Name: Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Aprenda o ensaio COMET para medir estresse oxidativo sistêmico indiretamente usando leucócitos de sangue humano. Este método simples e de baixo custo quantifica quebras de DNA por microscopia de fluorescência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a LHW Stiftung, em Triesen, Liechtenstein, pelo apoio financeiro a nossa pesquisa sobre o estresse oxidativo.

Estudos sobre ensaio do cometa realizadas na Universidade de Basel, Departamento de Oftalmologia foram aprovados pelo Comitê de Ética local Basel 1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Prepare a solução pela adição de PBS (1 L de pacotes) e 990 ml de dH2O para a mídia fosfato salino tamponado de Dulbecco (PBS) (livre de Ca ++, Mg ++). Ajustar o pH para 7,4. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Preparar solução de lise: Para preparar 1000 ml de adicionar 2,5 M de NaCl (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) e 10 mM de base de Trizma (1,2 g) em dH2O </li><li> Preparar tampão de electroforese (NaOH a 300 mM / EDTA 1 mM), adicionando 30 mL de NaOH 10 M e 7,5 ml de 0,2 M de EDTA, qs para 1500 ml de dH2O e misturar bem. O volume total depende da capacidade de caixa de gel. Antes da utilização, medir o pH do tampão para garantir um pH&gt; 13. </li><li> Preparar tampão de neutralização de Tris contendo 0,4 M (48,5 g adicionado a ~ 800 mL de dH2O, ajustar o pH a 7,5), concentrou-se (&amp; #62; 10 M HCl) em 1000 ml com dH 2 O. Guardar a solução à TA. </li><li> Prepare a solução de coloração. Para o brometo de etídio (EtBr; 10x da, 20 ug / ml) adicionam-se 10 mg de EtBr em 50 ml dH2O e armazenamento à temperatura ambiente. Para 1x Ações - misturar 1 ml com 9 ml dH 2 O. CAUTELOSOS! Lidar com EtBr com precaução adequada, pois é um conhecido agente cancerígeno. </li></ol> 2. Isolamento de Leucócitos <ol><li> Obtenção de amostras de sangue humano (20 ml) com anti-coagulante, tal como a heparina por punção venosa. </li><li> Separa-se os linfócitos utilizando um separador de células por gradiente de densidade, tais como Histopaque. <ol><li> Resumidamente, o sangue diluído em proporção 1: 1 com PBS ou meio RPMI (sem FBS) e camada de mais de 600 ul líquido separador de células. </li><li> Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar o revestimento &quot;buffy&quot; em 3-5 mL de PBS / RPMI e centrifugado a 300 xg durante 10 min para sedimentar os linfócitos. </li><li> Recuperar linfócitos de apenas acima fronteira entre PBS (RPMI) E líquido separador de células, usando uma pipeta. Retirar as bandas de leucócitos a partir da interface entre o plasma e os separadores de célula camadas líquidas de cada tubo e recolher em um tubo de 50 ml. </li></ol></li><li> Levar o volume total a 50 ml com Meio Eagle Modificado de Dulbecco frio (DMEM). Lava-se a suspensão de células três vezes com DMEM a 300 xg durante 10 min. </li><li> Contar o número total de células utilizando um hemocitómetro. Suspender as células em PBS e alíquota em tubos de microcentrífuga a 10 7 células / tubo. </li><li> Pipetar 0,4 ml de células em 5 ml de um tubo de plástico descartável. Adicionar 1,2 ml de 1% de agarose-gelificante de baixa temperatura a 40 ° C. Misture e rapidamente e pipetar 1,2 ml de suspensão de células sobre a superfície coberta de agarose de uma lâmina pré-revestidos. Evitar a produção de bolhas. </li><li> Permitir que o gel de agarose a durante cerca de 2 min. Seja consistente com o tempo e temperatura utilizadas para a gelificação, e garantir que agarose está totalmente definido antes de submergir em solução de lise. Depois de totalmente set, mergulhe em solução de lise em ~ 4 ºC. </li></ol> 3. A lise e electroforese NOTA: O procedimento descrito é para a electroforese em condições de pH&gt; 13 alcalino. <ol><li> Depois de pelo menos 2 horas a ~ 4 ° C, remover suavemente slides da Solução de Lise. Colocar as lâminas lado a lado na caixa de gel na horizontal perto de uma extremidade, deslizando-los tão próximos quanto possível. </li><li> Encha os reservatórios de buffer com pH&gt; 13 eletroforese recentemente feito até que o nível do líquido cobre completamente os slides (evitar bolhas sobre a agarose). </li><li> Deixe lâminas sentar-se no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-lábil. </li><li> Ligue a fonte de alimentação de 25 volts (~ 0,75 V / cm) e ajustar a corrente de 300 miliamperes, aumentando ou diminuindo o nível de buffer. Electroforese as lâminas durante 30 min. </li><li> Desligue a energia. Levante cuidadosamente os slides do buffer e prendas em uma bandeja de drenagem. Deixe cair casaco sábio as lâminas com neutralização Buffer. Permitir que os slides para descansar por pelo menos 5 min. Escorra lâminas e repetir mais duas vezes. </li><li> Manchar as lâminas com 80 ul 1x brometo de etídio (EtBr) e deixe por 5 minutos e em seguida, mergulhar em água destilada gelada para remover o excesso mancha. Em seguida, coloque uma lamela sobre a lâmina e armazená-los imediatamente. Loja desliza por um mês à temperatura ambiente em condições secas. NOTA: Outras manchas de ADN (por exemplo, SYBR verde) podem também ser utilizados. Cuidado! usar luvas de proteção como a maioria dos corantes são mutagênicos. </li></ol> 4. Quantificação de quebras de DNA <ol><li> Para visualizar o dano ao DNA, observar o slide DNA EtBr manchada sob um microscópio de fluorescência 40X objetiva. </li><li> Avaliar quantitativamente danos no ADN nas células, medindo o comprimento da migração de DNA e a percentagem de ADN migrou (Figura 1A). Quantificar o dano ao DNA (Figura 1B) pelo momento Cauda e Olive-moment. Definições de Cauda-Moment e Olive -Moment tenham sido previamente dada 8-10. NOTA: Em nossa experiência, é o suficiente para ficar por um dos parâmetros. As células são fotografados, definindo a ferramenta automatizada que varre sobre as células de slides e fotografias microscópio. Quantificação de quebras de ADN pode ser feito por pacotes de software de análise de imagem. Existem vários pacotes de software diferentes que são feitos para capturar a imagem das células e quantificação dos danos de ADN. Recomendamos usar o mesmo pacote de software durante todo o experimento. O técnico de laboratório identifica a célula ou cometa intacta para ser marcado no computador e clica com o mouse sobre ele. A célula cometa ou intacto é, então, marcou automaticamente. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
<li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair%3A+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li>
<li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li>
<li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
<li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li>
<li>Gaivão, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+comet+assay%3A+insights%2C+uses%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304(2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
<li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li>
<li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li>
<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

