Name: Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando Mast Cell Knock-in Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a analisar funções de mastócitos in vivo usando ratos knock-in. Este método gera células de medula óssea cultivadas e avalia enxertos por citometria de fluxo e imunohistoquímica.

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N.G. é o beneficiário de bolsas da francesa "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" e da Fundação Philipp; A R.S. é apoiada pela Lucile Packard Foundation for Children's Health e pelo prêmio Stanford NIH/NCRR CTSA, número UL1 RR025744; P.S. é apoiado por uma Bolsa Max Kade da Fundação Max Kade e da Academia Austríaca de Ciências e uma Bolsa Schroedinger do Fundo Austríaco de Ciência (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconhece apoio de institutos nacionais de saúde doem U19 AI104209, NS 080062 e do Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco na Universidade da Califórnia; L.L.R. reconhece o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa da Artrite (ANRF) e dos Institutos Nacionais de Saúde doem K99AI110645.

Todos os cuidados e experimentações em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação específica do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford.
1. Geração e Caracterização de Células de Mastros Cultivados Derivados da Medula Óssea (BMCMCs).
Nota: Os BMCMCs doadores devem ser gerados a partir de células de medula óssea do mesmo fundo genético que os camundongos receptores com deficiência de MC. BMCMCs doadores derivados do sexo masculino não são adequados para enxerto de camundongos fêmeas. Os BMCMCs doadores derivados de mulheres terão sucesso em receptores masculinos e femininos.
<ol><li>Extração de medula óssea.<ol>
<li>Despeje a solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) em 6 placas de cultura de poço (1 bem por rato) e coloque no gelo.</li>
		<li>Mergulhe os instrumentos de dissecção em 70% de etanol para esterilização.</li>
		<li>Eutanize camundongos doadores por inalação de dióxido de carbono (CO2), seguido de deslocamento cervical, depois pulverizar os camundongos com 70% de etanol nos locais de manipulação.</li>
		<li>Use instrumentos de dissecção estéreis para extrair os ossos do fêmur, tíbia e fíbula sem cortar nenhuma epífise óssea.</li>
		<li>Ao proteger os ossos com um fórceps, raspe todos os tecidos dos ossos (e descarte fíbulas) usando tesouras estéreis (ou lâminas de bisturi). Coloque ossos em PBS no gelo até que todos os ossos sejam coletados.</li>
		<li>Realize todas as etapas restantes na capa de cultura tecidual estéril. Usando instrumentos estéreis, proteja os ossos com fórceps e corte ambas as epífitas para expor a cavidade medular.</li>
		<li>Usando seringas de 3 ml e agulhas de 30 G, e meio de descarga a frio (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] suplementado com soro de bezerro fetal de 10% [FCS, inativado pelo calor], 2 mM L-glutamina, 1% solução antimicópica antibiótico-antimíctica, 50 μM Β-mercaptoethanol), lave a medula óssea vermelha em uma placa de Petri.</li>
		<li>Use a mesma seringa para dissociar aglomerados de células de medula óssea lavadas por aspiração e ejeção suave repetidas.</li>
		<li>Piscina femoral e medula óssea tibial de cada rato em um tubo centrífuga de 15 ml. Encha o tubo com meio de descarga a frio para lavar as células da medula óssea e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura BMCMCs.<ol>
<li>Remova o supernascer e recupere células de medula óssea pelleted em 10 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com soro de bezerro fetal de 10% [FCS, inativado pelo calor], 2 mM L-glutamina, 1% solução antibiótico-antimicocética, 50 μM Β-mercaptoetanol e 20% meio wehi-3 condicionado celular [como fonte de IL-3; usar alternativamente o rato recombinante IL-3 a 10 ng/ml]).</li>
		<li>Coloque células no frasco de cultura tecidual de tamanho apropriado (por exemplo,T25 para 1 mouse, T75 para 2 ratos, etc.).</li>
		<li>1-2 dias após as células de chapeamento, transfira células médias e suspensas (deixando detritos e células aderentes grudados no fundo do frasco) para um novo frasco e adicione meio de cultura fresco (10 ml/mouse).</li>
		<li>Durante as semanas seguintes, as células de alimentação a cada 3-4 dias (adicione 10 ml de cultura média por rato). Manter a densidade celular entre 2,5 x 105-1 x 106 células/ml. Transfira células não aderentes para um novo frasco uma vez por semana até que nenhuma célula aderente esteja presente no frasco de cultura. Teste a maturidade das células (veja abaixo) antes de usar para ensaios in vitro ou engraftment em camundongos deficientes de MC. NOTA: A completa diferenciação dos BMCMCs levará de 4 a 6 semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da maturidade da BMCMC.<ol>
<li>
Usando citometria de fluxo.
		<ol>
<li>Lave as células (5 x 104-5 x 105 células/condição) com tampão FACS gelado (PBS, 0,5% FCS) em tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirante supernante.</li>
			<li>Diluir anticorpos monoclonais anti-rato CD16/32 (clone 93 ou 2.4G2) anticorpos monoclonais 1:200 (2,5 μg/ml) no buffer FACS. Adicione 10 μl a cada pelota e resuspend por um breve vórtice. Incubar 5 minutos no gelo para bloquear a ligação fc. NOTA: Proteja as amostras contra luz direta para todas as etapas restantes.</li>
			<li>Ficoerythrin diluída (PE) conjugado anti-rato Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) e isocitonato conjugado de fluoresceína (FITC) anti-rato conjugado KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("solução de coloração"), ou os respectivos anticorpos de controle de isótipo rotulados no buffer FACS ("solução de controle de isótipo").</li>
