/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>TLRL-PIC</td><td></td></tr><tr><td>LPS de Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Flagelina purificada de Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>TLR-FLIC-10</td><td></td></tr><tr><td>Lipoproteína sintética FSL1 (100 ng/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>TLR-FSL</td><td></td></tr><tr><td>ssRNA derivado do ssRNA40 de repetição terminal longa do HIV-1 (1 &mu; g/ml)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>TLR-LRNA-40</td><td></td></tr><tr><td>Tipo B CpG oligonucleotídeo ODN1826 (1 &mu; M)</td><td>InvivoGen (San Diego, EUA)</td><td>11B16-MM</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canadá)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de 20 G e 23 G</td><td>BD USA (NJ)</td><td></td><td></td></tr>305175 <tr><td>Pinça de tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cônicos de 50 ml colocados no gelo</td><td>Sarstedt (Newton, MA, EUA)</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td> <td>R7757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>refrigerada</tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80 anticorpo</td><td>BIO-RAD (CA, EUA)</td><td></td><td></td></tr> MCA497APC <tr><td>Anticorpos CD16 / CD32</td><td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td> <td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro</td> <td>de fluxoContador Coulter Epics Elite, Coulter, (Hialeah, FL,EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Axygen Scietific (CA,EUA)</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific (ON, Canadá)</td><td>UN1888</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>JT Baker (PA, EUA)</td><td>70566</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 75% (em água tratada com DEPC)</td><td>Álcool Comercial (QC, Canadá)</td><td>17394</td><td></td></tr><tr><td>0,01% de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) (deixe repousar durante a noite e autoclave)</td><td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td><td>216.542.8</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Omniscript RT-PCR</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá)</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene 3000</td><td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canadá)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits de PCR QuantiTect SYBR Green I</td><td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canadá)</td><td>204141</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de murino macrófagos peritoniais de cumprir a análise de expressão gênica após toll-like receptors estimulação

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Durante a infecção e inflamação, os monócitos circulantes na corrente sanguínea e deixar migrar para os tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Os macrófagos expressam receptores de superfície semelhantes a Toll (TLRs) que reconhecem padrões moleculares conservadas através da evolução de uma vasta gama de microorganismos. TLRs desempenhar um papel central na activação de macrófagos, que está geralmente associada com a expressão do gene alteração. Os macrófagos são críticas em muitas doenças e surgiram como alvos atractivos para terapia. No seguinte protocolo, que descrevem um procedimento para isolar macrófagos peritoneais de murino, utilizando meio de tioglicolato de Brewer. Este último irá aumentar a migração dos monócitos para o peritoneu, por conseguinte irá aumentar este rendimento de macrófagos por 10 vezes. Vários estudos têm sido realizados utilizando medula óssea, baço ou peritoneal derivada macrófagos. No entanto, os macrófagos peritoneais foram mostrados para ser mais maduro no isolamento e são mais estáveis ​​no seu funcionaldade e fenótipo. Assim, macrófagos isolados a partir da cavidade peritoneal de murino apresentar uma população de células importante que pode servir em diferentes estudos imunológicos e metabólicos. Uma vez isolados, os macrófagos foram estimulados com diferentes ligandos de TLR e, consequentemente, a expressão do gene foi avaliada.

Nós caracterizado pela primeira vez os macrófagos peritoneais murinos isolados por citometria de fluxo. Para isso, utilizou-se 80 / (F4) anticorpos que reconhecem especificamente marcadores única expressas por macrófagos. Esta caracterização é necessária para determinar a percentagem de macrófagos isolados e para os distinguir entre células obtidas durante o processo de isolamento. Tal como mostrado na (figura 1), a percentagem de células que expressam o antigénio F4 / 80 foi consistentemente encontrado...