Cientistas suecos Ostling e Johanson foram os primeiros em seu campo para usar ensaio cometa para quantificar o dano ao DNA em células de um. As condições neutras que os dois cientistas utilizado, no entanto, apenas foi possível a detecção de quebras de cadeia dupla de ADN. Singh et al., Depois adaptado o ensaio para o uso sob condições alcalinas, o que produziu uma versão sensível que poderia avaliar quebras duplas e ADN de cadeia simples e detectar sítios lábeis alcalino-12. Uma vez que o seu desenvolvimento inicial, o teste foi modificado em vários passos para torná-lo adequado para avaliar os tipos de danos no DNA em diferentes tipos de células 13-15. Tal como acontece com todas as técnicas, prestando atenção rigorosa aos detalhes técnicos é importante para obter resultados precisos 16. Com base em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos se cada passo da preparação metodológica solução para cometa quantificação-é realizada por especialista tecnol laboratórioicians. O uso de fresco e preparado corretamente mídia, técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e (como mencionado anteriormente na seção de resultados) o uso de leucócitos preparados na hora são essenciais para que a lise e eletroforese em gel para obter resultados precisos 17. Todas as etapas individuais neste ensaio são igualmente importantes para a obtenção de resultados confiáveis. Em 16 melhores resultados gerais são obtidos se cada passo metodológico de preparação da solução até cometa quantificação é realizada por especialista technicians.Important laboratório parecem a utilização de meios frescos e preparados corretamente , técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e como já foi referido na seção de resultados do uso de leucócitos preparados na hora para lise e electroforese em gel para obter resultados adequados a partir do ensaio 17. Como fazer outras metodologias, a técnica de ensaio do cometa tem sua advantages e desvantagens. Sendo um método sensível, o ensaio é vulnerável a factores (por exemplo, luz UV), que poderia aumentar quebras de DNA e, assim, afetar os resultados. Qualquer fator que pode aumentar o estresse oxidativo, exceto o que está sendo pesquisado, deve ser evitado. Factores de stress pode aumentar o nível de estresse oxidativo, não só em leucócitos, mas também em todos os outros meios e linfócitos sanguíneos. Como mencionado anteriormente, existem muitas maneiras diferentes e mais diretos de medição de estresse oxidativo 18,19. O ensaio do cometa é um dos muitos métodos que tem certas vantagens. Estes incluem o seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células necessárias (&lt;10.000 células) e, portanto, as pequenas amostras de sangue necessários por paciente, o período relativamente curto de tempo necessário para quantificar os danos no DNA em células (aproximadamente 3 dias), a sua sensibilidade e sua aplicabilidade generalizada a danos no DNA jumentos em diferentes tipos de células. No passado, nós escolhemos trabalhar com leucócitos desde que teve experiência com estedo tipo de célula e que era aplicável para o estudo particular planeada. Outra vantagem do ensaio de cometa é que ele pode ser utilizado para detectar diferentes tipos e níveis de danos no ADN e, portanto, pode ser aplicada em várias outras áreas para além dos estudos de stress oxidativo, tais como estudos de reparação de ADN, ensaios de complementação ou estudos de genotoxicidade. O stress oxidativo é agora reconhecido como desempenhando um papel crucial na patogénese de várias doenças. O método de ensaio de cometa, enquanto uma das muitas maneiras de medir o stress oxidativo 18,19, é relativamente simples, barata e versátil. Quando dominado, este método pode ser usado em todas as áreas da medicina, em que o stress oxidativo desempenha um papel 8-10,20,21.