			<li>Divida metade das células bloqueadas da etapa 1.3.1.2) em um tubo inferior redondo de poliestireno adicional e adicione 20 μl de "solução de coloração" em um tubo e 20 μl de "solução de controles de isótipo" no outro tubo. Incubar 30 minutos no gelo.</li>
			<li>Adicione 3 ml de tampão FACS gelado e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota em 300 μl de tampão FACS contendo 1 μg/ml de iodeto de propídio (PI, para identificação de células mortas). Proceder à análise de citometria de fluxo (ver Figura 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando coloração azul toluidina.<ol>
<li>Lave 1 x 105 células uma vez com PBS por centrifugação a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente, depois aspire e resuspend células em 200 μl de PBS.</li>
			<li>Transfira a suspensão celular para um citofunnel preparado ligado a um slide de microscópio e prossiga com cito-centrifugação usando um cytocentrifuge (40 x g por 5 min).</li>
			<li>Slides secos de ar por 10 minutos e desenham um círculo de cera ao redor das células usando uma caneta PAP. Adicione 0,1% solução azul toluidina para cobrir as células. Incubar por 1 min. Lave lâminas em água da torneira por 1 min, depois lâminas secas por 10 minutos.</li>
			<li>Células de deslizamento de cobertura usando meio de montagem. Proceder à análise do microscópio leve (ver Figura 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Engraftment de camundongos deficientes de células de mastro com BMCMCs.
<ol><li>Enxerto de ouvido por injeção intradérmica (i.d.). NOTA: Para a transferência adotiva de BMCMCs para o pináculo de ouvido de camundongos deficientes de MC, recomendamos realizar duas injeções de 1 x 106 células cada (para um total de 2 x 106 células) por pina de ouvido. O enxerto intradérmico de BMCMCs no pináculo auditivo de camundongos deficientes de MC tem sido usado por muitos pesquisadores em vários modelos, incluindo modelos de anafilaxia cutânea passiva (PCA)24,27, defesa hospedeira contra venenos28, e reações de hipersensibilidade crônica (CHS)29,30.<ol>
<li>Contar e resuspend células em 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 30 G. Mantenha no gelo até a injeção.</li>
		<li>Anestesiar camundongos deficientes mc de 4-6 semanas usando isoflurane (2,5% v/v). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do sol, ajuste isoflurane se indicado e continue monitorando a respiração e a resposta de beliscar o dedo durante todo o procedimento. Aplique pomada oftálmica com uma ponta Q para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
		<li>Com o dedo indicador, crie pressão vertical na face dorsal do pináculo auditivo para expor e esticar a face ventral.</li>
		<li>Realize duas injeções de 25 μl de i.d. da solução BMCMC em dois locais diferentes da face ventral do pina da orelha, a primeira injeção no meio da orelha e a segunda injeção em direção à ponta do pina auditivo. Aguarde de 4 a 6 semanas após o enxerto de identidade antes de realizar experimentos in vivo. Nota: Em nossa experiência, nesse momento o número de MCs/mm2 de dermis na parte central do pina ouvido geralmente é semelhante ao da localização correspondente em camundongos do tipo selvagem, enquanto os números de MCs/mm2 na periferia do pináculo auditivo são tipicamente substancialmente inferiores aos dos camundongos do tipo selvagemcorrespondentes 27,28. Isso deve ser mantido em mente ao projetar experimentos com tais camundongos mc-engrafados (por exemplo,agentes com possíveis efeitos na função MC devem ser injetados na parte central do pinnae do ouvido, e a análise dos efeitos desses tratamentos também deve se concentrar nessa área).</li>
	</ol></li>
	<li>Enxerto de cavidade peritoneal por injeção intraperitoneal (i.p.). NOTA: A transferência adotiva de BMCMCs para a cavidade peritoneal de camundongos deficientes de MC exigirá uma injeção de 2 x 106 células por rato. Tais injeções i.p. de BMCMCs em camundongos deficientes de MC têm sido usadas por muitos grupos para estudar os papéis dos MCs peritoneal em vários modelos, incluindo modelos de defesa do hospedeiro contra venenos31 ou sepse bacteriana32,33.<ol>
<li>Conte o número adequado de células e resuspend em 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 25 G. Mantenha no gelo até a injeção.</li>
		<li>Realize 1 injeção de 200 μl de solução de BMCMCs na cavidade peritoneal de camundongos deficientes mc de 4-6 semanas de idade. Aguarde de 4 a 6 semanas após o engraftment i.p. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment por injeção intravenosa (i.v.). NOTA:A transferência adotiva de BMCMCs por injeção i.v. em camundongos deficientes de MC exigirá uma injeção de 5 x 106 células por rato. Injeções intravenosas (i.v.) de BMCMCs em camundongos deficientes de MC têm sido usadas por muitos grupos para estudar os papéis dos MCs em vários modelos de doenças, incluindo modelos de infecção da bexiga34,asma35,fibrose pulmonar36e artrite mediada por anticorpos37.<ol>
<li>Conte o número adequado de células e resuspend em 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 30 G. Mantenha no gelo até a injeção.</li>
		<li>Anestesiar camundongos deficientes mc de 4-6 semanas usando isoflurane (2,5% v/v). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do sol, ajuste isoflurane se indicado e continue monitorando a respiração e a resposta de beliscar o dedo durante todo o procedimento. Aplique pomada oftálmica com uma ponta Q para evitar o ressecamento dos olhos.</li>
		<li>Realize uma injeção de 200 μl de solução BMCMC na veia traseira (ou, alternativamente, a veia retro-orbital) de um rato deficiente de MC. Aguarde 12 semanas após o engraftment i.v. antes de realizar experimentos in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise de camundongos deficientes de células de mastro engrafados.
<ol><li>Análise de enxerto de ouvido.<ol>
<li>No final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical.</li>