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar macrófagos peritoneais murinos e realizar análise de expressão gênica após a estimulação de receptores tipo toll. Isso é realizado primeiramente injetando 3,8% do meio thioglicolato de Brewer na cavidade peritoneal do camundongo para aumentar a migração de monócitos para o peritônio e, consequentemente, aumentar o rendimento de macrófagos. Após três dias, o camundongo é eutanasiado e o tampão salino fosfato frio ECCOs é injetado na cavidade peritoneal para colher as células.Após uma massagem suave na cavidade peritoneal, o fluido peritoneal é cuidadosamente aspirado. Em seguida, as células obtidas são cultivadas e os macrófagos peritoneais elicidos são caracterizados por citometria de fluxo. O passo final consiste em estimular esses macrófagos com diferentes ligantes de receptores tipo toll ou TLRs e isolar o RNA das amostras.Por fim, a reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa quantitativa é utilizada para medir a expressão do gene de interesse. O objetivo do seguinte procedimento é isolar macrófagos peritoneais, utilizando o meio de Brewer contendo tioglicolato. Este meio aumentará a migração de monócitos para o peritônio e, consequentemente, aumentará o rendimento de macrófagos.Uma vez isolados, os macrófagos serão estimulados com diferentes ligantes de receptores tipo toll para estudar a regulação molecular da hepcidina como nosso gene de interesse. Para começar, prepare o meio Brewer's Bio Glyco 8% conforme descrito no protocolo do texto, utilizando seringas de um mililitro acopladas a agulhas de 23 graus. Injete um mililitro do meio Brewer's Bio Glyco 8% na cavidade peritoneal de cada camundongo e aguarde três dias.Use uma seringa e agulha novas para cada camundongo após a anestesia e eutanásia dos camundongos conforme descrito no protocolo textual, molhando o abdômen de cada camundongo com etanol a 70%. Faça uma incisão lateral ao longo da linha média inferior do peritônio com uma tesoura. Use uma pinça para puxar para trás a pele abdominal e expor a pele peritoneal transparente.Em seguida, injete cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato ECCOs fria na cavidade peritoneal de cada camundongo usando seringas de cinco mililitros acopladas a agulhas de 20 graus. Realize uma massagem suave na cavidade peritoneal e, então, aspire cuidadosamente o fluido sem perfurar qualquer órgão. Remova a agulha e transfira o fluido peritoneal para tubos cónicos de centrífuga de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue o fluido peritoneal coletado por 10 minutos a 400 vezes G ou 1500 RPM em uma centrífuga refrigerada; as células devem ser mantidas frias durante todo o procedimento. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio RPMI 1640. Usando um hemocitômetro, conte as células e ajuste as amostras para uma densidade celular de 1 milhão de células por mililitro.Caracterize o fenótipo de células isoladas por citometria de fluxo para confirmar o enriquecimento de macrófagos. Utilizando 1 milhão de células por camundongo e anticorpos contra F four 80, que é um antígeno de superfície expresso em macrófagos diretamente. Após o isolamento, adicione 1 milhão de células em cada poço de uma placa de seis.Placa de cultivo. Deixe os macrófagos peritoneais de camundongo aderirem aos poços cultivando-os por uma a duas horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova as células não aderentes lavando suavemente três vezes com solução salina tamponada com fosfato morna.Em seguida, adicione 900 microlitros de DMEM sem soro às células. Prepare soluções estoque 10 x de cada ligante do receptor tipo toll ou TLR conforme listado no protocolo descrito no texto. Em seguida, adicione 100 microlitros das soluções estoque a cada poço, realizando assim uma cultura com diluição dez vezes. As células por 24 horas na presença dos ligantes de TLR. Para realizar o isolamento de RNA, primeiramente remova todo o meio e lise as células diretamente nas placas de seis poços, adicionando um mililitro de reagente triol a cada poço e passando o lisado celular várias vezes através de uma pipeta.Em seguida, incube as amostras homogeneizadas por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos complexos proteicos nucleares. Após a incubação, transfira o lisado para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro RNAs e DNA spree, e adicione 0,2 mililitros de clorofórmio por cada mililitro de reagente triol. Agite os tubos vigorosamente à mão por 15 segundos antes de incubá-los à temperatura ambiente por cinco a 10 minutos.Em seguida, centrifugue a 12.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Observe a separação da mistura em uma fase inferior vermelha de fenol-clorofórmio, uma fase intermédia e uma fase aquosa superior incolor. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um tubo novo sem perturbar a fase intermedial. Precipite o RNA misturando com 0,5 mililitros de álcool isopropílico após incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugue a 12.000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Os precipitados de RNA formam um pellet branco na lateral e no fundo do tubo. Remova o sobrenatante e lave o pellet de RNA uma vez com um mililitro de etanol a 75%. Misture as amostras por vortexagem e, em seguida, centrifugue a 7.500 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a remoção do sobrenadante, seque brevemente o RNA ao ar por 10 minutos. Em seguida, dissolva o RNA em 100 microlitros de água livre de RNase e incube por 10 minutos a 55 graus Celsius. Em seguida, quantifique o RNA utilizando um espectrofotômetro para tanto.Dilua as amostras 100 vezes em água livre de RNA e leia nos comprimentos de onda de 260 nanômetros, iguale as concentrações de RNA e sintetize o DNAc conforme instruções do fabricante. Utilize o sistema R-T-P-C-R para o kit de síntese da primeira fita de DNAc. Em seguida, meça os níveis de mRNA gênico por PCR em tempo real em um sistema de detecção de DNA em tempo real, normalizando os níveis de expressão gênica com dois genes de referência.Os macrófagos peritoneais espelhados isolados foram caracterizados por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de macrófagos isolados e para distingui-los entre as células obtidas durante o processo de isolamento. A porcentagem de células expressando o antígeno F four 80 foi consistentemente encontrada acima de 95%. As células isoladas foram então tratadas com diversos ligantes de TLR e mRNA. Os níveis de hepcidina foram medidos por R-T-P-C-R ao receptor tipo Toll um e dois, receptor tipo Toll quatro.Um receptor olfativo seis e duas ligantes foram capazes de estimular o mRNA da hepcidina em macrófagos peritoneais. Em conjunto, esses resultados demonstram a utilidade deste protocolo para isolar com sucesso macrófagos peritoneais e investigar com precisão a regulação molecular da expressão gênica. Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como isolar, identificar e cultivar macrófagos peritoneais.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A cavidade peritoneal em mamíferos contém diferentes populações de células imunes crucial para a resposta imune inata. Um método eficiente de isolamento é necessário para análises bioquímicas e funcionais dessas células. Aqui nós fornecemos um método abrangente para o isolamento de células na cavidade peritoneal do rato.

Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

Este vídeo demonstra a ativação dos macrófagos peritoneais de um camundongo usando imunoglobulina intravenosa e lipopolissacarídeo bacteriano. A co-estimulação ativa os macrófagos peritoneais em macrófagos anti-inflamatórios que possuem atividade imunorreguladora.

Ativação in vivo de macrófagos peritoneais em resposta a anticorpos em modelo murino

Este vídeo demonstra um procedimento para analisar a eferocitose mediada por macrófagos peritoneais de timócitos apoptóticos de camundongos por microscopia de fluorescência.

Análise da Eferocitose de Timócitos Apoptóticos por Macrófagos Peritoneais

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Drogas baseadas em anticorpos revolucionaram o tratamento de doenças inflamatórias. Além de ter efeito direto sobre a alvos específicos, os anticorpos podem ativar macrófagos tornar-se anti-inflamatórios. Este protocolo descreve como anti-inflamatórios macrófago ativação pode ser avaliada in vitro, usando os macrófagos da medula óssea de rato e in vivo usando os macrófagos peritoneais.

Avaliação dos efeitos de drogas baseados em anticorpo murino da medula óssea e ativação de macrófagos peritoneais

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Demonstramos um protocolo passo a passo para a investigação da função gênica em macrófagos residentes no tecido peritoneal in vivo, usando vetores lentivirais.

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Aprenda a isolar macrófagos peritoneais murinos para análise de expressão gênica após estimulação de receptores Toll-like. Este protocolo utiliza meio de tioglicolato para aumentar o rendimento celular e citometria de fluxo para caracterização.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

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