Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

O objetivo geral do método a seguir é analisar as funções dos mastócitos in vivo usando camundongos knockin de mastócitos. Isso é conseguido primeiro gerando mastócitos cultivados derivados da medula óssea, ou BMC MCs ou enxerto em camundongos deficientes em mastócitos. Na segunda etapa, os MCs BMC são transferidos adotivamente para vários locais anatômicos nos camundongos deficientes em mastócitos para gerar camundongos knockin de mastócitos.

Em última análise, os números e a distribuição anatômica dos mastócitos transferidos adotivamente são avaliados por citometria de fluxo e análise imuno-histoquímica para avaliar até que ponto as populações enxertadas se assemelham às encontradas em camundongos do tipo selvagem. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a avaliação direta das funções do tipo de parede enxertada ou populações de células MA geneticamente modificadas in vivo. Este método, portanto, pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular MA, como até que ponto as células MA ou seus produtos podem contribuir para as características dos modelos de camundongos de processos fisiológicos, imunológicos ou patológicos, incluindo modelos de doenças humanas.

Geralmente, os indivíduos que aprendem esse método podem ter dificuldades porque o enxerto e a deficiência de mastócitos podem variar dependendo do método usado para gerar BM CMCs, a raiz da injeção, o número de BMC MCs injetados e o número de semanas de um peso após o enxerto antes de realizar experimentos in vivo. A demonstração visual desse método é crítica, pois os aspectos do procedimento de enxerto são difíceis de aprender, a menos que se veja exatamente como eles são executados. Para extrair a medula óssea primeiro, use ferramentas de dissecção estéreis para colher o fêmur, a tíbia e a fíbula de camundongos selvagens sem xingar nenhuma epífise óssea.

À medida que cada osso é dissecado, prenda-o com uma pinça e raspe todo o tecido estranho. Em seguida, coloque o osso em PBS no gelo quando todos os ossos tiverem sido coletados, transfira-os para uma capa de cultura de tecidos estéril e, em seguida, um de cada vez, prenda cada osso com uma pinça e corte ambas as epífises para expor as cavidades medulares. Em seguida, usando seringas de três mililitros, equipadas com agulhas de calibre 30 e meio frio de lavagem, toda a medula vermelha de cada osso em uma nova placa de Petri Quando todos os ossos tiverem sido lavados, use a mesma seringa para dissociar os aglomerados de células da medula óssea por aspiração e ejeção repetidas e suaves.

Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Encha o tubo com meio de lavagem a frio e centrifugue as células resus. Suspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de cultura.

Em seguida, transferir as células da medula óssea para um balão de cultura de tecidos de tamanho adequado. Após um a dois dias de cultura, transferir as células não aderentes para um novo frasco, juntamente com 10 mililitros de cultura fresca, média por ratinho, durante as semanas seguintes. Alimentar as células a cada três ou quatro dias é apenas demonstrado.

Transferir as células de não aderência para um novo frasco uma vez por semana até que não restem células de adesão para enxerto intradérmico no pinador de orelha Resus. Suspenda os MCs do BMC em quatro vezes 10 elevado a sete células por mililitro em DMEM frio. Em seguida, aspire as células para uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 e coloque a seringa no gelo.

Em seguida, confirme a profundidade apropriada da anestesia com uma pitada superior de um camundongo receptor com deficiência de mastócitos de quatro a seis semanas e aplique pomada ocular para injetar as células. Use o dedo indicador para expor e esticar a face ventral do pinador da orelha, criando pressão vertical na face dorsal da orelha. Em seguida, administre 1 injeção intradérmica de 25 microlitros de um vezes 10 aos seis MCs do BMC no meio da orelha e uma segunda injeção de 25 microlitros do mesmo em direção à ponta do pinador.

Para intraperitoneal, o enxerto ressuspende os MCs do BMC de uma vez 10 a sete células por mililitro no DMEM frio. Em seguida, use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 25 para injetar duas vezes 10 aos seis CMCs de BM em 200 microlitros de meio na cavidade peritoneal dos receptores deficientes em mastócitos para enxerto intravenoso. Ressuspenda os CMCs BM a 2,5 vezes 10 elevado a sete células por mililitro em DMEM frio e, em seguida, injete cinco vezes 10 aos seis CMs BMC em 200 microlitros de meio através da veia caudal.

Quatro a seis semanas após um enxerto intraperitoneal, use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 para injetar cinco mililitros de PBS frio na cavidade peritoneal do animal receptor. Massageie o abdômen por 20 segundos para colher as células peritoneais. Em seguida, use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 22 para aspirar lentamente a lavagem peritoneal.

A porcentagem de mastócitos e o número total de células no fluido de lavagem peritoneal podem então ser avaliados por citometria de fluxo ou histoquímica. Para avaliar os mastócitos nas janelas mesentéricas, abra a membrana peritoneal para expor o trato intestinal. Organize quatro a cinco janelas mesentéricas por mouse em uma lâmina seguida de uma fixação de uma hora na solução de ruído do carro.

Adicione a temperatura ambiente no final da incubação, seque as lâminas ao ar e remova o intestino. As janelas mesentéricas fixas permanecerão presas às lâminas. Finalmente, corar as preparações por 20 minutos à temperatura ambiente com solução de coloração chaba representa análise citométrica de fluxo e coloração com azul de odo de BM CMCs após 15 e 45 dias de cultura No DMEM, suplementado com IL, três são mostrados BM CMCs cultivados por 45 dias e 95% puros e contêm alto número de grânulos citoplasmáticos.

Portanto, as células dessas culturas são adequadas para experimentos de enxerto, enquanto as células cultivadas por 15 dias não estão nessas imagens. O enxerto bem-sucedido da moeda de um centavo da orelha quatro semanas após o enxerto intradérmico, as janelas mesentéricas do enxerto, a cavidade peritoneal seis semanas após o enxerto intraperitoneal e o pulmão 12 semanas após o enxerto intravenoso são mostrados como esperado. Os mastócitos estão presentes nas amostras de tecido isoladas de camundongos do tipo selvagem, enquanto nenhum mastócito é detectado nos animais deficientes em mastócitos nos camundongos knockin de mastócitos.

No entanto, os MCs BMC transferidos adotivamente aparecem em locais semelhantes aos observados nos animais selvagens. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que o intervalo entre o enxerto e o estudo do experimento varia de acordo com o local da injeção de mastócitos. É muito importante respeitar esses intervalos para permitir tempo suficiente para que as células enxertadas amadureçam e ocupem a localização final vivo.

Essa abordagem forneceu e continua a fornecer informações importantes sobre o que a célula de massa e seu produto podem ou não fazer in vivo. Lembre-se sempre de que trabalhar com animais vivos requer treinamento específico, revisão e aprovação apropriadas de protocolos experimentais e adesão estrita aos mais altos padrões de cuidados com os animais, incluindo cuidados para reduzir a dor e o estresse do animal ao realizar esses procedimentos.