Ensaio Cometa foi desenvolvido pela primeira vez por cientistas suecos Ostling e Johanson 1. O DNA é uma molécula carregada negativamente. Durante a eletroforese, fragmentos de DNA menores, danificadas viajar mais rápido em direção a um ânodo positivamente carregado 2. O menor dos fragmentos de ADN, mais rapidamente a sua migração para o ânodo, para formar um &quot;cometa&quot; típica com uma &quot;cabeça&quot; do composto intacto, o ADN intacto e uma &quot;cauda&quot; constituída por fragmentos de ADN danificadas 3. O DNA danificado pode ser reparado por diferentes mecanismos do corpo 4, que mantêm a geração de DNA breaks bastante equilibradas 5. Se, no entanto, o equilíbrio é a favor de quebras no ADN, as quebras podem acumular-se e, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de uma doença. O nosso DNA sofre danos aproximadamente 0.000165% em um determinado momento 6. Quebras de ADN de cadeia simples referem-se a um defeito de um dos dois cordões da dupla hélice de ADNConsiderando quebras de cadeia dupla de ADN são causados ​​quando ambas as cadeias da dupla hélice de ADN são danificados. Existem vários factores que podem aumentar a quantidade de quebras no ADN em um determinado momento, tais como a idade da célula, o fumo do cigarro, várias drogas ou stress oxidativo 7-9. Se todos os fatores que levam a quebras de DNA aprimorados são mantidas constantes, em seguida, a quantificação de quebras de DNA por meio de teste do cometa é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O método de ensaio do cometa é usado cada vez mais hoje em medicina incluindo oftalmologia. Uma razão para isto é que o stress oxidativo é cada vez mais reconhecido como um mecanismo patogénico para várias doenças e 8-11 comet assay é um método com o qual o stress oxidativo pode ser quantificada indirectamente.