		<li>Isole o pináculo da orelha e fixe em formalina tamponada de 10% (vol/vol) durante a noite a 4 °C. Incorpore pinnae de ouvido fixo em parafina, corte 4 μm seções de pináculo de ouvido e monte em lâminas de vidro.</li>
		<li>Manche os slides com uma solução azul toluidina de 0,1% por 1 min a temperatura ambiente. Lave lâminas na água da torneira por 1 min, depois deslizes secos por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem, em seguida, conte o número de MCs engrafados por seções pinnae usando um microscópio de luz. Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem e distribuição de MCs na pele do ouvido de camundongos engrafados versus camundongos do tipo selvagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de enxerto de cavidade peritoneal.<ol>
<li>Avaliação do número de células de mastro na cavidade peritoneal.<ol>
<li>No final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical. Remova cuidadosamente a pele ventral dos camundongos sem quebrar a cavidade peritoneal.</li>
			<li>Injete 5 ml de PBS de temperatura fria ou ambiente na cavidade peritoneal usando uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 25 G. Use PBS frio para reduzir o risco de ativação de células peritoneais (isso é muito importante na avaliação da degranulação peritoneal mc ou níveis de alguns produtos derivados de MC no fluido de lavagem peritoneal). Faça uma massagem no abdômen por 20 segundos para colher células peritoneais.</li>
			<li>Aspire lentamente o lavage peritoneal usando uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 22 G. Registo o volume de lavagem aspirada (espere recuperar até 80% do volume injetado).</li>
			<li>Transfira o fluido de lavage peritoneal em um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirante supernante. Recupere a pelota em PBS frio de 400 μl.</li>
			<li>Conte o número total de células peritoneais usando uma câmara hemótmica. Utilize metade da suspensão celular para uma análise de citometria de fluxo (conforme descrito na etapa 1.3.1), para avaliar a expressão percentual e marcador de MCs engrafados na cavidade peritoneal. Multiplique o número total de células peritoneais pelo percentual de MCs para obter número absoluto de MCs peritoneal.</li>
			<li>Realize uma citocentrifugação com as demais células, conforme descrito na etapa 1.3.2.2. Slides secos de ar por 10 minutos em temperatura ambiente e desenham um círculo de cera ao redor das células usando uma caneta PAP.</li>
			<li>Cubra células com solução de coloração may-grünwald não diluída por 5 minutos, seguida de lavagem em PBS por 5 min, ambas em temperatura ambiente. As células de cobertura com mancha de Giemsa diluídas 1:20 com água deionizada e incubam 20 min em temperatura ambiente. Lave lâminas 2 vezes na água da torneira por 1 min e, em seguida, lâminas secas a ar.</li>
			<li>As células de deslizamento cobrem usando meio de montagem e calculam a porcentagem de MCs engrafados usando um microscópio de luz (contando pelo menos 400 células totais). Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem de MCs na lavagem peritoneal de camundongos engrafados versus camundongos do tipo selvagem.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avaliação de células de mastro nas janelas mesentéricas.<ol>
<li>Seguindo o lavage peritoneal descrito na etapa 3.2.1, abra a membrana peritoneal para expor o trato intestinal dos camundongos. Disponha de 4 a 5 janelas mesentéricas por mouse em um slide.</li>
			<li>Fixar os slides por 1 hora na solução Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol de etanol, clorofórmio e ácido acético glacial) à temperatura ambiente. Lâminas secas a ar e removem o intestino (as janelas mesentéricas fixas permanecerão presas aos slides).</li>
			<li>Manche os preparos por 20 minutos em temperatura ambiente com a solução de coloração csaba (azul alciano/safranin o).<ol>
<li>Para fazer 500 ml de mancha de Csaba, prepare 500 ml de tampão de acetato misturando 100 ml de solução de acetato de sódio de 1 M com 120 ml de 1 M HCl. Faça até 500 ml com água desionizada e ajuste pH para 1,42. Em seguida, dissolver 90 mg Safranin [identifica 'MCs maduros' em vermelho], 1,8 g azul alciano [identifica 'MCs imaturos' em azul] e 2,4 g sulfato de amônio férico NH4Fe(SO4)2 em 500 ml de tampão de acetato.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem, em seguida, conte o número de MCs engrafados por janela mesentric usando um microscópio de luz. Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem e distribuição de MCs nas janelas mesentéricas de camundongos engrafados versus ratos do tipo selvagem.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. análise de engraftment.<ol>
<li>Ao final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical, e colher tecido de interesse(por exemplo, pulmão, pele ou baço) e fixar durante a noite em 10% (vol/vol) formalina tamponada a 4 °C.</li>
		<li>Incorpore tecidos fixos em parafina, corte seções de 4 μm e monte em lâminas de vidro. Manche os slides com uma solução azul toluidina de 0,1% por 1 min a temperatura ambiente. Lave lâminas na água da torneira por 1 min, depois deslizes secos por 10 minutos.</li>
		<li>Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem e avaliação do número e distribuição de MCs engrafados por seções de tecido usando um microscópio leve.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Quase 30 anos após sua descrição inicial38, a abordagem 'mastro célula knock-in' continua a fornecer informações valiosas sobre o que os MCs podem ou não fazer in vivo. As funções dos MCs foram há muito tempo pensadas para se limitar ao seu papel na alergia. Os dados gerados usando a abordagem 'mastro célula knock-in' mudaram essa visão, fornecendo evidências de que os MCs podem, entre outras funções, desempenhar papéis críticos na defesa do hospedeiro contra certos patógenos4,3...