<table><tbody><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>EDTA dissódico</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Ca++, Mg++ livre)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td> <td>(S0160)</td><td></td></tr> <tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td> <td>BDH-Merck</td> <td>(89021)</td><td></td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td> <td>(RM 845)</td><td></td></tr> <tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 " > Materiais necessários para eletroforese em gel</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td> <td>HiMedia</td> <td>(RM273)</td><td></td></tr> <tr><td>Baixo ponto de fusão Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Metanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>Blue <td>Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetador e Pontas</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio, Convencional / Micro gel electroforese (MGE)</td><td></td><td></td> slides<td></td></tr></tbody></table>

ensaio cometa como uma medida indireta do systemic estresse oxidativo

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Organismos eucarióticos superiores não podem viver sem oxigênio; No entanto, paradoxalmente, o oxigênio pode ser prejudicial para eles. A molécula de oxigênio é quimicamente inerte relativamente porque tem dois elétrons desemparelhados localizados em diferentes pi * anti-colagem orbitais. Estes dois elétrons têm spins paralelos, o que significa que gira na mesma direção sobre seus próprios eixos. É por isso que a molécula de oxigênio não é muito reativo. A activação de oxigénio pode ocorrer por dois mecanismos diferentes; ou através de redução por meio de um electrão de cada vez (monovalente redução), ou por meio da absorção de energia suficiente para inverter a rotação de um dos electrões desemparelhados. Isto resulta na produção de espécies oxidativas reactivas (ROS). Há um certo número de maneiras pelas quais o corpo humano elimina ROS no seu estado fisiológico. Se a produção de ROS excede a capacidade de reparação, os resultados de estresse oxidativo e danos moléculas diferentes. Existem muitos métodos diferentes pelos quais o estresse oxidativo pode estar measured. Este manuscrito incide sobre um dos chamados métodos de electroforese em gel de célula, também conhecido como &quot;comet assay&quot;, que permite a medição das quebras de ADN. Se todos os factores conhecidos por causarem danos no ADN, à excepção de stress oxidativo são mantidas constantes, a quantidade de danos no ADN medida pelo ensaio do cometa é um bom parâmetro de estresse oxidativo. O princípio é simples e baseia-se no facto de que as moléculas de DNA são carregadas negativamente. Uma molécula de DNA intacto tem um tamanho tão grande que não migrar durante a electroforese. Quebras de ADN, no entanto, se estiverem presentes resultado em fragmentos mais pequenos, que se movem no campo eléctrico em direcção ao ânodo. Fragmentos menores migram mais rapidamente. À medida que os fragmentos têm diferentes tamanhos do resultado final da electroforese não é uma linha distinta, mas sim um contínuo com a forma de um cometa. O sistema permite uma quantificação do &quot;cometa&quot; resultante e, portanto, das quebras de ADN na célula.

Embora o método de teste do cometa torna reprodutibilidade dos resultados, que podem ser influenciadas por uma série de factores. Um desses factores é se ou não os leucócitos são criopreservadas antes da lise e electroforese em gel ou se este passo for realizado em leucócitos recentemente preparadas. A Figura 2 mostra que, no Grupo 2, em que os leucócitos foram criopreservados antes de ADN de lise e electroforese em gel de SS- breaks foram significativamente maiores do que no Grupo 1, onde lise e gel -electrophoresis foi feito em células preparados na hora. O ensaio também pode ser utilizado para avaliar indirectamente estresse oxidativo sistémica. A Tabela 1 mostra a estatística descritiva para Cauda momento e momento de azeitona em fumantes e indivíduos saudáveis. Os dados revelam que fumar meio maço de cigarros por dia mais do que duplica breaks ssDNA nos leucócitos circulantes 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="A Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) representa o microscópio utilizado durante a análise comet assay. (B) Δ descreve um &quot;cometa&quot; típico com uma cabeça e cauda (danificado fragmentos de DNA menores) brilhante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. quebras de ADNcs foram significativamente mais elevados quando os leucócitos foram criopreservados (Grupo 2) do que quando os leucócitos preparadas de fresco foram usadas antes da lise e electroforese em gel. <imgalt = &quot;Tabela 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabela 1. Os fumantes tinham mais do dobro do número de ssDNA quebra em relação à idade e sexo correspondentes saudáveis ​​não-fumantes.