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que surgem de progenitores pluripotentes da medula óssea1-3. Após a egressão da medula óssea, os progenitores de MCs migram para vários tecidos onde se desenvolvem em MCs maduros sob a influência de fatores de crescimento locais1-3. Os MCs residentes em tecidos estão estrategicamente localizados em interfaces de ambiente hospedeiro, como a pele, as vias aéreas e o trato gastrointestinal, onde se comportam como uma primeira linha de defesa contra insultos externos3-6. Os MCs são frequentemente sub-classificados com base em suas características fenotípicas "base" e suas localizações anatômicas. Em camundongos, dois tipos de MCs foram descritos: MCs (CTMCs) e MUCOSal MCs (MMCs)1-3,7,8. Os CTMCs são frequentemente localizados em torno de venules e fibras nervosas próximas, e residem em cavidades sorosais, enquanto os MMCs ocupam locais intraepiteliol no intestino e mucosa respiratória1-3.
Inúmeras metodologias têm sido aplicadas para estudar funções biológicas dos MCs9-13. Muitos grupos se concentraram em abordagens in vitro usando linhas celulares (como as linhas mc humanas HMC114 ou LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs17derivados do sangue periféricos humanos ou M cultivados de medula óssea do rato CS [BMCMCs]18, MCs cultivados derivados da pele fetal [FSCMCs]19 e MCs derivados de células peritoneais [PCMCs]20) ou MCs isolados ex vivo de diferentes sítios anatômicos. Todos esses modelos são amplamente utilizados para estudar detalhes moleculares da biologia mc, como sinalizar caminhos envolvidos na ativação do MC. No entanto, um aspecto importante da biologia dos MCs é que suas características fenotípicas e funcionais (por exemplo,conteúdo de granase de grânulo citoplasmônico ou resposta a diferentes estímulos) podem ser moduladas por localização anatômica e microambiente2,7. Uma vez que a mistura exata de tais fatores que são encontrados in vivo pode ser difícil de reproduzir in vitro,favorecemos o uso de abordagens in vivo para obter insights sobre as funções de MCs9.
Existem várias cepas de camundongos com deficiência genética de MC, como os amplamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Estes camundongos carecem de expressão e/ou atividade do KIT (CD117), o receptor para o principal fator de crescimento do MC fator de células-tronco (SCF)21,22. Como resultado, esses camundongos têm uma deficiência de MC profunda, mas também têm anormalidades fenotípicas adicionais relacionadas às suas mutações dekit c (nos camundongos WBB6F1-Kit W/W-v) ou aos efeitos da grande inversão cromossômica que resulta em expressão reduzida dokit C (no C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mouses)9,10,12,23. Mais recentemente, várias cepas de camundongos comc-kit-deficiência de MC constitutivo independente foram relatadas24-26. Todos esses camundongos e alguns novos tipos adicionais de camundongos deficientes de MC indutíveis foram recentemente revisados em detalhes9,10,13.
Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método chamado "mastro celular knock-in" pode ser usado para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

<table><tbody><tr><td>Solução Antibiótico-Antimicótica a 1%</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Prato</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R Centrífuga</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purificado</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB Seringa</td><td>BD Seringa 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Agulhas</td><td>BD Agulha de Deslizamento de Precisão</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 Agulhas</td><td>Seringa BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 Agulhas</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Azul MAX Jr, Tubo Cônico de Polipropileno de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Meio de Montagem</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation caneta</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td> Soro Bovino Fetal Sigma Aldrich F4135-500ml <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inativado por CalorControle de Isotipo de Rato IgG2b K Conjugado FITC</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) KIT Anti-rato Conjugado (CD117; clone 2B8)</td> <td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Mancha Modificada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Saúde</td> <td>Animal29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 placas de poços</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus BX60 Olympus</td><td></td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Incorporação de Tecido Médio</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugado IgG Controle de Isotipo de Hamster Armênio</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ficoeritrina (PE) Conjugado Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de iodeto de propídio</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse recombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Certificado Safranin-o</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Balões de cultura de tecidos T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue 1% Aqueous</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando as funções das células de mastro em vivo usando 'mast cell knock-in' ratos

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que residem em vários tecidos, e são especialmente abundantes em locais expostos ao ambiente externo, como pele, vias aéreas e trato gastrointestinal. Mais conhecidos por seu papel prejudicial em reações alérgicas dependentes de IgE, os MCs também surgiram como atores importantes na defesa do hospedeiro contra veneno e bactérias invasoras e parasitas. O fenótipo e a função do MC podem ser influenciados por fatores microambientais que podem diferir de acordo com a localização anatômica e/ou com base no tipo ou estágio de desenvolvimento das respostas imunes. Por essa razão, nós e outros temos favorecido abordagens in vivo sobre métodos in vitro para obter insights sobre funções mc. Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos geneticamente deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método, chamado de abordagem de"knock-in" de células de mastro, tem sido amplamente utilizado nos últimos 30 anos para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Uma visão geral da abordagem 'mastro célula knock-in' é mostrada na Figura 1, e inclui a geração de BMCMCs, o número de células que devem ser engrafadas i.p., i.d. ou i.v. em camundongos deficientes de MC (o número pode ser variado se indicado com base no design experimental) e o intervalo entre engraftment e experimento dependendo do local da injeção (este intervalo também pode variar, se indicado; por exemplo,o conteúdo dos mediadores armazenados em grânulos citoplasmológicos MC aumen...