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar o ensaio COMET para a medição indireta do estresse oxidativo. Isso é realizado primeiramente isolando leucócitos de amostras de sangue humano. O segundo passo consiste em misturar as células com agarose de baixo ponto de fusão e imobilizar as células em lâminas.Em seguida, as células são lisadas por duas horas, seguido por eletroforese após coloração das lâminas com brometo de etídio. O DNA é visualizado por microscopia de fluorescência. Em última análise, as quebras de DNA são quantificadas por meio de análise de software dos dados de microscopia de fluorescência.Hoje sabemos que o estresse oxidativo desempenha um papel crucial na patogênese de diversas doenças, incluindo, é claro, doenças oculares. Existem muitas maneiras diferentes de medir o estresse oxidativo. Uma forma de medi-lo indiretamente é por meio do ensaio cometa.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que se trata de uma abordagem simples, de baixo custo e confiável, com a qual podemos medir indiretamente o estresse oxidativo. Os leucócitos Lucas para este experimento serão isolados de amostras de sangue humano obtidas com anticoagulante por punção venosa para separar os linfócitos; primeiramente, dilua o sangue em uma proporção de um para um com PBS. Em seguida, sobreponha 600 microlitros de um líquido separador de células por gradiente de densidade, como o histo pack, e centrifugue a 1.800 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius.Aspire o coquetel leucocitário e transfira para três a cinco mililitros de PBS. Centrifugue a 300 ×g por 10 minutos. Para coletar os linfócitos utilizando uma pipeta, recupere os linfócitos logo acima da interface entre o PBS e o líquido separador celular. Remova as camadas de leucócitos da interface entre o plasma e as camadas líquidas separadoras de células de cada tubo e reúna em um único tubo de 50 mililitros.Complete o volume total até 50 mililitros com PBS frio. Lave a suspensão celular três vezes com PBS a 300 G por 10 minutos. Após a terceira lavagem, conte o número total de células utilizando um hemocitômetro.Suspenda as células em PBS e Eloqua em tubos de microcentrífuga a 10 milhões de células por tubo de pipeta. Adicione 0,4 mililitros de células em um tubo plástico descartável de 1,5 mililitro. Adicione 50 microlitros de suspensão celular em 500 microlitros de uma solução a 1% de baixa temperatura de gelificação.Coloque o agarose a 40 graus Celsius, prepare a mistura previamente e pipete rapidamente 50 microlitros da suspensão celular sobre a superfície coberta com agarose de uma lâmina pré-revestida. Deixe o agarose gelificar por cerca de dois minutos a quatro graus Celsius. Seja consistente com o tempo e a temperatura utilizados para a gelificação e certifique-se de que o agarose esteja completamente solidificado antes de prosseguir para o procedimento de lise.Uma vez que o agros esteja completamente solidificado, mergulhe as lâminas em uma solução lisante a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas. Em seguida, remova cuidadosamente as lâminas da solução lisante. Posicione as lâminas lado a lado sobre uma caixa de eletroforese horizontal próxima a uma das extremidades, deslizando-as o mais próximo possível uma da outra.Encha os reservatórios de tampão com tampão recém-preparado para eletroforese, com pH superior a 13. Observe que o procedimento demonstrado aqui é para eletroforese. Em condições alcalinas com pH superior a 13, encha os reservatórios de tampão até que o nível do líquido cubra completamente as lâminas.Evite bolhas sobre os aros. Deixe a lâmina em repouso no tampão alcalino por 20 minutos para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão de danos alcalinos no DNA. Após 20 minutos, ligue a fonte de alimentação em 25 volts e ajuste a corrente para 300 miliamperes, elevando ou abaixando o nível do tampão.Realize a eletroforese nos lâminas por 30 minutos. Após 30 minutos, desligue a energia. Levante cuidadosamente os lâminas do tampão e coloque-os sobre uma bandeja de drenagem, aplicando gota a gota um tampão de