Descrevemos um método para a geração de células de mastro derivadas in vitro, seu enenxerto em camundongos deficientes de células de mastro, e a análise do fenótipo, números e distribuição de células de mastro engrafadas em diferentes sítios anatômicos. Este protocolo pode ser usado para avaliar as funções das células de mastro in vivo.

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

O objetivo geral do método a seguir é analisar as funções dos mastócitos in vivo utilizando camundongos knockin para mastócitos. Isso é conseguido primeiramente gerando mastócitos cultivados derivados de medula óssea, ou MCs derivados de BMC, para enxerto em camundongos deficientes em mastócitos. Na segunda etapa, os MCs derivados de BMC são transferidos adotivamente para diversos sítios anatômicos nos camundongos deficientes em mastócitos, gerando assim camundongos knockin para mastócitos.Por fim, os números e a distribuição anatômica dos mastócitos transferidos adotivamente são avaliados por citometria de fluxo e análise imuno-histoquímica para determinar até que ponto as populações enxertadas se assemelham às encontradas em camundongos tipo selvagem. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a avaliação direta das funções das populações de células MA tipo selvagem ou geneticamente modificadas enxertadas in vivo. Este método pode, portanto, ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia das células MA, como, por exemplo, até que ponto as células MA ou seus produtos podem contribuir para características de modelos em camundongos de processos fisiológicos,

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui descrito é uma técnica na qual lipopolissacárido é injectado na glândula mamaria de rato lactante através do bocal para simular a mastite, uma condição geralmente causada por infecção bacteriana. Resultados lipopolissacarídeos injeção em maior fator nuclear kappa B (NF-kB) de sinalização, visualizado através de imagem de bioluminescência de um rato repórter NF-kB luciferase.

Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para determinar a atividade de degranulação dos mastócitos. A enzima liberada pelos mastócitos hidrolisa o substrato e produz um produto colorido. A atividade de degranulação dos mastócitos foi medida como a porcentagem de liberação de enzimas fora da célula normalizada com o conteúdo total de enzimas na célula.

Ensaio de degranulação de mastócitos para estudar o efeito de um produto químico alvo

Este vídeo demonstra um método de lavagem peritoneal para isolar mastócitos maduros do tipo tecido conjuntivo da cavidade peritoneal de camundongos adultos. Ao isolar uma mistura de células imunes primárias da cavidade peritoneal, a proliferação seletiva de mastócitos é realizada em condições de cultura apropriadas.

Uma técnica para isolar mastócitos primários de uma cavidade peritoneal murina

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação na vivo da ativação de células (células T) de T CD4 naïve, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pela medula óssea de GM-CSF (BM)-derivado de células dendríticas (DCs). Além disso, este protocolo descreve isolamento BM e células T, geração de DC e DC e células T transferência adotiva.

Um modelo de rato In Vivo para ativação de células T Naïve CD4 medida, proliferação e diferenciação de células Th1 induzida pelas células dendríticas derivadas de medula óssea

Este artigo descreve o procedimento para a preparação de uma versão marcada com fluorescência do bacteriófago lambda, infecção...

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

Aprenda a analisar funções de mastócitos in vivo usando ratos knock-in. Este método gera células de medula óssea cultivadas e avalia enxertos por citometria de fluxo e imunohistoquímica.

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

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