neutralização sobre os lâminas.Deixe as lâminas repousarem por pelo menos cinco minutos. Drene as lâminas e repita o revestimento com tampão de neutralização mais duas vezes. Em seguida, cora as lâminas com um mililitro de brometo de etídio a um x durante cinco minutos.Use luvas de proteção porque o brometo de ahy é um carcinogênio conhecido. Após cinco minutos, mergulhe as lâminas em água destilada gelada para remover qualquer corante em excesso. Em seguida, coloque uma lamínula sobre cada lâmina.Armazene as lâminas imediatamente. Lâminas coradas podem ser armazenadas por um mês a quatro graus Celsius em condições secas. Para visualizar e avaliar o dano ao DNA, observe a lâmina de DNA corada com brometo de etídio em um microscópio fluorescente com objetiva de 40 x.Configure a ferramenta automatizada que varre o microscópio, a lâmina e fotografa as células no ensaio do cometa. Os danos ao DNA foram avaliados quantitativamente nas células mediante a medição do comprimento da migração do DNA e da porcentagem de DNA migrado. A seta preta indica um cometa típico com uma cabeça brilhante e uma cauda.A cabeça é composta por DNA intacto e não danificado, e o cauda é composta por fragmentos menores de DNA danificado. Embora o ensaio de COMETA produza resultados reprodutíveis, ele pode ser influenciado por diversos fatores, como o fato de o ensaio ser realizado em leucócitos recém-preparados. Neste gráfico, o momento da cauda é definido como o produto do comprimento da cauda e da fração da cauda.A porcentagem de DNA nas leucócitos do grupo dois que foram criopreservados antes da lise e eletroforese apresenta quebras significativamente maiores no DNA de fita simples do que os leucócitos do grupo um recém-preparados. Este ensaio também pode ser usado para avaliar indiretamente o estresse oxidativo sistêmico. Aqui, o momento de azeitona representa o produto da porcentagem de DNA total na cauda e a distância entre os centros de massa das regiões da cabeça e da cauda.Resultados de fumantes e indivíduos saudáveis pareados por idade e sexo revelam que fumar meio maço de cigarros diariamente mais que duplica o número de quebras de DNA de fita simples nos leucócitos circulantes. Uma vez dominada, esta técnica apresenta diversas vantagens, incluindo seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células — e, portanto, a pequena amostra de sangue necessária por paciente —, bem como o período relativamente curto necessário para quantificar os danos ao DNA nas células.

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Este vídeo demonstra o ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas.

Ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico para avaliar o estresse oxidativo no soro humano

O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

O ensaio de cometa alcalino mede quebras de fita de DNA em células eucarióticas. Ao adicionar uma etapa de digestão de endonuclease III ou 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilase humana, o ensaio pode detectar com eficiência danos oxidativos ao DNA. Descrevemos métodos para usar esses ensaios para detectar danos ao DNA no fígado de ratos.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Este protocolo descreve um método eficaz para quantificar a diferença no dano ao DNA induzido por inibidores do tipo I e tipo II em células mutantes FLT3 por meio da aplicação do ensaio cometa.

Ensaio cometa para quantificar danos ao DNA em células 32D que expressam mutantes FLT3 após exposição a inibidores de FLT3 tipo I e tipo II

A proteína de ligação ao DNA de células famintas (SAD) desempenha um papel crucial no combate ao stress bacteriana. Este artigo discute a purificação...

A aplicação de um<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Proteção ao Visualize Propriedades Mediação stress do Dps Protein

Aprenda o ensaio COMET para medir estresse oxidativo sistêmico indiretamente usando leucócitos de sangue humano. Este método simples e de baixo custo quantifica quebras de DNA por microscopia de fluorescência.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Explorar mais vídeos